机械分离并培养螺旋神经节神经元方法的建立

目的　建立机械分离并培养小鼠耳蜗螺旋神经节神经元 (SGN )细胞模型的方法。方法　对出生后1～ 6 d的小鼠耳蜗螺旋神经节组织进行机械分离和培养 ,用倒置相差显微镜对原代培养的 SGN细胞的形态学和轴突生长情况进行观察 ,并应用荧光显微镜对 SGN进行免疫细胞化学染色鉴定。结果　新生小鼠 SGN在机械分离、体外培养条件下 ,可以获得良好的细胞形态和轴突再生能力 ,其存活细胞的数量为 (78.10± 4 .33) / cm2 (5～ 7d) ,生长周期为 7～ 14 d。结论　成功建立了机械分离并培养 SGN细胞模型的方法 ,SGN存活细胞的数量和周期可以满足体外多种实验的需要。     

大鼠皮质神经元的体外培养和纯化

目的：探讨大鼠皮质神经元分离纯化的有效方法。方法：取胎鼠大脑皮质细胞，分别在不同的培养液中进行原代培养，利用相差显微镜对培养的细胞进行动态观察；并以免疫细胞化学技术对神经元进行染色。结果：在相差显微镜下可见加用N2添加剂和胎牛血清培养的神经元生长良好，胞体形态多样，突起数目多，长度长，与邻近神经元的胞体或突起形成接触，而胶质细胞则大量死亡，神经元纯化率达94％以上，未加用N2添加剂培养的神经元胶质细胞大量存在，神经元纯化率达50％左右。结论：N2添加剂和胎牛血清联合应用可使大鼠皮质神经元得到良好的生长和有效纯化。     

胚胎大鼠背根神经节神经元的原代培养

目的 原代培养胚胎大鼠背根神经节神经元(DRGn),并观察其生长特性。方法 取E15 SD胎鼠的背根神经节,用胰蛋白酶消化法分离成单细胞,通过密度梯度离心法和差速贴壁法进行分离纯化,在无血清培养基中培养,用抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体鉴定神经元。结果 纯化培养神经元生长状态良好,纯度可达93%左右。结论 该方法具有较好的可操作性和可重复性,用于DRGn的相关实验研究。     

原代培养新生大鼠海马神经元实验技术的建立

目的：摸索应用适合培养条件获取新生大鼠海马神经元的技术方法。方法：采用较低浓度、短时的酶消法配合应用含B-27的特殊培养基培养海马神经元细胞。结果：培养出的新生大鼠海马神经元结构特征明显且生长良好,有较高纯度。结论：本方法可以稳定地获得较高纯度的新生大鼠海马神经元。     

出生后大鼠螺旋神经节神经元形态学研究

目的 证实出生后第2周是大鼠耳蜗螺旋神经节神经元发育的关键时刻。方法 选用60只出生后1—49d(postnatal day 1 to 49,PND l—49)的SD大鼠(分为10组)和6只成年(4月龄)SD大鼠。取平行蜗轴的中轴切片,光镜下观察螺旋神经节神经元形态;通过形态学测量神经元细胞面积、细胞核面积、Rosenthal隧道截面积并计数神经元,计算核浆比和细胞密度。结果 PND l—14大鼠神经元细胞面积逐渐增大;PND l—3大鼠细胞核面积较小,此后无明显变化趋势;PND 7大鼠细胞密度和核浆比明显下降,PND l4大鼠核浆比有明显下降。发育最早从钩回开始,逐渐向顶回发展。结论 出生后第2周是大鼠耳蜗螺旋神经节神经元发育的重要阶段。     

分离培养大鼠背根神经节神经元的一种优化培养基

目的 在含胶质细胞源性神经营养因子(glial-derived neurotrophic factor,GDNF)的NB1中建立胚胎大鼠背根神经节神经元分离培养体系。方法 取E15大鼠背根神经节,采用原代分离培养方法制成单细胞悬液,接种在含GDNF的NB1中培养,观察神经元的体外生长情况。结果 培养的背根神经节神经元可存活3～4周,并长出突起,形成密集的网络,神经元纯度较高。结论 神经元在优化的NB1培养基中生活状态良好。     

出生后大鼠螺旋神经节神经元损伤的病理变化

目的 证实出生后第2周大鼠螺旋神经节神经元对耳毒性药物敏感。方法 选用出生后7d SD大鼠36只,连续14d肌注新霉素,每天150mg／kg,分别于停药后1、7、14、28d、3月和6月各处死6只。取平行蜗轴的超薄切片,透射电镜下观察底回、中回螺旋神经节神经元。结果 大鼠螺旋神经节神经元变性继发于毛细胞和支持结构的损伤;停药1d组存在细胞凋亡现象;损伤早期神经元发育延迟,损伤晚期神经元由成熟向未分化型改变。结论 出生后第2周是大鼠螺旋神经节神经元发育的重要阶段,此阶段对药物的敏感性高。     

小鼠螺旋神经节神经元的分离和A型钾通道的电生理特性

目的机械分离并酶解小鼠耳蜗螺旋神经节神经元(SGN)细胞,观察其A型钾通道的电生理特性。方法对生后1～6d的小鼠耳蜗螺旋神经节组织进行机械分离并酶解,对SGN进行免疫细胞化学染色鉴定,并利用全细胞膜片钳技术记录和分析A型钾通道电流。结果新生小鼠SGN在机械分离和酶解条件下,可以获得良好的细胞形态。SGN的A型钾通道在-60mV时激活,+40mV时失活,能被细胞外的4-氨基吡啶阻滞。结论成功建立了机械分离并酶解SGN细胞的方法,SGN的A型钾通道具有激活快、失活快的特点。     

新生大鼠海马神经元原代培养及钾离子通道特性研究

目的建立大鼠海马神经元原代培养方法,记录钾电流并观察其特性。方法无血清培养法进行海马神经元原代培养,从形态学和电生理学方面鉴定细胞活性;全细胞膜片钳技术记录钾电流,从药理学和动力学观察钾通道特性。结果经5～7d培养,获得胞膜完整、胞质均匀的海马神经元,并记录到典型的全细胞电压依赖性钾电流(IK)、延迟整流钾电流(IKDR),IK和IKDR均为外向电流,激活电压分别为-50mV和-40mV,随着去极化程度增加而增加,能被已知的钾通道的阻断剂4-AP和TEA-Cl阻断,IK和IKDR的半数最大激活膜电位(V1/2)分别为(22.1676±2.1778)mV(n=6)和(17.8457±1.7767)mV(n=6),斜率因子(κ)分别为(-6.1541±3.0541)mV(n=6)和(-6.5193±2.1894)mV(n=6)。结论在该实验条件下培养的海马神经元形态和生理特性良好,较好的表达了电压依赖性钾离子通道特性,适合电生理研究。     

新生大鼠海马神经元的改良培养

探讨体外培养高纯度神经元的方法。方法：体外培养新生大鼠海马神经干细胞,再使神经干细胞在无血清N2添加剂培养基条件下向神经元方向分化。结果：从新生大鼠海马组织培养出的神经干细胞,表达巢蛋白,神经干细胞的分化细胞绝大部分表达MAP2,极少数几个细胞表达GFAP。结论：通过本实验方法可获得高纯度的神经元,为后续实验奠定基础。     

新生大鼠前扣带皮层神经元的原代培养

目的建立新生大鼠前扣带皮层(ACC)神经元的体外培养方法,并进行纯度和生长状态检测。方法从新生鼠ACC分离出神经元,采用低浓度胰酶长时间消化、阿糖胞苷处理、差速培养等方法进行体外原代培养。在培养的第7天,应用兔抗大鼠微管相关蛋白2(MAP2)对培养的神经元进行纯度鉴定,利用微量滴定(MTT)法测定培养第7~12天ACC神经元的生长状态。结果从新生大鼠ACC分离的神经元,培养至第5天,可见多数细胞长出2个以上突起且呈多极形态并交织成网;第7天神经元有多种形式的接触,互相迁移靠拢,部分神经元聚集成团。MAP2细胞免疫荧光染色结果表明,ACC神经元阳性率大于80%,MTT结果显示,培养第7~9天的ACC神经元可保持较好的生长状态,之后细胞活性降低。结论新生大鼠ACC神经元可进行体外原代培养,纯度和活力检测表明,培养第7~9天的神经元可作为ACC神经元相关研究的体外细胞模型。     

新生大鼠小脑颗粒神经元原代培养与鉴定

目的:建立一种较为理想的小脑颗粒神经元原代培养方法。方法:取新生5~7天SD大鼠,分离小脑皮质,胰酶消化后差速贴壁,种植在预先涂有左旋多聚赖氨酸的培养板内,第3天加入阿糖胞苷纯化神经元;采用神经元特异性烯醇化酶免疫细胞荧光技术鉴定神经元。结果:细胞存活率达(98±1.07)%;24 h内基本贴壁;第3天细胞突起增多、变长;培养6~8天,细胞突起交织成网,形成典型的神经细胞网络;神经元特异性烯醇化酶鉴定神经元细胞占90%左右。结论:实验获取神经元纯度较高,是小脑颗粒神经元体外培养的一种较理想的方法。     

小鼠耳蜗螺旋神经节细胞Ih电流的研究

目的了解小鼠耳蜗螺旋神经节细胞超极化激活阳离子通道电流（Ih电流）的基本电生理学特性。方法应用全细胞构型电压钳制技术,采用不同的阻断剂,记录Ih电流。结果实验记录到了Ih电流,对BaCl2不敏感,但可被5mMCsCl抑制,冲洗后电流恢复,符合Ih电流的药理学特点,其反转电位为-40．5±7．2my,二分之一最大活化电压（V1／2）为-103．3mv,斜率（K）为10．5;在-160mv钳制电压条件下其活化过程符合二次幂方程,时间常数分别为66．2ms和403．7ms,不同部位之间Ih电流的活化时间常数无明显差异（P〉0．05）。结论Ih电流对不同部位耳蜗螺旋神经节细胞完成其功能所起的作用可能是相似的,但需要进一步的深入研究。     

新生大鼠大脑皮层神经元原代培养与鉴定

目的:建立一种较理想的新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法。方法:新生大鼠大脑皮层通过胰酶消化获取单细胞悬液,用台盼蓝染色鉴定活性后种板培养;培养第3~4天加入阿糖胞苷纯化神经元;最后用甲苯胺蓝染色检测尼氏体进行鉴定。结果:实验获取细胞存活率高;在体外培养条件下细胞生长旺盛,培养第6~7天,细胞胞体较大,突起粗,分支多,突起交织成网,并能形成典型的神经细胞网络;培养第10~14天,检查有尼氏体细胞占90%以上。结论:该培养技术是大鼠皮层神经元体外培养的一种较理想的方法。     

Neurotoxicity of quinolinic acid to spiral ganglion cells in rats

Our study investigated the neurotoxicity of quinolinic acid(QA) to spiral ganglion cells(SGCs),observed the protective effects of N-methyl-D-aspartate(NMDA) receptor antagonist MK-801 and magnesium ions on the QA-induced injury to SGCs,and analyzed the role of QA in otitis media with effusion(OME)-induced sensorineural hearing loss(SNHL).After culture in vitro for 72 h,SGCs were exposed to different media and divided into 4 groups:the blank control group,the QA injury group,the MK-801 treatment group,and th...     

老年大鼠耳蜗螺旋神经节Caspase-3、Calretinin的表达

目的探讨老年性聋的发病机制。方法建立D-半乳糖衰老大鼠模型,获取老年大鼠耳蜗标本并以正常青年大鼠作对照,用免疫组化SP法检测老年大鼠和青年大鼠耳蜗螺旋神经节Caspase-3,Calretinin的表达。结果老年大鼠耳蜗螺旋神经节Caspase-3,Calretinin的积分光密度明显高于对照组（P〈0．05）。结论老年大鼠耳蜗螺旋神经节Caspase-3、Calretinin含量升高。     

大鼠促红细胞生成素重组腺病毒载体的构建及其在大鼠SGNs中的表达

目的构建大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)重组腺病毒载体,并转染于体外培养的大鼠螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)。方法全基因合成大鼠EPO基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-EPO。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PacⅠ酶切线性化后电转化感受态细胞,获得重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO,经PacⅠ酶切后转染至293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。并转染至体外培养的螺旋神经元,免疫荧光检测及蛋白水平检测螺旋神经元中EPO表达。结果经KpnⅠ、HindⅢ酶切与测序鉴定显示,腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO构建成功,重组腺病毒AdEPO在293细胞中成功包装,扩增后病毒滴度为1.17×1011U/ml;经RT-PCR和Western blot检测EPO在293细胞中成功表达。重组腺病毒载体AdEPO经鉴定均构建正确;免疫荧光及Western blot检测转染腺病毒后螺旋神经元中EPO表达显著增强。结论成功构建了EPO重组腺病毒载体,并成功转染螺旋神经元,可显著增强螺旋神经元中EPO表达水平。