软骨细胞诱导骨髓基质干细胞构建带内支撑的组织工程化软骨

目的探讨以聚羟基乙酸(PGA)包裹特定形态的医用假体材料多孔高密度聚乙烯(HDPE,商品名为MEDPOR)为支架,应用软骨细胞诱导骨髓基质干细胞(BMSCs),共培养构建特定形态的带内支撑组织工程化软骨医用假体的可能性。方法以直径3mm、长5mm的圆柱形HDPE,外裹1mm厚PGA为支架,将体外分别培养的新生猪BMSCs和耳郭软骨细胞按7:3混合,以10×107/ml细胞浓度接种于支架上,同时以相同浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSCs分别接种,作为阳性对照组(PC组)和阴性对照组(NC组)。经体外培养2周及在裸鼠皮下移植4、8周后取材,行大体观察、组织学、组织化学及免疫组化检测。结果各组细胞均与材料黏附良好。实验组和阳性对照组均形成了大体形态良好的HDPE-软骨复合体,内支撑的HDPE与外层软骨结合紧密。组织学可见成熟的软骨陷窝结构,软骨渗入HDPE孔隙内部、异染基质及Ⅱ型胶原呈强阳性表达。结论以HDPE为内支撑,外裹PGA的支架,接种混合细胞,可于皮下构建特定形态、组织学良好的HDPE-软骨复合体。     

软骨细胞诱导骨髓基质干细胞构建带内支撑的组织工程化软骨

目的 探讨以聚羟基乙酸(PGA)包裹特定形态的医用假体材料--多孔高密度聚乙烯(HDPE,商品名为MEDPOR)为支架,应用软骨细胞诱导骨髓基质干细胞(BMSCs),共培养构建特定形态的带内支撑组织工程化软骨医用假体的可能性.方法 以直径3 mm、长5 mm的圆柱形HDPE,外裹 1 mm厚PGA为支架,将体外分别培养的新生猪BMSCs和耳郭软骨细胞按7∶3混合,以10×10 7/ml细胞浓度接种于支架上,同时以相同浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSCs分别接种,作为阳性对照组(PC组)和阴性对照组(NC组).经体外培养2周及在裸鼠皮下移植4、8周后取材 ,行大体观察、组织学、组织化学及免疫组化检测.结果 各组细胞均与材料黏附良好.实验组和阳性对照组均形成了大体形态良好的HDPE-软骨复合体,内支撑的HDPE与外层软骨结合紧密.组织学可见成熟的软骨陷窝结构,软骨渗入HDPE孔隙内部、异染基质及Ⅱ型胶原呈强阳性表达.结论 以HDPE为内支撑,外裹PGA的支架,接种混合细胞,可于皮下构建特定形态、组织学良好的HDPE-软骨复合体.     

骨髓基质干细胞复合改性的聚羟基丁酸-羟基异戊酯体外构建组织工程化软骨

目的 探讨应用骨髓基质干细胞(BMSCs)复合光接枝改性的聚羟基丁酸-羟基异戊酯(PHBV)构建组织工程化软骨的可行性. 方法 将3代绵羊骨髓基质细胞接种于光接枝改性的三维PHBV支架材料上,24 h后以成软骨诱导液培养,3周后,复合培养物行扫描电镜观察,组织学观察,测定糖胺聚糖(GAG)含量.并将复合物埋植于绵羊腹部皮下,4周后取出,行大体及组织学观察. 结果 经成软骨诱导后,扫描电镜下,BMSCs的突触逐渐变短,由长梭形向扁平形转变,分泌基质量亦明显增多.组织学观察见细胞支架复合物阿利新蓝、番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性.GAG含量测定示诱导3周后,细胞分泌的GAG量(1306.7±192.3)明显高于未经诱导的BMSCs(205.0±26.2)(P<0.001),但仍低于正常软骨细胞(1969.2±235.3)(P<0.001).复合物埋植于皮下4周后,其内炎症细胞浸润明显,但番红O、Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性. 结论 以BMSCs为种子细胞,复合改性的PHBV,可于体外构建出软骨样组织,但该组织的理化特点与正常软骨仍有差距.     

骨髓基质干细胞作软骨组织工程种子细胞研究

目的　综述近年来骨髓基质干细胞体外培养、定向分化为软骨细胞的条件及相关研究进展。方法　广泛查阅相关文献 ,对上述研究进展进行整理、综合和分析。结果　骨髓基质干细胞易于分离培养 ,体外增殖能力强 ,传代多次后仍保持有多分化潜能 ;体内成软骨能力明确 ;但骨髓基质干细胞定向分化的软骨细胞 ,不是终末分化阶段 ,而只是一个中间阶段。结论　骨髓基质干细胞以其自身多方面的特点已成为软骨组织工程的另一种可选择的种子细胞 ,但其进一步分化为成熟软骨细胞的条件尚需进一步研究。     

构建带内支撑组织工程软骨的实验研究

目的探讨以医用多孔高密度聚乙烯(Medpor)为内支撑外裹聚羟基乙酸(PGA)的支架,接种软骨细胞后,于体内构建Medpor软骨复合体的可能性。方法实验组:以直径3mm的Medpor外裹2mmPGA为支架,接种新生猪关节软骨细胞(5×107/ml),经体外培养2周及裸鼠皮下移植6周后取材,行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学和生物化学检测;PGA对照组:以直径8mm的单一PGA为支架,细胞接种与培养同实验组;单纯支架组:利用实验组支架,不接种细胞行体内移植。结果实验组:形成大体形态良好的Medpor-软骨复合体,内部的Medpor与外层软骨结合紧密,组织学可见成熟软骨陷窝并渗入Medpor孔隙内部、异染基质、Ⅱ型胶原表达阳性;PGA对照组:形成的软骨存在"空心"现象;单纯支架组:无软骨形成。结论利用Medpor与PGA复合的支架,接种软骨细胞后,可于体内构建出特定形状、结构与组织学良好的Medpor软骨复合体,克服了组织工程软骨的"空心"现象。     

骨髓基质干细胞与软骨脱细胞基质多孔支架异位构建组织工程化软骨的实验研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与软骨脱细胞基质多孔支架(cartilage ECM-derived porous scaffold,CEDPS)在裸鼠体内异位构建软骨的可行性,并建立利用PKH26荧光和分子荧光活体成像系统无创评估组织工程化细胞-支架复合体在体内生长情况的新方法.方法 PKH26荧光标记成软骨诱导的BMSCs,接种入CEDPS支架,体外进行电镜、Desd/Live荧光染色观察,然后植入裸鼠背部,4周后利用分子荧光活体成像系统无创伤性评估组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,取材进行组织学以及Ⅱ型胶原免疫荧光检测,与荧光图像比较.结果 体外培养的BMSCs-CEDPS复合体电镜检查结果表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞基质分泌增加,Dead/Live染色表明BMSCs在支架内部活性良好.4周后活体荧光示踪显示BMSCs在支架内生长良好,无扩散趋势,BMSCs-CEDPS复合体在裸鼠体内生成软骨样组织,番红"O"、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,免疫荧光检查表明构建的软骨样组织内的细胞来源为接种的PKH26标记的BM-SCs.结论 利用BMSCs和CEDPS支架能够在裸鼠皮下异位构建类软骨样组织.PKH26标记与分子荧光活体成像系统结合,能够无创伤性评估组织工程化组织的种子细胞在动物体内生长情况与转归.     

利用人骨髓基质干细胞异位构建组织工程化骨的实验研究

目的 探讨以人骨髓基质干细胞为种子细胞、以部分脱钙骨为支架材料在体内构建组织工程化骨的可行性及其成骨机制。方法 培养、扩增人骨髓基质干细胞，将第4代hBMSCs接种于部分脱钙骨支架上，通过扫描电镜观察其生长和粘附情况，并测量粘附率。于裸鼠皮下植入人骨髓基质干细胞和部分脱钙骨复合物，以无细胞部分脱钙骨作对照。8及12周取材观察。结果 8及12周复合物植入组均见新骨形成，多数骨小梁表面衬有一层成骨细胞样细胞，提示可能存在膜内成骨。单纯部分脱钙骨植入组未见新骨形成。结论 人骨髓基质干细胞与部分脱钙骨复合可以在体内构建组织工程化骨；其成骨机制可能为膜内成骨。     

基于永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞的工程化软骨形成的实验研究

目的 :探讨hTERT转染的永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞 (MSCs)裸鼠体内形成软骨的能力。方法 :通过真核表达载体 ,把人端粒酶逆转录酶基因转入兔髁状突软骨细胞 ,筛选并挑选阳性克隆进行扩增培养 ;取兔骨髓 ,密度梯度离心和培养 ,经诱导、扩增后与支架材料 β 磷酸三钙 (β TCP)复合 ,构建细胞 β TCP复合体 ,体外培育 1～ 2d后 ,植入裸鼠体内。通过粘多糖 (GAG)含量和Ⅱ型胶原的表达来检测 3和 6个月复合体软骨形成情况。结果 :两种细胞和 β TCP复合体在裸鼠体内均能形成软骨样组织 ;6个月 ,工程化软骨GAG含量和Ⅱ型胶原的表达均低于正常软骨组织 ,但无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :hTERT转染的永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞均具有良好的软骨形成能力 ,在软骨组织工程修复软骨缺损方面具有重要的应用前景。     

兔骨髓间质干细胞用于构建组织工程软骨组织的初步报告

目的 采用组织工程方法,以培养后的兔骨髓间质干细胞（MSC）制成人工软骨培养物,经体内外培养后发育出成活的软骨组织。方法 抽取兔人经密度梯度离心得到单个核细胞,再经体外分离、培养获得兔骨髓MSC。向MSC培养液内加入地塞米松、转化生长因子－β1（TGF－β1）和维生素C进行软骨起源诱导培养3周,部分细胞开始转变为圆形并分泌基质。将诱导后的细胞与牛Ⅰ型胶原及人纤维蛋白按一定的比例混合,制成软骨样的培养物并分别做体内外培养。结果 体外培养2周后,培养物内大部分细胞已萎缩消失。但剩余的少量细胞成活,形成类似的软骨陷窝并分泌甲苯胺蓝异染的软骨基质。体内移植培养3周后,培养物已发育成颗粒状成熟的软骨组织。结论 骨髓间质干细胞可用于组织工程软骨组织的构建,是一种非常有前途的人工软骨组织构建中的功能细胞。     

骨髓间质干细胞复合生物陶瓷构建组织工程化人工软骨

目的 探索以多孔β-磷酸三钙(β-TCP)生物陶瓷材料为支架，经体外诱导的骨髓间质干细胞(MSCs)为种子细胞，构建组织工程化软骨修复羊关节软骨缺损的可行性。方法将28只中国美利奴绵羊分为三组。实验组(n＝12)：分离培养羊自体第7代MSCs，经转化生长因子-β诱导后接种到顶制的β-TCP多孔生物陶瓷材料上，细胞—材料复合体经体外孵育后，无菌条件下植入预制的羊单例肋骨近端关节面缺损处；单纯材料组(n＝12)：采用单纯β-TCP材料修复羊关节软骨缺损；空白对照组(n＝4)：制备的羊关节软骨缺损区未做任何修复。术后12周和24周分别取材，进行组织学、组织化学和免疫组织化学分折。结果 实验组术后12周羊关节软骨缺损处肉眼可见透明软骨祥组织形成，组织学检查发现，材料降解明显，未降解吸收的材料孔洞内广泛分布着新生软骨组织，软骨细胞外基质丰富，Ⅱ型胶原染色阳性；术后24周，支架材料几乎完全降解，缺损区被新生软骨组织所取代。单纯材料组术后12周，缺损区边缘有新生软骨组织向支架材料内长入，支架材料吸收明显；术后24周，见从缺损区边缘长入到支架材料内的新生软骨组织逐渐增多，但材料的中心部位未发现新生软骨形成。空白对照组至术后24周，仅见少量软骨组织从缺损区边缘向缺损区内长入，缺损中央大部分区域仍未得到修复。结论 以β-TCP多孔生物陶瓷作为支架材料，以自体MSCs作为种子细胞构建组织工程化软骨修复关节软骨缺损是可行的。     

经诱导的骨髓基质干细胞应用于组织工程化人工神经的实验研究

目的 探讨骨髓基质干细胞应用于组织工程化人工神经修复大鼠10mm长坐骨神经缺损的效果。方法 28只体重在160～200g的雌性F344大鼠随机分成4组，每组7只。A组：种植经诱导5d后的同源骨髓基质干细胞并具有内部支架结构的中空管；B组：种植同源许旺细胞并具有内部支架结构的中空管；C组：无细胞只具有内部支架结构的中空管；D组：自体神经移植组。术后3个月，进行系列神经电生理监测、坐骨神经功能指数测定、神经组织学观察、S—100及神经微丝蛋白兔疫组化染色和轴突计数等检查。结果 术后12周内，实验组(A组)的各项检测指标均优于C组(P＜0．05或0．01)，与B和D组间差异无显著性(P＞0．05)。结论 初步结果显示经诱导的骨髓基质干细胞可作为外周神经组织工程中的种子细胞，并应用于人工神经修复外周神经缺损。     

重组PcDNA3.1-hBMP-2转染骨髓基质干细胞及复合异种骨支架体外构建组织工程骨

目的：构建人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein,，hBMP-2)真核表达载体PcDNA3．1-hBMP-2，转染兔骨髓基质干细胞(bane marrow stromal cells，BMSCs)，种植去抗原牛松质骨(bovine cancellous bone，BCB)支架体外构建组织工程骨。方法：蛋白印迹法检测转染后细胞BMP-2的表达，碱性磷酸酶(ALPase)活性检测分析基因转染对细胞分化的影响。然后将转染后细胞接种到BCB支架上，扫描电镜观察细胞贴附、生长状况。结果：转染后，BMSCs表达BMP-2，ALP活性明显增高。扫描电镜见转染细胞分布均匀，伸展良好。结论：在脂质体介导下，BMP-2基因可导入细胞且稳定表达基因产物促进自身增殖分化，转染后细胞在支架材料上贴附生长良好，为进一步应用携带BMP-2基因的人工骨修复骨缺损奠定了实验基础。     

自体骨髓基质干细胞在齿槽裂骨缺损修复中的应用

目的探讨人自体骨髓基质干细胞（human bone marrow stromal cells，hBMSCs）在治疗齿槽裂骨缺损中的可行性。方法2002至2005年，选择齿槽裂骨缺损患者7例（单侧6例，双侧1例），以患者自体骨髓基质干细胞为种子细胞，部分脱钙骨（partly demineralized bone matrix，pDBM）为支架材料构建组织工程骨，治疗齿槽裂骨缺损。从患者髂前上棘穿刺取骨髓，密度梯度离心法分离hBMSCs，经体外成骨诱导和扩增至第3代。将诱导的hBMSCs，复合部分脱钙骨体外培养1周后，手术回植骨缺损区。分别于术后1、3、6、12、24、36个月进行临床外形和三维CT检查随访。结果6例患者头部三维CT检查，结果示术后3个月能形成组织工程化骨，并修复骨组织缺损。术后1～3年的随访表明组织工程骨稳定存在，无明显骨吸收现象，临床治疗效果稳定。1例患者（双侧齿槽裂）植入物外露感染。结论以自体hBMSCs为种子细胞，部分脱钙骨为支架材料，利用组织工程技术可在人体内形成稳定的组织工程化骨组织，并临床修复齿槽裂骨缺损。     

同种异体骨髓基质细胞肌肉内成骨分化的实验研究

目的 观察并探讨同种异体兔骨髓基质细胞在未接受免疫抑制剂的正常兔肌肉内移植后的免疫原性、存活及成骨状况.方法 首先通过兔谱系差异选择供、受体,并采用淋巴细胞反应进一步证实免疫学错配,之后抽取兔骨髓、体外分离培养、获取骨髓基质细胞,体外加矿化条件培养液诱导成骨、并对成骨特性予以鉴定后,将异体骨髓基质细胞移植入受体兔肌肉内,从淋巴细胞转化率、淋巴细胞杀伤活性、组织学检查、种子细胞体内成活及成骨情况等方面检测. 结果 术后各检测时间,异体骨髓基质细胞移植未诱发淋巴细胞大量增殖反应(P>0.05),淋巴细胞杀伤活性与自体组差异无统计学意义(P>0.05),移植区未见到大量炎性细胞浸润,经组织学及免疫组化染色证实异体骨髓基质细胞在受体组织内存活,8周后于异体肌肉中形成骨组织. 结论 同种异体骨髓基质细胞移植,未诱发免疫排斥反应,在无免疫抑制剂应用的情况下,移植细胞在受体肌肉内存活、并形成骨性组织.     

含锌煅烧牛松质骨复合骨髓基质细胞构建组织工程骨

目的　探讨含锌煅烧牛松质骨和单纯煅烧牛松质骨复合骨髓基质细胞 (MSCs)构建的组织工程骨在体内的成骨能力。方法诱导培养骨髓基质细胞 ,将其分别接种至含锌煅烧牛松质骨及单纯煅烧牛松质骨 ,植入肌肉内 ,分别于术后 4、8周处死实验动物 5只 ,行组织学观察和新生骨面积测定。结果　术后不同时间组织学观察含锌组新生骨明显多于单纯组 ,新生骨面积测定值含锌组分别为 (17619.14 5± 44 5 9.816)、(2 5 2 3 8.5 3 9± 1995 .164 ) μm2 ,单纯组分别为(80 5 6.5 3 7± 5 67.60 3 )、(10 787.95 7± 92 5 .5 0 9) μm2 。含锌组明显大于单纯组 (P <0 .0 5 )。结论　含锌煅烧骨作为骨组织工程的支架材料优于单纯煅烧骨 ,是一种理想的生物活性支架材料。     

软骨细胞与骨髓基质细胞共培养体外构建软骨组织的实验研究

目的 探讨利用软骨细胞提供的软骨微环境诱导骨髓基质细胞(BMSC)在体外构建软骨组织的可行性.方法 将分离出的猪骨髓基质细胞和软骨细胞进行体外培养,收集软骨细胞培养上清液,作为骨髓基质细胞诱导液从第2代开始进行诱导分化.7 d后取出标本,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达.体外分离培养的骨髓基质细胞与软骨细胞,扩增后两者以8∶2比例混匀,以5.0×107/ml的终浓度接种于聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架,以相同浓度的单纯软骨细胞和单纯BMSC以及20%上述浓度(1.0×107/ml)的单纯软骨细胞作为对照组.标本于8周后取材,行大体观察、湿重、蛋白多糖(GAGs)含量测定、组织学及免疫组化等相关检测.结果 经诱导后的骨髓基质细胞的Ⅱ型胶原免疫组化检测阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达.混合细胞组及阳性对照组体外培养8周后形成了单一成熟的软骨组织,并保持了支架材料的大小和形状,两组新生软骨在外观及组织学特征上也基本相同,免疫组化结果 表明两组均大量表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原,共培养组的平均湿重和蛋白多糖(GAGs)含量均达到阳性对照组的70%以上.而单纯骨髓基质细胞组仅在局部形成了极少量幼稚的软骨样组织,且材料支架明显皱缩变形.低软骨细胞浓度组虽新生软骨湿重量能达阳性对照组的30%,但材料支架明显皱缩变形,仅在局部形成了不连续的软骨组织,新生软骨量明显少于共培养各组及阳性对照组.结论 软骨细胞能在一定程度上提供软骨形成的微环境,有效地诱导BMSC向软骨细胞分化,并在体外形成组织工程化的软骨组织.

Abstract：

Objective To investigate the feasibility of chondrogenesis in vitro with bone marrow stromal cells (BMSCs) induced by the co-cultured chondrocytes. Methods The BMSCs and chondrocytes were separated from pig and cultured. The supernatant of chondrocytes was used as the inducing solution for BMSCs from the 2nd generation. 7 days later, samples were taken and underwent immunohistochemistry and RT-PCR for detection of the expression of specific type Ⅱ cartilage collagen,type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA. The cultured BMSCs and chondrocytes were mixed at a ratio of 8:2(BMSC: cartilage cell) and were inoculated into a polyglycolic acid/polylactic acid (PGA/PLA) scaffold at the final concentration of 5.0 × 107/ml. The cartilage cells and BMSCs were also inoculated seperately at the same concentration as the positive and negative control. Pure cartilage cells at 20% of the abovementioned concentration (1.0 × 107/ml) were used as the low concentration cartilage cell control group. Samples were collected 8 weeks later. General observations, wet weight, glycosaminoglycans (GAGs) determination and histological and immunohistochemistry examinations were performed. Results The expression of type Ⅱ collagen, type Ⅱ collagen and aggrecan mRNA were positive in induced BMSCs.In the co-cultured group and the positive control group, pure mature cartilage was formed after 8 weeks of culture in vitro, and the size and shape of the scaffold were maintained. The newly formed cartilage in the two groups were almost the same in appearance and histological properties. The immunohistochemistry results indicated that the cartilage cells of the two groups all expressed ample cartilage-specific type Ⅱ collagen. The average wet weight and GAG content in the co-cultured group reached more than 70% of those in positive control group. Only an extremely small amount of immature cartilage tissues was formed in local regions in pure BMSC group, and the scaffold was obviously shrunk and deformed. Although the wet weight of newly generated cartilage tissue in the low concentration cartilage cell group reached 30% of that in positive control group, the scaffold was obviously shrunken and deformed. Only regional and discontinuous cartilage tissues were formed, and the amount of newly formed cartilage was obviously less than that in the co-culture group and the positive control group. Conclusions Chondrocytes can provide a micro-environment for the formation of cartilage, and also effectively induce BMSC to differentiate into chondrocytes and form tissue-engineered cartilage in vitro.     

骨形成蛋白-2转染兔骨髓基质细胞修复软骨缺损的研究

目的 观察骨形成蛋白-2(BMP-2)基因转染兔骨髓基质细胞(MSCs)复合藻酸钙修复兔膝关节软骨缺损的效果.方法 取4周龄的新西兰兔骨髓细胞,体外培养得到MSCs.选用24只成年新西兰兔,在两侧股骨髁非负重区造成全层软骨缺损模型,A组(实验组)植入BMP-2转染的MSCs+藻酸钙,B组(对照组Ⅰ)植入空质粒转染的MSCs+藻酸钙,C组(对照组Ⅱ)植入不含MSCs的藻酸钙,D组(对照组Ⅲ)旷置.12周后,观察软骨缺损修复情况及组织学评价.结果 实验组修复组织基本光滑,有大量Ⅱ型胶原蛋白表达,3个对照组修复组织Ⅱ型胶原蛋白表达量少,仍有明显缺损.实验组和3个对照组组织学评分差异有统计学意义(P＜0.05).结论 BMP-2转染兔MSCs修复软骨缺损效果优于其他对照组.