定向胞内释放NO的半乳糖缀合物及其对HeLa细胞的抑制作用

目的研究糖基化NO供体-二醇二氮烯翁(d iazen ium-d iolate,NONOate)与β-半乳糖(β-galactose)的缀合物β-Gal-NONOate(β-galactosyl-d iazen iumd iolate)在肿瘤细胞中的NO释放及其对癌细胞的抑制效应。方法采用阳离子脂质体介导法,将真核表达载体pcDNA3-LacZ转染到HeLa细胞中;经G418(neomyc in)筛选,以邻-硝基苯-β-D-半乳糖苷(or-tho-n itrophenyl-beta-D-galactopyranoside,ONPG)法进行β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)活性检测,获得稳定表达β-半乳糖苷酶的HeLa细胞株;通过G riess方法比较β-Gal-NONOate与NONOate在HeLa/LacZ+细胞和HeLa细胞中NO的释放量,根据细胞克隆形成率、细胞计数和MTT法比较β-Gal-NONOate与NONOate对细胞的作用。结果β-Gal-NONOate在HeLa/LacZ+细胞中NO的释放量和细胞毒性明显高于NONOate(P<0.05),而在未转染LacZ基因的HeLa细胞中比较稳定(P>0.05)。结论β-Gal-NONOate是一个成功的定向胞内释放的NO供体,可作为研究中的新型探针,并可能在抗肿瘤治疗中发挥作用。     

复制缺陷重组腺病毒有效转染兔心包组织的实验研究

目的观察腺病毒载体转染兔心包组织的有效性和外源性基因表达的时相性。方法用第五代腺病毒粘粒(Adv5-CAG)为对照组或含β-半乳糖苷酶基因的第五代腺病毒质粒(Adv5-CAG／LacZ)为实验组转染兔心包组织，转染后第3、7、14、28d取被转染组织行β-半乳糖苷酶(X-gal)染色及β-半乳糖苷酶活性检测。结果X-gal染色显示实验组转染后第3、7、14、28d注射部位心包组织均见蓝染，尤以第7d最明显，而对照组心包组织均无蓝染；β-半乳糖苷酶活性检查示实验组转染后第3d心包组织中即有β-半乳糖苷酶表达，7、14d达高峰，28d表达量明显减少。结论重组腺病毒载体可有效地转染兔心包组织，外源性基因在兔心包组织中能够表达并能维持1个月左右。     

三联组氨酸核苷酸结合蛋白2启动子报告基因质粒的构建和活性鉴定

目的 三联组氨酸核苷酸结合蛋白2(Hint2,histidine triad nucleotide binding protein 2)在肝癌组织中低表达并与临床病理分期和病人预后密切相关,为研究Hint2的基因表达调控,构建人Hint2启动子荧光素酶报告基因质粒并鉴定活性.方法 提取人基因组DNA,以其为模板,将含有Hint2启动子的不同长度的片段插入荧光素酶质粒pGL3-basic,后与β-半乳糖苷酶共转染HeLa细胞,转染后24h通过β-半乳糖苷酶实验检测转染效率,通过荧光素酶实验检测转录活性.结果 质粒pGL3-h1(-6--463,457bp),pGL3-h2(-6--1255,1249bp)构建成功后,与 β-半乳糖苷酶共转染人子宫颈癌HeLa细胞.转录活性=荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值,结果 显示pGL3-basic荧光素酶值/β-半乳糖苷酶值为147.3272,而pGL3-h1为67936,pGL3-h2为64234.19.空质粒与pGL3-h1,pGL3-h2之间差异具有统计学意义,而pGL3-h1,pGL3-h2之间差异不具有统计学意义.结论 Hint2位于转录起始位点上游-6至--463之间的启动子区域具有强转录活性.     

藻红蛋白诱导人乳腺癌MCF-7细胞衰老研究

目的:研究藻红蛋白对人乳腺癌MCF-7细胞的诱导衰老作用。方法:采用MTT法检测藻红蛋白对MCF-7细胞的生长抑制作用,采用倒置显微镜观察形态学变化,酸性β-半乳糖苷酶染色法和衰老相关异染色质聚集检测藻红蛋白诱导人乳腺癌MCF-7细胞衰老作用。结果:MTT法结果显示,藻红蛋白对体外培养的人乳腺癌细胞MCF-7具有明显的生长抑制作用,IC50为134.87μg/mL。结果发现藻红蛋白作用72h后,细胞呈现变大变扁平,细胞内形成空泡、颗粒增多等明显衰老形态。在倒置显微镜下观察,酸性β-半乳糖苷酶染色呈阳性;在荧光显微镜下观察,DAPI染色出现衰老相关异染色质聚集现象。结论:藻红蛋白可通过诱导MCF-7细胞衰老达到抗肿瘤作用。     

银杏叶提取物EGB761对D-半乳糖诱导的心肌细胞老化的保护作用

目的：探讨银杏叶提取物EGB761对D-半乳糖诱导的心肌细胞老化的影响及其可能机制。方法：用5 g/L D-半乳糖处理培养心肌细胞建立衰老模型,并以不同浓度EGB761（5、10、20μg/mL）分别干预48 h。以β-半乳糖苷酶染色判断细胞衰老,ELISA法检测心肌细胞晚期糖基化终产物（advanced glycation end products,AGEs）的含量。显微镜下观察心肌细胞的形态和搏动情况。结果：与正常对照组相比,D-半乳糖诱导的心肌细胞内β-半乳糖苷酶染色阳性率显著提高（75.6%±4.9%vs 17.2%±2.9%,P〈0.01）;细胞内AGEs含量明显增高[（703±32）vs（93±26）pg/mL,P〈0.01];同时出现细胞形态学和搏动的异常。与D-半乳糖组比较,不同浓度（5、10、20μg/mL）EGB761干预组β-半乳糖苷酶染色阳性率显著下降（各组分别为57.7%±7.9%、49.7%±9.2%、34.0%±6.6%,P〈0.01）,同时AGEs含量显著降低[分别为（404±33）、（357±25）、（249±77）pg/mL,P〈0.01],心肌细胞的搏动明显增加。结论：EGB761可通过抑制心肌细胞的非酶糖基化,预防D-半乳糖诱导的心肌细胞老化。     

固定化重组β-半乳糖苷酶对HIV抗体的变构分子传感

在固定化大肠杆菌β-半乳糖苷酶的变构反应的基础上，论证了定性及半定量测定HIV抗体的可行性。在先前的研究中已证实该重组酶的适用性与匀相测定法的条件。本研究确定了在活化的琼脂糖载体上固定化重组大肠杆菌β-半乳糖苷酶的操作条件，根据此方法制备了这种固相化酶，并研究了其性质，以测定在有HIV抗体存在时固定化酶的活化程度。     

人皮肤成纤维细胞系的鉴定及老化检测

目的探索和建立人皮肤成纤维细胞体外分离、培养及鉴定的方法。方法以包皮组织为材料,采用胶原酶消化,分离、培养细胞,倒置显微镜观察,同时进行免疫细胞化学鉴定和β-半乳糖苷酶染色。结果分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖。波形蛋白免疫细胞化学染色95%以上为阳性。随成纤维细胞的连续传代培养β-半乳糖苷酶表达呈递增趋势。结论该方法在体外可以获得高纯度的成纤维细胞。     

山茱萸活性成分对D-半乳糖致衰星形胶质细胞影响的实验研究

目的研究山茱萸活性成分马钱苷、莫诺苷对D-半乳糖致衰大鼠星形胶质细胞的保护作用。方法常规方法体外培养乳大鼠大脑皮层星形胶质细胞,采用免疫荧光方法进行星形胶质细胞鉴定;MTT法对比不同浓度D-半乳糖对星形胶质细胞的增殖抑制作用,以及马钱苷、莫诺苷对D-半乳糖致衰星形胶质细胞活力的影响;以超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)为观察指标,观察马钱苷、莫诺苷对D-半乳糖致衰星形胶质细胞的影响;ELISA法检测胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)含量变化;Western blot法检测Bax、caspase-3、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK1/2)、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶/ERK激酶(p-MEK1/2)的表达水平,以做进一步机制研究。结果马钱苷、莫诺苷组与模型组比较,细胞的增殖能力提高,SOD含量增加,MDA活性降低,且差异有显著性(P<0.05);马钱苷、莫诺苷组生长因子(GDNF、bFGF)的分泌高于模型组;Western blot结果表明,D-半乳糖致衰老的星形胶质细胞中Bax、caspase-3蛋白表达无明显变化,模型组pERK1/2、p-MEK1/2蛋白表达降低,马钱苷、莫诺苷增加pERK1/2、p-MEK1/2蛋白的表达。结论山茱萸活性成分马钱苷、莫诺苷可通过提高D-半乳糖致衰星形胶质细胞的增殖能力,提高衰老细胞的抗氧化能力,发挥抗衰老作用,其机制可能与MEK/ERK介导的信号通路调控有关。     

夏至草中两种黄酮苷类化合物的研究

目的研究夏至草的化学成分。方法用硅胶柱色谱和葡聚糖凝胶柱法对夏至草的黄酮部分进行分离,应用波谱学方法鉴定结构。结果分离出2种黄酮类成分,分别鉴定为7-O-(6″-反式-对-香豆酰基)-β-D-半乳糖-芹菜素苷(I),7-O-(3″,6″-二-反式-对-香豆酰基)-β-D-半乳糖-芹菜素苷(II)。结论I和II均为新化合物。     

番石榴叶天然成分抑制3T3-L1细胞成脂分化的研究

目的观察番石榴叶天然成分槲皮素、槲皮素-3-O-(6″-芥子酸)-β-D-吡喃半乳糖苷(Quercetin-3-O-(6″-eru-coyl)-β-D-galactopyranoside,QEG)及槲皮素-3-O-(6″-阿魏酸)-β-D-吡喃半乳糖苷(Quercetin-3-O-(6″-feruloyl)-β-D-ga-lactopyranoside,QFG)对小鼠3T3-L1细胞成脂分化的影响。方法诱导3T3-L1细胞成脂分化,油红O染色法测定脂滴含量,实时定量PCR(Q-PCR)检测丝氨酸蛋白酶脂肪因子adipsin,CCTTA增强子结合蛋白α(C/EBPα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、雌激素受体α(ERα)和雌激素受体β(ERβ)mRNA表达,Western blot检测C/EBPα和PPARγ的蛋白表达。结果 QFG和槲皮素都能抑制3T3-L1细胞成脂分化,而QEG对此没有作用。QFG能够剂量依赖性地抑制成脂分化,并且降低adipsin、C/EBPα和PPARγmRNA及后两者蛋白表达,而对ERα和ERβmRNA的表达没有影响。结论 QFG抑制细胞成脂分化的能力比槲皮素强,其作用主要是通过抑制C/EBPα和PPARγ的表达而实现的,而且可能与雌激素受体途径无关。     

积雪草苷对Aβ1-42致内皮细胞炎症因子表达的影响

目的探索积雪草苷对Aβ1-42诱导内皮细胞炎症因子表达影响。方法将人脐静脉血管内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)分为模型组,阴性对照组,积雪草苷10-5、10-6、10-7、10-8mol/m L组,共6组。模型组给予50 nmol/m L Aβ1-42刺激HUVEC细胞24 h,积雪草苷各组在给予Aβ1-42刺激同时给予积雪草苷10-5、10-6、10-7、10-8mol/m L干预。CCK-8试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8试剂盒)法检测HUVEC细胞活性;Western-blot检测COX-2蛋白表达;ELISA法检测IL-1,IL-6和TNF-α含量。结果与模型组比较,积雪草苷各浓度组可以明显提高β淀粉样蛋白刺激后血管内皮细胞活性,减少细胞COX-2蛋白表达(P<0.05),抑制β淀粉样蛋白致HUVEC细胞的IL-1,IL-6与TNF-α表达,有统计学意义(P<0.05)。结论积雪草苷对Aβ1-42致内皮细胞炎症因子表达具有保护作用。     

基于β-咔啉的环金属化Ru(II)配合物诱导HeLa细胞凋亡及抗氧化活性研究

目的探究新型环金属化Ru(II)-β-咔啉配合物[Ru(dmb)2(NO2-Ph-βC)](PF6)(NO2-Ph-βC=NO2-phenyl-9H-pyrido[3,4-b]indole;RuβC-5)和[Ru(bpy)2(NO2-Ph-βC)](PF6) (RuβC-6) 诱导HeLa细胞凋亡的机理。方法 通过元素分析、ES-MS、1H NMR对配合物进行表征;采用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)测定配合物的油水分配系数logP;细胞毒性实验检测RuβC-5和RuβC-6对 A549、HeLa、NCI-H460、HepG-2和MCF-7细胞的毒性作用;Hoechst 33342、AO/EB、Annexin V-FITC/PI染色法检测配合物诱导HeLa细胞凋亡;流式细胞术分析配合物对HeLa细胞凋亡、细胞周期阻滞、线粒体膜电位(MMP)、活性氧(ROS)的影响,蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测Caspase信号通路及线粒体凋亡通路相关蛋白的影响。结果 配合物RuβC-5、RuβC-6对HeLa细胞表现出相对较高的细胞毒性和较好的选择性,能诱导HeLa细胞的G0/G1期阻滞和凋亡,降低MMP,抑制细胞内ROS的产生。结论 新型Ru(II)-β-咔啉配合物可诱导HeLa细胞凋亡;此外,RuβC-5具有抗氧化活性,可以通过清除细胞内ROS的含量诱导HeLa细胞凋亡。     

D-半乳糖衰老模型观察的新指标

目的观察D-半乳糖衰老模型与正常小鼠之间衰老指标的差别.方法采用D-半乳糖sc造成衰老小鼠模型,测定脑组织Ca2 含量、Ca2 -ATP酶(钙泵)、Na -ATP酶(钠泵)、NO和AngⅡ胰岛素(ISN)活性.结果D-半乳糖衰老模型小鼠与对照组比较脑组织Ca2 含量(P＜0.01)、NO水平(P＜0.05)明显增加;Ca2 -ATP酶、Na -ATP酶活性下降(P＜0.01),胰岛素、AngⅡ水平明显下降(P＜0.01),Zn2 /Cu2 比值有显著性差异.结论D-半乳糖衰老模型小鼠与正常小鼠之间在组织Ca2 含量、Ca2 -ATP酶(钙泵)、Na -ATP酶(钠泵)、NO、AngⅡ和胰岛素活性有显著性差异,Zn2 /Cu2 比值下降,可作为抗衰老药物研究的模型.     

缺氧-缺血性脑病新生儿尿酶的改变及其临床意义

目的 探讨缺氧-缺血性脑病(HIE)新生儿尿中N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAG)和β-D-半乳糖苷酶(GAL)的改变及临床意义.方法 28例轻度HIE患儿(轻度组)和29例中重度HIE患儿(重度组)作为研究对象,25例正常足月新生儿作为对照组,采用终点法测定尿中NAG和GAL.结果 重度组尿NAG为(56.60±10.63)U/gcr,明显高于轻度组的(16.98±7.06)U/gcr和对照组的(16.82±4.43)U/gcr(P<0.01).重度组尿GAL为(22.66±5.52)U/gcr,明显高于轻度组的(10.94±3.55)U/gcr和对照组的(8.54±2.58)U/gcr,轻度组尿GAL亦明显高于对照组(P<0.01).结论 HIE患儿尿NAG、GAL均有显著改变,且和HIE的程度有关.     

低剂量卡铂诱导人肺癌细胞A549过早性衰老的作用研究

目的考察低剂量卡铂诱导人肺癌细胞A549过早性衰老的作用。方法 A549细胞经不同浓度卡铂处理,采用MTT法和克隆形成率试验检测卡铂对细胞增生的抑制作用;β-半乳糖苷酶染色试验检测卡铂诱导细胞衰老情况;FCM法检测卡铂对细胞凋亡和细胞周期分布的影响;全波长荧光酶标仪检测细胞内活性氧自由基(ROS)水平变化。结果低剂量卡铂能诱导细胞衰老;不同浓度卡铂作用细胞48 h后,β-半乳糖苷酶染色阳性细胞显著增多;细胞周期多停滞于G0/G1期,S期显著减少,且细胞内ROS水平明显升高(P<0.05)。结论低剂量卡铂能诱导人肺癌细胞A549过早性衰老。     

机械敏感离子通道Piezo1通过激活β-catenin诱导心房成纤维细胞衰老北大核心CSCD

目的 衰老心房成纤维细胞中新型机械敏感离子通道Piezo1的基因表达明显升高,观察其是否通过激活β-catenin参与心房成纤维细胞的衰老进程。方法 通过酶消化法分离培养3~4周龄雄性C57BL/6小鼠原代心房成纤维细胞,给予叔丁基过氧化氢(TBHP)刺激建立衰老模型,检测衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性。Western blot检测TBHP(100μmol·L^(-1))处理的细胞中Piezo1、β-catenin/p-β-catenin及衰老相关蛋白p53和p21的表达水平。衰老的小鼠心房成纤维细胞(MAFs)分别给予Piezo1通道抑制剂GsMTx4(3、10μmol·L^(-1))或Piezo1 siRNA,以及β-catenin抑制剂XAV939(3、10μmol·L^(-1));年轻的MAFs给予Piezo1特异性激动剂Yoda1(1、10μmol·L^(-1)),观察对细胞中β-catenin和衰老相关蛋白表达和活性的影响。结果 TBHP处理后,MAFs的SA-β-Gal染色阳性率明显增加,提示细胞发生衰老;且细胞中Piezo1、β-catenin/p-β-catenin和p53/p21的蛋白表达明显增加(P<0.05)。分别抑制Piezo1(GsMTx4/Piezo1 siRNA)或β-catenin(XAV939),可明显降低TBHP诱导的MAFs衰老率,以及减少β-catenin/p-β-catenin,p53/p21等蛋白表达和活性的增加(P<0.05)。而Yoda1可促进年轻细胞衰老,且β-catenin活性和衰老相关蛋白表达升高(P<0.05)。结论 机械敏感离子通道Piezo1通过激活β-catenin诱导心房成纤维细胞衰老的病理过程。     

葡萄糖-β-(1→4)-半乳糖二糖片段的合成

目的 利用化学方法高效合成葡萄糖-β-(1→4)-半乳糖二糖片段。方法 以4,6位苄叉保护的葡萄糖硫苷11为原料通过4步反应以39%的产率合成了硫苷供体15 ,再以TMSOTf与NIS作为促进剂,硫苷供体15与低活性的半乳糖受体18进行糖苷化反应合成葡萄糖-β-(1→4)-半乳糖二糖2。 结果 糖苷化反应以81%的产率得到葡萄糖-β-(1→4)-半乳糖二糖2, 为新型海洋天然产物Ancorinoside A的合成提供物质基础和技术保障。     

二甲双胍调节自噬保护亚急性衰老大鼠睾丸功能的作用

目的:研究二甲双胍(Met)对D-半乳糖构建的亚急性衰老模型大鼠睾丸功能的影响及其分子调控机制。方法:颈部皮下注射D-半乳糖制备亚急性衰老大鼠模型。次月予以Met溶液灌胃治疗,每周监测大鼠的体重,测定大鼠睾丸重量、睾丸指数;ELISA法检测大鼠血清睾酮(testosterone, T)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和雌二醇(E₂)水平;HE染色法观察睾丸形态;免疫组化染色检测衰老相关蛋白[β-半乳糖苷酶(β-gal)、p16和p21]、睾丸自噬相关蛋白[磷酸酶张力蛋白同源物诱导激酶1(PINK1)、Parkin、自噬效应蛋白(Beclin-1)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)和p62]和睾酮合成关键酶[类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、细胞色素侧链裂解酶(CYP11A1)和17-β-羟基类固醇脱氢酶3(HSD17β3)]的表达情况,并用Western blot检测上述蛋白的表达量。结果:与对照组相比,衰老模型组和Met组大鼠体重整体呈下降趋势;衰老模型组睾丸重量及指数下降(P<0.01),Met干预后显著上升(P<0.001)。衰老模...     

红参-制何首乌药对抗衰老作用的HT22细胞和秀丽隐杆线虫模型初步研究

目的 初步探讨不同提取工艺下红参-制何首乌药对对神经细胞的抗衰作用,为红参-制何首乌药对在抗衰及抗阿尔茨海默病(AD)作用的应用提供数据支撑。方法 分别制备30%和70%乙醇回流提取物,30%和70%乙醇渗漉提取物和水提取物。通过流式细胞术检测不同提取物对HT22细胞中β-半乳糖苷酶含量的影响,初步筛选红参-制何首乌药对神经细胞抗衰效果最佳的提取物,并通过β-半乳糖苷酶染色直观分析该提取物对神经细胞的抗衰效果,用秀丽隐杆线虫寿命试验及瘫痪实验验证其抗衰及抗AD作用。结果 红参-制何首乌药对的不同提取方式均对HT22细胞具有显著的抗衰老作用,其中70%乙醇渗漉提取物效果最佳。对其进行多浓度验证,显示具有剂量依赖性的保护作用。浓度为0.2 mg·mL^-1的70%乙醇渗漉提取物对秀丽隐杆线虫的寿命有明显的延长作用,浓度为0.008mg·mL^-1的70%乙醇渗漉提取物具有缓解瘫痪的趋势。结论 红参-制何首乌药对的70%乙醇渗漉提取物具有明显抗神经细胞衰老的作用,具有抗衰老延长寿命与治疗AD的潜力,应深入研究。     

银杏总内酯对衰老模型小鼠的作用银杏总内酯对衰老模型小鼠的作用

目的研究银杏总内酯(total lactones of ginkgo,TLG)对衰老模型小鼠的影响,探讨TLG的抗衰老作用机制。方法以D-半乳糖衰老模型小鼠和自然衰老模型小鼠为实验对象,以D-半乳糖衰老模型小鼠心、肝组织中脂褐素(LF)的含量及肝中羟脯氨酸(Hyp)的含量,脑组织中MAO,GSH-Px的活性和NO的含量以及自然衰老模型小鼠脑组织凋亡细胞数作为观察指标。结果TLG可减少D-半乳糖小鼠肝脏及心肌组织中LF的含量,升高肝脏组织中的Hyp的含量,并可提高脑组织中GSH-Px的活性,降低脑组织中NO的含量和MAO的活性;能明显减少自然衰老模型小鼠脑神经细胞凋亡的数目。结论TLG有明显的延缓衰老作用,其作用机理可能与抗氧化、抑制NO生成及细胞凋亡有关。