大鼠视网膜干细胞与神经干细胞体外增殖、分化特点比较

目的 通过对大鼠视网膜干细胞和神经干细胞体外增殖、分化特点进行比较,进一步明确视网膜于细胞自我更新及向神经细胞方向分化的能力.方法 实验研究.分离出生10 d大鼠睫状体区组织及新生大鼠脑组织,分别应用酶消化法将两种组织制成单细胞悬液,放入含有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养,观察并比较视网膜干细胞及神经干细胞体外增殖的特点.分别取第2代细胞,应用免疫细胞化学染色法检测干细胞特异性抗原神经巢蛋白（nestin）及细胞分裂增殖标志物5-溴脱氧尿核苷（BrdU）的表达.同时,应用含50 ml/L的胎牛血清及1×N2添加剂的培养基促进其分化,观察两种细胞向神经细胞方向分化的特点：分别应用免疫细胞化学染色法对分化后的细胞nestin、神经无标志物神经元特异性烯醇酶（NSE）、神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白（GFAP）进行检测,并应用卡方检验对两种干细胞分化后的NSE及GFAP阳性细胞数比例进行比较.结果 两种细胞原代培养48 h后均可见小的球状细胞团悬浮生长,折光性强.原代培养约7 d后传代,传代后细胞能重新形成球状细胞团,应用免疫细胞化学染色方法均可检测到细胞内nestin及BrdU的阳性表达,视网膜干细胞体外增殖的能力较神经干细胞弱.两种细胞均可在血清诱导条件下转变为贴壁生长,并分化出具有神经细胞形态的细胞.诱导第7天进行免疫细胞化学染色,检测出两种干细胞表达nestin阳性细胞数比例分别为（9.5±3.5）%及（9.1±0.7）%.视网膜干细胞分化后NSE及GFAP的阳性细胞数比例分别为（11.2±2.8）%及（18.9＋2.1）%,低于神经干细胞分化后两种标志物阳性细胞数比例[（34.1±63）%及（41.9±3.3）%],NSE、GFAP在两组表达的差异均有统计学意义（x2=103.23,P＜0.05;x2=74.36,P＜0.05）.结论 来源于睫状体区的大鼠视网膜干细胞形态、体外增殖及可分化特性与神经干细胞相似,但其增殖及分化为神经细胞的能力较神经干细胞弱.     

大鼠胚胎视网膜干细胞的分离培养

目的分离培养大鼠胚胎视网膜干细胞。方法从胎龄第16d的SD大鼠视网膜神经上皮分离视网膜细胞并进行悬浮培养,观察细胞增殖以及自发分化情况,采用免疫细胞化学方法检测Nestin、β-Tubulin、GFAP和Recoverin的表达。结果原代细胞可形成悬浮生长的神经球,传代后能形成新的细胞球。原代及传代细胞大部分表达神经干细胞标记物Nestin,分化后的细胞部分表达神经元标记物β-Tubulin或神经胶质细胞标记物GFAP,少数细胞表达光感受器细胞标记物Recoverin。结论分离培养的SD胚鼠视网膜神经干细胞可以在体外扩增并具有多分化潜能。     

大鼠胚胎视网膜中神经干细胞的体外培养与鉴定

目的 培养和鉴定大鼠胚胎视网膜中的神经干细胞.方法 取孕龄16～19 dSD大鼠胚胎鼠的视网膜组织,在干细胞选择性培养基中培养,用免疫组织化学法来检测Nestin和Chx-10的表达.结果 SD大鼠胚胎鼠视网膜中的神经干细胞在体外悬浮生长,形成致密的球形细胞团,传代后能够生成新的细胞团,原代和传代细胞Nestin和Chx-10蛋白均表达阳性.结论 SD大鼠胚胎视网膜内存在神经干细胞,并且可以进行体外培养和扩增.     

胎儿视网膜前体细胞的分离培养

目的建立视网膜前体细胞的培养方法。方法分离8~12周流产胎儿的视网膜神经上皮细胞，采用悬浮和贴壁两种方法分别进行培养和传代，取传代细胞用含5%胎牛血清的、无碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的培养基诱导分化培养14 d，并采用免疫荧光法检测培养细胞诱导分化前后前体细胞和视网膜终末细胞标记物表达的改变。结果悬浮培养的细胞形成神经球并表达神经干细胞的标记物巢蛋白nestin，但无法成功传代扩增；贴壁培养的细胞可连续传代并表达nestin，传代细胞诱导分化后表达视网膜终末细胞的标记物胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、β微管蛋白(β-tubulin)和恢复蛋白recoverin。结论从8～12周的人胚胎视网膜神经上皮分离培养的视网膜前体细胞具有体外扩增和多分化潜能。（中华眼底病杂志，2007，23：98-100）     

人视网膜中神经干细胞样细胞的分离和体外培养

目的 分离培养发育基本成熟的人视网膜中神经干细胞样细胞。方法 取0～3岁猝死婴幼儿视网膜细胞，在干细胞选择性培养基中培养，观察原代和传代细胞的形态和增殖情况，并对其诱导分化。通过免疫细胞化学方法检测Nestin、MAP-2和GFAP的表达。结果 原代细胞可形成悬浮生长的致密球状细胞团，传代后能形成新的细胞球。部分细胞球表达Nestin，传代后阳性率增加。分化后细胞形态多样，每一团细胞相对一致，部分细胞表达MAP-2或GFAP。结论 0～3岁人视网膜中存在一种表现出神经干细胞特性的细胞。     

胚胎和生后大鼠视网膜干细胞在体内和体外的分化差异

目的 研究胚胎和生后大鼠视网膜干细胞（RPCs）在体内和体外的分化.方法 取胚胎18 d和生后2周SD大鼠视网膜,分别用悬浮法及贴壁法培养.传至第1代后转入分别含10 ng/ml睫状神经营养因子（CNTF）、20 ng/ml表皮生长因子（EGF）、10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、10%视黄酸、10%胎牛血清的DMEM：F12中进行诱导分化,贴壁后2、3、5、6 d的细胞及胚胎18 d,生后1、3、5、7、14 d的大鼠视网膜切片分别行nestin、vimentin、opsin及GFAP的二步法免疫组织化学染色.结果 大鼠的RPCs在悬浮时呈球状生长,nestin染色阳性,悬浮培养传至第1代,贴壁培养传至第5代.CNTF、bFGF、EGF及视黄酸组在培养至6 d时可呈神经元样细胞改变,有轴突,但持续出现nestin阳性.生后2周的RPCs无法诱导成opsin阳性细胞.结论 RPCs可在体外培养并传代,其在分化过程中形态学的改变先于功能学变化.光感受器细胞的体外诱导较困难.     

大鼠视网膜前体细胞的传代培养及体外分化诱导

目的了解表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及睫状神经营养因子（CNTF）对其分化的影响。方法取孕18d的SD大鼠胚胎眼的视网膜，分别用悬浮法及贴壁法培养。传至第一代后转入分别含10ng／mlCNTF、20ng／mlEGF、10ng／mlbFGF、10％胎牛血清的DMEM：F12中进行诱导分化，贴壁后2、3、4、6d分别行nestin、Vimentin、Opsin及GFAP的二步法免疫组织化学染色。结果大鼠的RPCs在悬浮时呈球状生长。nestin及Vimentin染色阳性，悬浮培养传至一代，贴壁培养传至五代，传代后细胞数量不断减少并可在体外分化为含视网膜光感受器细胞及胶质细胞的混合神经元。CNTF、bFGF及EGF不同程度地增加了光感受器细胞的比例。结论RPCs可在体外培养并传代。CNTF、bFGF及EGF参与视网膜发育的调节。     

兔胚胎视网膜前体细胞体外培养纯化方法探究

目的 探讨新西兰白兔的胚胎视网膜前体细胞的培养、增殖与纯化方法,并对其性质及体外分化进行鉴定。方法 来源于19d、20d及26d不同孕龄的兔胚胎,用内路法取出含视网膜前体细胞的组织,采用胰酶/EDTA消化,利用组织中不同类型细胞对消化液不同的反应,去除混入的间质细胞等成分,达到逐步分离纯化胚胎视网膜前体细胞的目的。对分离所得的细胞,利用倒置相差显微镜观察其生长5情况,同时对相关类型细胞行免疫细胞化学染色,以鉴定视网膜前体细胞。结果 从兔胚胎视网膜神经部分离出的原代视网膜前体细胞具有明显的生物学特性：所培养细胞可形成悬浮生长的细胞团,刚贴壁的细胞成簇状生长,这些细胞用免疫细胞化学染色神经上皮干细胞蛋白（Nestin）表达呈阳性。经传代几代后细胞生长趋同,细胞生长呈长梭形,逐渐有细胞分化为多种视网膜细胞类型,包括视网膜神经节细胞等,同时Nestin表达下调。结论 不同时期、不同培养条件下的视网膜前体细胞均具有相同的形态,这种利用酶消化时间的不同能够分离纯化视网膜前体细胞,为将来研究此类细胞的性质及干细胞的相关研究打下良好的细胞生物学基础。     

大鼠胚胎视网膜前体细胞的分离、体外培养及鉴定

目的探讨流式细胞分析技术、免疫荧光及^3H—Thymidine分析对大鼠胚胎视网膜前体细胞性质及其体外增殖进行鉴定的可行性。方法来源于19d胚胎大鼠视网膜的视网膜前体细胞,使用流式细胞分析及免疫荧光技术从数量及形态上对细胞性质进行鉴定。采用无血清培养基体外培养,通过^3H-Thymidine分析、形态学观察及统计学分析,研究细胞增殖情况。结果从胚胎大鼠全层视网膜分离出的原代视网膜前体细胞,流式细胞分析结果显示：培养0d时,22．23％的细胞神经上皮干细胞蛋白（Nestin）呈阳性表达,16．04％的细胞Sox-2呈阳性表达,19．66％的细胞钙结合蛋白呈阳性表达,其余终末视网膜细胞标记物（胶质纤维酸性蛋白、CD90、视紫红质、C反应蛋白、突触前膜列阵蛋白）均呈极微量阳性或阴性。免疫荧光结果显示大部分细胞及细胞球（〉90％）Nestin呈阳性表达。培养6d后,流式细胞分析显示43．36％的细胞Nestin阳性,免疫荧光显示Nestin及胶质纤维酸性蛋白呈阳性。连续4d^3H-Thymidine分析及形态学观察、统计学分析原代视网膜前体细胞初期增殖良好。结论流式细胞分析、免疫荧光及^3H—Thymidine等免疫学技术可很好的对视网膜前体细胞性质及其增殖情况进行鉴定。大鼠胚胎原代视网膜前体细胞表现出神经干细胞的特性,根据检测手段不同,阳性结果不同,其原代视网膜前体细胞体外培养初期增殖良好。     

人胚胎视网膜来源神经干细胞体外培养尝试

目的从人胚胎视网膜中分离、培养神经干细胞。方法人16～20周胚胎视网膜制备的单细胞悬液,分别在无血清和有血清条件下进行体外培养,采用免疫荧光法检测培养的细胞对nestin和视网膜终末细胞抗原的表达,采用RT—PCR方法和实时荧光定量PCR法检测诱导前后细胞nestin基因在mRNA水平的表达差异。结果可从人胚胎视网膜神经感觉层中培养出神经干细胞。该细胞具有自我复制能力,表达nestin,经不同条件诱导后细胞表达视网膜视杆细胞、无长突细胞、双极细胞、节细胞和米勒细胞等标志。诱导后细胞nestin基因表达量较诱导前细胞明显降低。结论人胚胎视网膜神经感觉层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。（中华眼科杂志,2005,41：847-852）     

A comparison of epithelial and neural properties in progenitor cells derived from the adult human ciliary body and brain

Cells isolated from the ciliary body (CB) of the adult human eye possess properties of retinal stem/progenitor cells and can be propagated as spheres in culture. As these cells are isolated from a non-neural epithelium which has neuroepithelial origin, they may have both epithelial and neural lineages. Since it is the properties of neural progenitor cells that are sought after in a future scenario of autotransplantation, we wanted to directly compare human CB spheres with neurospheres derived from the human subventricular zone (SVZ), which is the best characterized neural stem cell niche in the CNS of adults. The CB epithelium was dissected from donor eyes (n = 8). Biopsies from the ventricular wall were harvested during neurosurgery due to epilepsy (n = 7). CB and SVZ tissue were also isolated from Brown Norwegian rats. Dissociated single cells were cultivated in a sphere-promoting medium and passaged every 10-30 days. Fixed spheres were studied by immunohistochemistry, quantitative RT-PCR and scanning/transmission electron microscopy. We found that both CB and SVZ spheres contained a mixed population of cells embedded in extracellular matrix. CB spheres, in contrast to SVZ neurospheres, contained pigmented cells with epithelial morphology that stained for cytokeratins (3/12 +  19), were connected through desmosomes and tight-junctions and produced PEDF. Markers of neural progenitors (nestin, Sox-2, GFAP) were significantly lower expressed in human CB compared to SVZ spheres, and nestin positive cells in the CB spheres also contained pigment. There was higher expression of EGF and TGF-β receptors in human CB spheres, and a comparative greater activation of the canonical Wnt pathway. These results indicate that adult human CB spheres contain progenitor cells with epithelial properties and limited expression of neural progenitor markers compared to CNS neurospheres. Further studies mapping the regulation between epithelial and neural properties in the adult human CB spheres are vital to fully utilize them as a clinical source of retinal progenitor cells in the future.     

大鼠视网膜Mller细胞受刺激后具有神经干细胞的特性

目的:研究并验证成年哺乳动物视网膜中Mller细胞经刺激后可以产生神经干细胞特性。方法:对6周龄VC大鼠右眼玻璃体腔内注射神经毒素混合液(含NMDA,kainate,FGF2和insulin)刺激Mller细胞,左眼玻璃体内注射PBS作为对照眼。1wk后取眼并分离Mller细胞体外原代纯化培养7d。流式细胞技术鉴定Mller细胞纯度,通过细胞免疫荧光组织化学和流式细胞技术鉴定神经干细胞标志物nestin在Mller细胞上的表达。结果:流式细胞分析结果显示,本实验分离培养的原代Mller细胞纯度可达96%以上;细胞免疫荧光组织化学显示激活后Mller细胞能表达nestin,流式细胞技术证明,激活后培养的细胞中表达nestin的细胞可达总细胞量的53.5%。结论:成年大鼠视网膜Mller细胞经神经毒素在体刺激后可以产生神经干细胞特性。     

过氧化氢对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中20S蛋白酶体表达的上调作用

目的:探讨过氧化氢诱导的氧化应激对人视网膜色素上皮细胞ARPE-19中20S蛋白酶体表达的影响。方法:分别选择0,100,300μmol/L过氧化氢作用ARPE-19细胞4h后收集样本,Western blot方法检测细胞中20S蛋白酶体表达水平,细胞免疫荧光方法检测20S蛋白酶体在细胞中的分布。结果:100和300μmol/L过氧化氢溶液处理的细胞中20S蛋白酶体的表达和对照组相比明显增加(100μmol/L过氧化氢处理组vs0和300μmol/L过氧化氢处理组,P<0.05),并呈现剂量依赖性。正常培养情况下,细胞内20S蛋白酶体在核周微量表达,100和300μmol/L过氧化氢溶液处理的细胞内20S蛋白酶体和对照组相比明显增加,其分布集中在核内及核膜周围。结论:过氧化氢对ARPE-19的20S蛋白酶体表达有上调作用。     

体外诱导室管膜下区神经干细胞分化为视网膜神经细胞样细胞的研究

目的 研究室管膜下区细胞的体外培养及其诱导分化情况。方法 取新生0—3d的SD乳鼠室管膜下区细胞进行体外培养,同时培养视网膜神经细胞。收集视网膜细胞培养上清液,配制成条件分化液,将培养的室管膜下区细胞接种于视网膜细胞条件分化液中,并对诱导的细胞进行免疫荧光鉴定。结果体外培养的室管膜下区细胞在无血清的培养基中生长良好,接种于SD乳鼠视网膜细胞条件分化液中的室管膜下区细胞可分化为视网膜神经样细胞。应用,Thyl.1单克隆抗体行免疫荧光检查,细胞呈阳性反应。结论 在一定条件下室管膜下区细胞能够于体外培养存活,视网膜细胞条件分化液可定向诱导室管膜下区细胞分化为视网膜神经节细胞样细胞,体外模拟眼内环境行室管膜下区细胞诱导,将为进一步的眼内移植提供理论依据。     

成人睫状体-视网膜区域神经巢蛋白阳性细胞的分布特征

目的探讨成人眼睫状体-视网膜区域神经巢蛋白nestin阳性细胞的分布特征。方法由广东省眼库提供8只新鲜瘁死的健康成人眼球和3只婴儿眼球,分别采用免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等方法检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白nestin在睫状体、视网膜中的表达,通过透射电镜观察其超微结构和分布特点。结果睫状体、视网膜中均有少量nestin阳性细胞表达,其散在分布于睫状体色素上皮层和视网膜内核层靠近外核层的一侧;RT-PCR检测到睫状体、视网膜中均有nestin基因mRNA的表达,睫状体中的表达量高于视网膜区域;透射电镜观察可见睫状体和视网膜组织中均存在一些核大而圆、核仁明显、细胞器较幼稚的具有神经干细胞特征的细胞,位于睫状体色素上皮靠近基底膜的区域及视网膜内核层与外核层之间。结论成人睫状体-视网膜中存在一些具有神经干细胞特征的神经巢蛋白nestin阳性细胞,主要分布于睫状体色素上皮层和视网膜内核层。     

红景天苷对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化应激损伤的保护作用

目的:探讨不同浓度红景天苷对H2 O2诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelium cells,HLEC)氧化损伤的影响.方法:HLEC传代培养,分为4组:对照组:以正常培养液培养;氧化损伤组:100μmol/L的H2 O2作用12h;红景天苷低浓度组:10μmol/L红景天苷预处理24h后,加入H2 O2作用12 h;红景天苷高浓度组:100μmol/L红景天苷预处理24h后,加入H2 O2作用12h.应用MTT法观察红景天苷对HLEC细胞活力的影响;倒置显微镜下观察并记录各组细胞形态变化;DCFH-DA荧光探针检测胞内ROS含量的变化;分光光度计检测细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量.结果:红景天苷能明显抑制H2 O2诱导的HLEC细胞活力下降,抑制细胞内ROS生成,引起HLEC内SOD、GSH-Px水平的升高及MDA水平的下降.结论:红景天苷通过降低细胞内MDA产生,提高细胞内SOD、GSH-Px含量抑制H2 O2诱导的HLEC损伤,提示红景天苷可能在HLEC损伤的治疗中具有保护作用.     

大麻素对牛眼小梁细胞增殖、粘附和迁移的影响

目的:通过研究内源性大麻素物质(anandamine,AEA),对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖、黏附以及迁移功能的影响,探讨AEA降低眼压的机制。方法:对牛眼小梁细胞进行体外原代培养及传代培养,应用免疫组化的方法(NES,Ⅷ因子相关抗原染色)鉴定细胞,化学及透射电镜观察。对3代牛眼小梁细胞分别以含AEA10,1,0.1,0μmol/L DMEM(含100ml/L小牛血清)培养液进行干预,分别于24,2h,2h后用MTT法计数细胞,再利用计算机统计软件进行数据分析,观察其对牛眼小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能的影响。结果:内源性大麻素,在一定浓度范围内,对体外培养的牛眼小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能均有较为明显的抑制作用(P<0.05)。结论:由此,可以了解到AEA可能是通过影响小梁细胞的增殖、粘附及迁移功能来改变房水流出途径的阻力,而降低眼内压。     

Characterization of free-floating spheres from human trabecular meshwork (HTM) cell culture in vitro

It has been observed in several tissues that direct isolation of cells in serum-free media and on nonadhesive substrates results in the formation of spherical clusters of cells known as free-floating spheres. Such free-floating spheres have been hypothesized to contain undifferentiated multipotent progenitor cells. Our goal was to isolate and characterize such free-floating spheres from HTM cell primary cultures. For this purpose, HTM cells were incubated in serum-free media and on a nonadhesive substrate. Individual free-floating spheres generated in these conditions were isolated in 96-well plates, and their proliferative capacity was evaluated by monitoring their size increase over time. The expression of the TM markers, MGP and CHI3L1, was examined using recombinant adenoviruses containing the respective promoters. Morphology of the free-floating spheres was analysed in semithin sections, and the gene expression profile was obtained using Human Genome U133 Plus 2.0 Affymetrix microarrays. HTM cells incubated in serum-free media and on nonadhesive substrate generated free-floating spheres that could be grown for more than 3 months. Addition of serum to the culture media promoted the attachment of the spheres to the substrate, migration of cells from the spheres, and differentiation into cells phenotypically similar to normal TM cells. Gene profiling analysis demonstrated strong similarities between the gene expression profiles of the spheres and HTM cell monolayers. Both infection with the recombinant adenoviruses and gene array analysis demonstrated the expression of CHI3L1 and MGP, indicating that free-floating spheres likely originate from HTM cells. Gene array analysis also showed expression of the marker for neural precursor cells nestin, as well as leukemia inhibitory factor, a gene involved in the maintenance of the undifferentiated state of progenitor cells. Analysis of semithin sections indicated that these TM free-floating spheres were highly dynamic structures demonstrating a distinct radial gradient of cell proliferation, survival, and apoptosis. Extensive up- and down-regulation of gene expression was associated with the processes of sphere attachment and cell migration after the addition of serum. These results suggest that HTM primary cultures might contain relatively undifferentiated or progenitor cells. The availability of TM progenitor cell cultures could constitute a useful tool to investigate cell therapy approaches targeting the TM in glaucoma.