miR-125a/TRAF6调控通路在破骨细胞分化中的作用研究

目的研究miR-125a在破骨细胞分化过程中的作用及其作用机制,方法单核细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB配体的受体激活剂(RANKL)诱导CD_(14)⁺PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD_(14)+PBMCs向破骨细胞分化。生物信息学运算预测miR-125a的靶基因以及结合于miR-125a启动子区域的转录因子。实时定量PCR法检测miR-125a以及其他相关基因的表达。过表达实验和抑制试验用于研究miR-125a在破骨细胞分化中的作用及其与靶基因之间的相互关系。荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合。结果(1)miR-125a表达在CD_(14)⁺PBMCs前体细胞高表达,随着诱导时间的延续逐渐下降,在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD_(14)+PBMCs前体细胞高表达,随着诱导时间的延续逐渐下降,在诱导第5天开始明显下降并在第15天达到最低值,表明miR-125a的表达在破骨细胞分化过程中呈现明显下降趋势。(2)miR-125a参与调控RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞分化,过表达miR-125a明显抑制了TRAP和NFATc1的mRNA表达和CD_(14)⁺PBMCs向破骨细胞的分化。(3)miR-125a直接作用于靶基因肿瘤坏死因子相关因子6(TRAF6),TRAF6是RANKL/RANK/NFATc1信号转导通路的转录因子,过表达miR-125a降低了TRAF6的蛋白表达水平,而TRAF6的mRNA水平无明显改变。结论 miR-125a通过作用于新的FRAF6/NFATC1/miR-125a负反馈调控环路在破骨细胞的分化中发挥了重要的调控作用,调控miR-125a的表达可能成为骨代谢疾病新的治疗靶点。     

破骨细胞分化中NFATc1/miR-125a作用通路的研究

目的研究破骨细胞分化中miR-125a受转录因子NFATc1的调控模式及其作用机制,寻找骨代谢疾病新的治疗靶点。方法单核细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子-κB配体的受体激活剂(RANKL)诱导CD_(14)~+外周血单核细胞(PBMCs)向破骨细胞分化。生物信息学运算预测结合于miR-125a启动子区域的转录因子,过表达实验和抑制实验用于研究转录因子对miR-125a在破骨细胞分化中表达的影响,荧光素酶报告基因实验验证miR-125a与其靶基因之间的结合,凝胶迁移电泳实验(EMSA)和染色质免疫沉淀实验(CHIP)验证转录因子与miR-125a启动子区域的结合。结果凝胶迁移电泳和染色质免疫沉淀实验证明了NFATc1结合于miR-125a的启动子靶位点。过表达NFATc1抑制miR-125a的表达;抑制NFATc1的表达则升高miR-125a的表达。结论 miR-125a在作用于其靶基因——肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6的同时受到转录因子NFATc1的负反馈调控,发挥其在破骨细胞分化中的调控作用。表明通过调控NFATc1的表达来改变miR-125a的表达,可能成为骨代谢疾病新的治疗靶点。     

miR-363在脆性骨折患者血中的表达及对MC3T3-E1细胞成骨分化及增殖的影响

目的研究miR-363在脆性骨折患者血中的表达及对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)成骨分化与增殖的影响。方法收集脆性骨折患者外周血,采用荧光定量PCR检测患者miR-363、矮小相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、连环蛋白β1(CTNNB1)和骨髓细胞瘤癌基因(MYC)表达。采用茜素红S染色与噻唑蓝检测过表达miR-363对细胞成骨分化及增殖的影响。采用双荧光素酶报告基因与Western blotting检测miR-363对Dickkopf相关蛋白1(DKK1)的调控作用。结果miR-363在脆性骨折患者外周血中的表达水平低于正常健康者,而术后1周、2周及4周外周血中的表达水平高于术前并呈上调趋势(P＜0.05);模拟物组MC3T3-E1细胞中miR-363表达水平高于阴性对照组(P＜0.05);模拟物组MC3T3-E1细胞矿化程度、RUNX2及OCN mRNA表达水平及1天、2天、3天光密度(OD)值高于阴性对照组(P＜0.05);DKK1是miR-363的靶基因,模拟物组MC3T3-E1细胞中DKK1蛋白表达水平低于阴性对照组,而CCND1、CTNNB1及MYC mRNA表达水平高于阴性对照组(P＜0.05)。结论miR-363可能通过调控靶基因DKK1与Wnt/β-catenin信号通路促进MC3T3-E1细胞成骨分化与增殖。     

miR-125b通过靶向抑制Smad4调控骨髓间充质干细胞成骨分化

目的: 研究miR-125b是否通过调控其预测的靶基因Smad4表达而调节骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化。方法: 构建Smad4 3'-UTR-荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告检测观察miR-125b对Smad4 3'-UTR-荧光素酶活性的影响;分离培养人骨髓MSCs,在MSCs中转染miR-125b mimics并进行成骨诱导,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western印迹检测Smad4表达水平;Smad4 siRNA转染MSCs并进行成骨诱导,通过检测碱性磷酸酶(AKP)活性及RUNX2 mRNA表达水平变化考察Smad4下调对MSCs成骨分化的影响。结果: 双荧光素报告检测显示miR-125b能特异性地与Smad4 mRNA的3'-UTR结合,抑制其荧光素酶活性(P<0.05)。过表达miR-125b能抑制MSCs成骨分化过程中Smad4表达水平。干扰Smad4表达能抑制AKP活性及RUNX2 mRNA表达水平,它能部分模拟miR-125b调控MSCs成骨分化的功能。结论: miR-125b通过抑制靶基因Smad4的表达调控MSCs成骨分化。     

hsa-miRNA-216a-5p在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中负性调控NPR3表达

目的:探讨hsa-miRNA-216a-5p(miR-216a)对人源性骨髓间充质干细胞(hMSC)成骨分化的影响并验证其对利尿钠肽受体3(NPR3)基因的靶向作用。方法:原代培养hMSC至第6代后诱导成骨分化;在分化第0、7和14天收集细胞,利用Real-time PCR验证miR-216a的正常表达;慢病毒介导外源性miR-216a在hMSC中高表达,经成骨诱导剂作用后,检测成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2(RUNX2)及成骨相关转录因子抗体(Osterix)表达;茜素红染色细胞鉴定基质矿化;经TargetScan预测NPR3基因为miR-216a的靶基因后,检测miR-216a对NPR3表达的影响;构建包含NPR3-3’UTR的荧光素酶表达质粒及其突变体,分别与miR-216a或阴性对照质粒共转染至HEK293细胞,通过测定荧光素酶表达推测miR-216与NPR3-3’UTR的结合关系。结果:在hMSC向成骨细胞分化第7天和第14天,miR-216a表达下降;高表达外源性miR-216a导致hMSC体外成骨能力下降,特异性成骨基因ALP、RUNX2和Ost...     

miR-802靶向Hnf1B抑制胰岛素分泌的作用研究

探究miR-802对于胰岛β细胞分泌胰岛素的影响及其作用机制。利用miR-802类似物及miR-802抑制剂分别在胰岛原代细胞及Min6细胞过表达或敲降miR-802；采用ELISA法检测miR-802对胰岛素分泌的影响；通过miRNA靶基因数据库预测、荧光素酶报告法和Western blot法确证miR-802的靶基因；最后开展功能回复实验阐明miR-802调控胰岛β细胞分泌胰岛素的作用机制。结果表明:在胰岛原代细胞和Min6细胞中过表达miR-802能抑制胰岛β细胞分泌胰岛素；qPCR和Western blot实验证明miR-802通过抑制靶基因肝细胞核因子1B(hepatocyte nuclear factor 1β，Hnf1B)的转录和翻译，从而抑制胰岛素的分泌。     

小鼠11β-HSD1基因过表达的前成骨细胞系的建立

目的:探索小鼠11β-HSD1基因过表达的前成骨细胞系的建立方法?方法:构建过表达小鼠11β-HSD1基因的慢病毒载体,包装?收集?纯化慢病毒,感染小鼠MC3T3-E1前成骨细胞系,用BSD(一种核苷抗生素)筛选出感染成功的细胞,荧光定量PCR及Western blot检测11β-HSD1过表达情况,诱导成骨分化后用茜素红染色法染色矿化结节?结果:成功构建了小鼠11β-HSD1基因过表达慢病毒载体,高效感染MC3T3-E1细胞系?荧光定量PCR及Western blot结果显示,11β-HSD1过表达病毒组细胞11β-HSD1 mRNA水平是空载病毒对照组的17.4倍,蛋白表达量比空载病毒对照组增加?茜素红染色结果表明慢病毒感染的细胞成骨分化良好,细胞正常成骨分化功能未受影响,11β-HSD1过表达细胞成骨分化减少?结论:本研究成功建立了过表达小鼠11β-HSD1的前成骨细胞系,为研究11β-HSD1对成骨细胞的具体作用提供了研究基础?     

miR-144-3p在大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达及其靶向调控作用

目的探讨在骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,miR-144-3p表达的生理功能和作用机制,并预测其靶基因,为成骨细胞 分化的深入研究提供实验依据。方法采用大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,并在体外诱导间充质干细的成骨分化,通过 qRT-PCR 检测成骨分化标志基因（Runx2, OCN）以及miR-144-3p 的表达;通过向BMSCs 株转染miR-144-3p mimic 以及 miR-144-3p inhibitor,检测miR-144-3p 表达对BMSCs分化的影响,并通过Western blot 以及qRT-PCR检测miR-144-3p 靶蛋 白在RNA水平以及蛋白水平的表达变化。结果在体外诱导BMSCs成骨分化过程中,成骨分化标志基因（Runx2, OCN）的 表达量逐渐升髙,而miR-144-3p 的表达量则逐渐降低,到诱导成骨第21 天表达水平最低;检测各组ALP活性发现,相比于 对照组miR-144-3p mimics 转染组ALP活性显著降低（P<0.05）,miR-144-3p inhibitor 转染组ALP活性显著升高（P<0.05）;运 用多种靶基因预测数据库TargetScan、microRNA.org和miRanda对miR-144-3p进行靶基因的预测分析发现,smad4最可能是 miR-144-3p的靶基因;qRT-PCR结果表明,smad4在各组中的表达水平差异无统计学意义（P>0.05）;Western blot结果显示,smad4 在miR-144-3p mimics转染组表达显著下降,在miR-144-3p inhibitor转染组则显著升高,相比于对照组差异均有统计学意义（P< 0.05）。结论miR-144-3p参与调控大鼠BMSCs成骨分化,其抑制成骨分化的功能是通过降低smad4转录后的表达水平来实现。     

miRNA-140-5p在人骨髓间充质干细胞成脂分化中的表达及其靶基因的预测

目的 筛选出人骨髓间充质干细胞(hMSCs)成脂分化中具有潜在价值的miRNA及其靶基因,为人类成骨细胞与脂肪细胞分化平衡调控机制的深入研究提供有力实验依据.方法 收集hMSCs成脂分化过程中的0、7、14、21 d的细胞样品,应用miRNA芯片和转录组测序(mRNA-seq)技术,分析4个点细胞中miRNA和mRNA的表达水平,并将miRNA与mRNA的表达趋势进行关联分析,聚焦具有研究价值的miRNA与mRNA相互调控关系,同时,采用TargetScan、PicTar和miRanda等数据库进行靶基因的预测.结果 发现miR-140-5p在成脂分化中表达量呈逐渐下降的趋势,而白血病抑制因子受体(LIFR)表达量呈逐渐升高趋势,二者呈现负调控的对应关系.同时经3个靶基因数据库预测,LIFR为miR-140-5p共有的靶基因.结论 miRNA-140-5p可能与人骨髓间充质干细胞的成脂分化密切相关,且通过调控其靶基因LIFR的表达而参与成脂分化.     

体外培养大鼠颌骨成骨细胞成骨及成血管相关因子表达检测

目的 探讨体外培养的大鼠颌骨成骨细胞成骨及成血管相关因子的表达情况。 方法 体外分离培养大鼠颌骨成骨细胞,采用碱性磷酸酶染色(ALP)与矿化结节茜素红染色对细胞进行鉴定。应用实时荧光定量聚合酶链反应及酶联免疫吸附法检测细胞成骨与成血管相关细胞因子的表达情况。 结果 体外培养的大鼠颌骨成骨细胞ALP及矿化结节茜素红染色均为阳性。颌骨成骨细胞在高表达成骨相关基因、Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原和骨钙素的同时,在蛋白及基因水平均高表达成血管相关细胞因子血管内皮生长因子、血管生成素1和成纤维生长因子2。 结论 颌骨成骨细胞在成骨分化的同时可通过分泌成血管相关细胞因子参与血管化调控。