利用肠激酶加工融合蛋白的方法制备rhIL-11

本研究探讨利用肠激酶加工融合蛋白的方法制备重组人白细胞介素11（rhIL-11）的工艺条件与参数。融合表达载体pET32a／IL-11在大肠杆菌E.coli B121（DE3）pLysS中诱导表达，裂解上清以Ni-NTA亲和纯化，通过DsbA-EKL-（His）。的自催化切割完成单体活性肠激酶催化亚基的释放，继而对Trx-IL-11行使酶促切割作用制备rhIL-11。结果表明：亲和纯化得重组融合蛋白Trx-IL-11 11.25mg／g湿菌，产品纯度达89.2％，回收率为91．8％。酶切体系经Ni-NTA resin充分吸附后．目标产品单体rhIL-11纯度大于95％。结论：利用肠激酶加工融合蛋白以制备rhIL-11的方法简单可行．分离纯化效果好，能够满足工业生产的需要。     

单链抗体分子与链亲和素融合蛋白的制备

研究了抗人纤维蛋白单链抗体分子scFV-8E5与链亲和素融合蛋白的制备。链亲和素拼接在scFV-8E5 cDNA的3’端,制备的融合蛋白单体分子量约45kD。表达产物少数为周质间可溶型蛋白,多数为包涵体。无论是可溶型的蛋白产物或从包涵体中回收并复性的蛋白产物均有结合人纤维蛋白和生物素的功能。这个双特异性融合蛋白的成功制备证明了在scFV-8E5的3’端拼接其它效应分子的可行性。     

改良型TAT-VP3融合蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达、纯化改良型TAT-VP3融合蛋白,并制备其多克隆抗体。方法利用原核表达载体PGEX-6P-1/改良型TAT-VP3在大肠杆菌Rosetta（DE3）中表达,经GST标签纯化树脂纯化蛋白,并用PreScission Protease酶切除标签,以纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,获得改良型TAT-VP3融合蛋白的多克隆抗体。用ELISA进行效价检测,Western blotting鉴定其特异性。结果诱导表达并纯化了改良型TAT-VP3融合蛋白,纯度大于90%,蛋白浓度为1.2mg/ml。制备了该蛋白的多克隆抗体,ELISA表明多克隆抗体效价为1：32000,Western blotting证明多克隆抗体的特异性良好。结论成功纯化出改良型TAT-VP3融合蛋白,并制备出高效价、高特异性的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白的体内外抗肿瘤活性及作用机制奠定了基础。     

hDaxx融合蛋白在原核细胞中表达与纯化

目的：GST－hDaxx融合蛋白在原核细胞中表达并纯化，以便进一步在体外探讨hDaxx的生物学活性。方法：构建GST－hDaxx融合蛋白原核细胞表达载体pGEX-4T/hDaxx，在大肠杆菌（E.coli）中用异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。表达产物用亲和层析柱加以纯化后，Western blot鉴定表达产物及其纯化物。结果：pGEX-4T/hDaxx能用IPTG在E.coli中诱导表达GST－hDaxx融合蛋白。结论：原核细胞表达了GST－hDaxx融合蛋白。     

哺乳动物极性蛋白mInscuteable-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达与纯化

目的:构建哺乳动物极性蛋白mInscuteable C末端257～532位氨基酸结构域与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合蛋白GST-mInsc 257～532的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法:将已经构建好的mInsc 257～532位氨基酸序列克隆至原核表达载体pGEX-4T中,构建重组的质粒pGEX-4T/mInsc 257～532;将重组质粒转化感受态细菌BL21,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST蛋白;经谷胱甘肽-琼脂糖球珠分离纯化;产物经SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定。结果:获得高表达及纯化的pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白。结论:成功构建重组pGEX-4T/mInsc 257～532原核表达载体;诱导表达pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白并纯化。     

新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的分离纯化

为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线，比较了不同组合的纯化策略和条件，包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等，并采用MTT法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性。结果表明，在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈．结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性，从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀。在蓝染料亲和层析一步分离中，由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多，极难区分目的蛋白和杂蛋白。但是，PRSETA—B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10，可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸，这十分有利于通过Ni—NTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物。根据这一特性，经反复筛选实验设计最终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线，用于纯化分离B7—2-PE40KDEL融合蛋白。所得的目的蛋白的纯度可达95％以上，总回收率为8％。Western—blot实验显示，所得蛋白可与B7-2及PEA抗体特异性结合；MTT生物活性测定表明，该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用，而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用。结论：建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线，所纯化的重组B7—2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞。     

新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的理化分析

为了对构建成功的新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白的部分物化表征进行分析鉴定，采用Edman法、SDS-PAGE法、胰蛋白酶消化的MALDI—TOF—MS质谱法、蛋白印迹法和MTT法分别测定该融合蛋白的N-末端6个氨基酸、相对分子量、肽谱、抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性。结果表明：所构建表达纯化的新型重组IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白N末端6个氨基酸序列为Met—lie—Asp—Lys—Gin—Ile-，而IL-6缺失24个氨基酸后的原序列为Ile—Asp—Lys—Gin—Ile-，由于采用了大肠杆菌表达系统，因此在N末端第1位多出了1个Met，经12％SDS-PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算，其相对分子量为58．75kD，与理论值56．9kD相比误差在5％之内。MALTI—TOF—MS质谱测定共获得10个与理论预测值相符的肽段，经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索证明，在分子量为57kD左右的范围内未检索到与上述务件相符的已知蛋白，证明本融合蛋白为全新蛋白，与预测的目的蛋白相符。WB实验显示IL6D24-PE40KDEL外毒素融合蛋白能与IL-6及PEA抗体特异性结合。MTT生物活性测定表明，该融合蛋白对表达IL-6R的多发性骨髓瘤细胞系U266产生特异性杀伤，而对不表达IL6R的CEM淋巴细胞系无任何杀伤。结论：所研制成功的重组IL6D24-PE40KDL外毒素融合蛋白的确为一全新的具有靶向杀伤生物活性的蛋白质，与设计的完全一致，同时也证实了构建策略的可行性。     

cTnI-linker-TnC融合蛋白基因的构建、表达及鉴定

目的重组及表达人cTnI-linker-TnC融合蛋白。方法应用PCR技术从人心脏cDNA文库分别扩增出cTnI和TnC基因,通过引物设计在两者之间加上19个中性氨基酸残基TS-(G4S)3-AC的linker编码序列,克隆PCR产物,并构建pET28a-cTnI-linker-TnC表达质粒,转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白的表达,NTA树脂亲和层析纯化后检测其纯度和免疫反应性。结果成功构建了cTnI-linker-TnC融合蛋白的基因,并在大肠杆菌中实现可溶性高表达,在摇瓶中的表达量为21 mg/L,经一步NTA树脂亲和层析纯化,获得条带单一的目的蛋白,采用进口全自动免疫检测系统鉴定证实,目的蛋白有较高的免疫反应性。结论采用原核表达方法可以获得具有高纯度和高免疫反应活性的cTnI-linker-TnC融合蛋白。     

重组人干细胞因子/血小板生成素融合蛋白的纯化及复性研究

目的　探讨重组人干细胞因子/血小板生成素(SCF TPO)融合蛋白纯化及复性的最佳方法。方法　裂解 法提取包涵体,在变性条件下利用金属螯和层析获得融合蛋白,经透析及谷胱甘肽氧化还原法对纯化的融合蛋白进 行复性。结果　获得具有初步生物学活性的SCF TPO融合蛋白,其纯度高达90%。结论　该纯化方法操作简捷, 特异性高,纯化效果好,获得率高。     

水蛭素融合蛋白研究进展

水蛭素是一种高效特异的凝血酶抑制剂，临床上用于血栓病的预防和治疗，但它半衰期短、出血副作用强和功能单一。近年来，通过把水蛭素与某些功能蛋白融合表达来解决这些问题，得到的融合蛋白或在体内延长水蛭素的半衰期，或降低其出血副作用，或带来新的功能，如：溶栓、抑制血小板凝集、特异寻靶等。本文对近年来国内外水蛭素融合蛋白研究状况进行综述。     

重组人白细胞介素11对正常及骨髓抑制小鼠的促血小板生成作用

本试验的目的是观察国产重组人白细胞介素11(rhIL-11)皮下注射对正常小鼠和骨髓抑制小鼠的血液学效应.给正常小鼠rhIL-11 200及400μg/kg皮下注射,连续7天,第5天时外周血血小板数轻度升高,起效较平缓,停药后血小板数可在4天内恢复到给药前水平.对骨髓抑制小鼠,rhIL-11的治疗可明显地减轻外周血小板计数的下降程度,促进血小板计数的恢复.rhIL-11在每天100-400μg/kg时对骨髓抑制小鼠均有良好疗效,治疗13-15天血小板计数恢复到照射前水平,在每天400μg/kg时起效稍快于100及200μg/kg.上述3个剂量所引起的血小板最大升幅十分接近.rhIL-11的升血小板作用与其促进骨髓巨核系祖细胞的增殖与成熟有关.上述结果表明,rhIL-11治疗无论对正常小鼠还是骨髓抑制小鼠均可提高外周血血小板数,提示rhIL-11可能是一种治疗血小板减少症的药物.     

重组人白细胞介素11对正常及骨髓抑制小鼠的促血小板生？…

本试验的目的是观察国产重组人白细胞介素１１（ｒｈＩＬ－１１）皮下注射对正常小鼠和骨髓抑制小鼠的血液学效应。给正常小鼠ｒｈＩＬ－１１ ２００及４００μｇ／ｋｇ皮下注射,连续７天,第５天时外周血血小板数轻度升高,起效较平缓,停药后血小板数可在４天内恢复到给药前水平。对骨髓抑制小鼠,ｒｈＩＬ－１１的治疗可明显地减轻外周血小板计数的下降程度,促进血小板计数的恢复。ｒｈＩＬ－１１在每天１００－１００μｇ／ｋ     

重组人白细胞介素11对卡铂致猕猴血小板减少症的治疗作用

观察国产重组人白细胞介素１１（ｒｈＩＬ－１１）对卡铂致猕猴血小板减少症影响。成年猕猴每天静脉注射卡铂（１５ｍｇ／ｋｇ），连续３天。第３次注射卡铂后１８小时内开始皮下注射ｒｈＩＬ－１１（每天为５０或１００μｇ／ｋｇ），连续用药１４天。给药后定期检测外周血白细胞计数、网织务小板计数、血小板聚集功能和骨髓的集落形成和病理组织学变化等。结果发现，ｒｈＩＬ－１１能显提高注射卡铂猕猴的血小板计数最低值和缩短     

重组人白细胞介素11对卡铂所致猴血小板减少症的治疗作用

用卡铂建立的猴骨髓抑制模型观察国产重组人白细胞介素１１（ｒｈＩＬ－１１）对血小板减少症的治疗作用。给予模型动物ｒｈＩＬ－１１ ５０或１００μｇ／ｋｇ皮下注射,连续１９天。给ｒｈＩＬ－１１治疗的猴血小板计数从第８天开始下降,在第１２－１４天达最低点,其下降程度远低于模型动物。ｒｈＩＬ－１１治疗后１１－１３天血小板计数开始回升,１３－１５天达到或超过建立模型前水平,停药后血小板数继续升高,并维持在高水     

rhIL—11对照射所致骨髓抑制猕猴的治疗作用

本研究观察了rhIL-11对γ线照射后猕猴血小板和白细胞减少症的治疗作用,同时比较了不同时间给药对疗效的影响.用60Coγ射线3.0 Gy照射正常猕猴,造成骨髓抑制模型.照射后当天开始给予rhIL-1130,60或120μg@kg-1@day-1,连续14天皮下注射,可以显著提高给药猴外周血小板数的最低值,虽然白细胞数最低值并未上升,但低于照前值50%的时间明显缩短,这与血小板的变化相似.照射后当天开始给予rhIL-11治疗的动物在照射后开始的2周内红细胞数较对照组略有下降,但第3周即迅速上升并超过对照组.照射后第13天开始给予rhIL-11治疗的4只猴,在照射后前3周内外周血象与对照组相似,此后迅速恢复.骨髓细胞培养结果表明,rhIL-11治疗猴的骨髓细胞在体外形成CFU-Meg,CFU-Mix,CFU-E,BFU-E和CFU-GM能力明显增加.照射后第45天病理组织学检查结果表明,照射对照组动物骨髓腔空虚并有明显出血,治疗组动物骨髓腔中细胞丰富,生长旺盛.这些结果表明,rhIL-11可以促进照射猕猴造血的恢复.     

术前应用重组人白细胞介素-11改善肝硬化并脾功能亢进患者血小板减少

目的探讨术前应用重组人自细胞介素-11（rhIL-11）改善肝硬化并脾功能亢进患者血小板减少的疗效和安全性，以减少围术期血小板的输注。方法将乙肝肝硬化并脾功能亢进准备行脾切除术治疗的患者（n=45）分成A、B两组，A组（n=23）术前注射rhIL-1150μg·kg^-1·d^-1，共10d；B组（n=22）使用安慰剂。比较两组血小板计数变化、血小板输注情况、脾切除术后血小板增高发生率，肝、肾功能指标，门静脉血栓形成率，不良反应发生率。结果用药后A组血小板计数显著高于B组，A组血小板输注频率及输注量低于B组，两组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；术后血小板增高发生率A组12．5％，B组16．2％，差异无统计学意义；术后各项肝酶学指标恢复均未受影响；门静脉血栓形成率A组18．6％，B组21．4％，差异无统计学意义；红眼、关节痛、局部疼痛的发生率A组高于B组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论乙肝肝硬化并脾功能亢进患者术前应用rhIL-11可有效提高血小板计数，减少围术期血小板输注量，对术后肝功能无显著影响，     

重组人白细胞介素11加速无血缘关系脐血移植血小板植入的临床研究

目的观察重组人白细胞介素11（rhIL—11）加速无血缘关系脐血移植血小板植入的情况。方法9例患者中成人6例，儿童3例。接受HLA0～2个位点不合的脐血移植。成人给予双份脐血移植，儿童给予单份脐血移植。预处理采用BU／CY或CY／TBI方案，同时加用抗胸腺细胞球蛋白（ATG）。采用环孢素联合短疗程甲氨蝶呤预防移植物抗宿主病（GVHD）。移植后1天开始皮下注射rhIL-1150mg·kg^-1·d^-1和G—CSF5mg·kg^-1·d^-1促进造血重建。结果9例患者平均年龄22．3岁，平均体重52．3kg。9例患者8例白细胞植入，中性粒细胞〉0．5×10^9／L的中位时间为21．3（14～37）天；7例患者血小板植入，血小板〉20×10^9／L的中位时间为25（18～36）天。急性GVHD（aGVHD）发生率为42．9％，均为Ⅰ度。慢性GVHD（cGVHD）发生率为33．3％，为局限型。死亡3例，死亡主要原因为感染。存活的6例患者，中位随访时间为7个月，均为无病存活。预计1年总生存率为77．8％，2年总生存率为52．2％。使用rhIL-11的8例患者中5例（62．5％）出现渗漏综合征。所有患者在采取包括紫草的综合防治措施后均可耐受rhIL-11的治疗。结论rhIL-11可能有利于加速血小板的植入，降低严重aGVHD的发生率。渗漏综合征是主要的不良反应，在采取包括紫草的综合防治措施后患者耐受较好。     

GST-CML28融合蛋白的表达和纯化及多克隆抗体制备

本研究探讨GST-CML28融合蛋白的表达及抗体制备。CML28-pGEX-3X重组质粒转化BL21大肠杆菌,提取细菌蛋白后用GSTrap FF纯化柱进行纯化。将纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备CML28抗血清;免疫血清用CNBr-activated Sepharose 4B层析柱进行纯化,获得多克隆抗体。结果表明,获得的抗体能够满足针对CML28的ELISA、Western blot、免疫组织化学和量子点荧光检测的实验要求。结论:成功制备了高特异性,高效价的抗人CML28多克隆抗体,为今后深入研究其生物学功能提供了有用的实验工具。     

白介素-11治疗肝硬化所致血小板减少症

目的观察白介素11(rhIL11)治疗肝硬化血小板减少的疗效与毒性。方法对照组24例肝硬化血小板减少病人,常规给予止血、氨肽素治疗;治疗组18例应用白介素11皮下注射治疗,平均用药10d。观察血小板升高情况及副作用。结果对照组血小板均无明显升高;治疗组白介素11应用5d内血小板开始升高,平均20d达最高峰;主要副作用为浮肿、乏力、头痛头晕、肌肉关节疼痛。结论白介素11能有效治疗肝硬化所致的血小板减少,血小板计数回升相对缓慢,作用持续时间较长,耐受性好。