MiR-101通过靶向RAP1B调节上皮间质转化并抑制乳腺癌的侵袭和转移

【目的】 探讨微小RNA miR-101在乳腺癌细胞转移与侵袭中的功能及靶点。 【方法】 首先通过脂质体转染的方法在MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞系中瞬时过表达miR-101模拟物,进而通过划痕实验、transwell迁移和侵袭实验来反映细胞运动能力的改变;然后应用荧光素酶报告基因分析技术和蛋白质印迹技术寻找并验证miR-101的靶基因。 【结果】 在功能学上miR-101的过表达可显著抑制MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01);在线软件预测RAP1B和RAB5A是miR-101的潜在靶基因;荧光素酶报告基因分析初步证明RAP1B是miR-101的靶基因;蛋白质印迹从蛋白质水平进一步验证RAP1B是miR-101的靶基因。 【结论】 在乳腺癌中,miR-101可以通过靶向RAP1B抑制细胞的侵袭和转移能力,这是miR-101作为一种特殊的基因调节因子,在乳腺癌的发生发展中起的重要作用之一。     

去乙酰化修饰调控瘦素诱导乳腺癌细胞增殖的分子机制

【目的】 研究去乙酰化修饰在瘦素(Leptin)诱导的乳腺癌细胞增殖过程中的调控作用。 【方法】 应用MTT法测定Leptin对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的诱导作用,并测定乳腺癌细胞活力、侵袭力及细胞周期的变化情况;实时定量PCR、蛋白质印迹法测定Leptin诱导后MDA-MB-231细胞周期关键因子及相关酶的表达情况;染色质沉淀法(ChIP)检测Leptin作用MDA-MB-231细胞后核心组蛋白H3、H4乙酰化水平变化情况。 【结果】 Leptin诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖呈现时间和剂量依赖性,1.25 nm (20 mg/mL)、24 h为Leptin最佳作用浓度和孵育时间;经Leptin处理后,乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡明显减少、活力增强,同时由G₁进入S期的细胞显著增多;荧光显微镜观察发现Leptin诱导后BrdU荧光染色增强,且主要集中在MDA-MB-231细胞核内;Transwell小室侵袭实验也显示细胞侵袭力增强;实时定量PCR及蛋白质印迹法检测 发现Leptin处理后的 MDA-MB-231细胞中与G₁/S 期限制点调控相关的细胞周期调控因子CDK2、cyclin E1以及与抑制细胞凋亡有关的Bcl-2均显著增加,细胞中HDAC酶活性增强,且与细胞周期G₁/S 期调控密切相关的HDAC1 mRNA及蛋白表达水平也明显增强;ChIP 实验发现Leptin处理后的乳腺癌MDA-MB-231细胞中GAPDH 启动子区域核心组蛋白乙酰化水平显著降低,而经HDAC抑制剂SAHA阻断后MDA-MB-231细胞p21WAF 1/CIP 表达水平显著提高。 【结论】 Leptin通过HDAC1的去乙酰化修饰抑制p21WAF 1/CIP的表达,激活细胞周期关键因子CDK 2、cyclin E1的表达,从而加速乳腺癌细胞周期G₁/S 期的进程。     

microRNA干扰抑制MTDH的表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨microRNA干扰技术沉默异黏蛋白（MTDH,metadherin蛋白）基因表达及对人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞增殖、转移、侵袭能力的影响。方法 将人工合成的针对MTDH基因的miRNA片段瞬时转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,通过Western blot法、RT-PCR法检测MTDH蛋白表达和MTDHmRNA;应用MTT检测法、划痕实验、Transwell实验检测抑制MTDH基因后对乳腺癌细胞增殖、转移、侵袭能力的影响。结果 MTDHmiRNA能有效抑制MTDH蛋白和MTDHmRNA表达,最佳抑制率分别为79.41%、80.56%（P<0.05）;经miRNA干扰的细胞,生长速度明显受到抑制（P<0.05）,侵袭迁移能力显著下降（P<0.05）。结论 MTDH miRNA瞬时转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞可明显抑制癌细胞中MTDH表达,沉默MTDH基因表达后可明显抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长增殖、侵袭迁移能力。     

荧光素酶基因标记乳腺癌细胞系鉴定

目的 利用三阴性人乳腺癌MDA-MB-231细胞,对稳定表达荧光素酶的细胞系MDA-MB-231-Luc进行功能评价及鉴定.方法 构建荧光素酶的HIV慢病毒载体,体外感染乳腺癌MDA-MB-231细胞,经嘌呤霉素筛选后得到稳定表达的细胞系,采用MTT法,利用Transwell侵袭模型,应用伤口愈合细胞划痕实验评价细胞增殖、侵袭和转移能力.结果 利用慢病毒转染的MDA-MB-231细胞能稳定表达荧光素酶,与亲本细胞相比,细胞的增殖、侵袭、迁移能力无显著影响(P>0.05).结论 慢病毒感染乳腺癌细胞能稳定表达荧光素酶,对MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭、转移能力无明显影响,为后续的小动物活体成像实验提供细胞模型.     

灭活仙台病毒Tianjin株诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡作用及其机制的研究

【目的】 研究紫外线灭活复制缺陷的仙台病毒Tianjin株致人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡作用及其机制。 【方法】 首先制备并鉴定紫外线灭活仙台病毒Tianjin株,然后用不同剂量灭活病毒感染MDA-MB-231细胞,24 h后,MTT法检测灭活病毒对MDA-MB-231细胞增殖的影响;Hoechst染色及AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞凋亡情况;JC-10染色流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞线粒体膜电位变化;分光光度法测定MDA-MB-231细胞内caspase-9、-8和-3活性;蛋白质印迹法检测MDA-MB-231细胞中Bcl-2、Bax、Cyt c、caspase-9、Fas、FasL、caspase-8和caspase-3蛋白表达水平。 【结果】 MTT检测显示灭活Tianjin株能够抑制MDA-MB-231细胞增殖,且呈剂量依赖性;Hoechst染色发现灭活病毒感染的MDA-MB-231细胞有明显形态学改变,细胞核呈致密浓染或碎块状致密浓染;AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞仪检测显示灭活病毒组细胞凋亡率呈剂量依赖性升高,JC-10染色流式细胞仪分析显示灭活病毒组细胞线粒体膜电位呈剂量依赖性降低,且与对照组比较均有统计学差异(P<0.01);caspase 活性检测显示灭活病毒组caspase-9、-8和-3活性均呈剂量依赖性升高, 与对照组比较有统计学差异(P<0.01);蛋白质印迹结果显示高剂量灭活病毒组(MOI 80)Bcl-2表达下调,Bax、Cyt C、Fas、FasL、活化caspase-9、-8和-3表达上调。 【结论】 灭活仙台病毒Tianjin株能够诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞发生剂量依赖性凋亡,其机制与线粒体内源性途径和死亡受体外源性途径密切相关。     

斯钙素2对乳腺癌细胞侵袭、转移的影响及其机制研究

目的 本研究探讨STC2对乳腺癌细胞侵袭转移的影响及其作用机制。方法 通过shRNA干扰降低231 HM细胞STC2表达观察纤维细胞形态,平板克隆实验统计分析克隆数;免疫共沉淀（CO-IP）进行检测相关蛋白的表达。结果 通过shRNA干扰降低231 HM细胞STC2表达之后,231 HM呈现出高转移特性的纤维细胞形态,同时细胞的侵袭转移能力增加;相反,在231细胞过表达STC2后细胞的侵袭、转移能力减弱。此外,降低231 HM细胞的STC2表达之后,与对照相比其抵抗射线诱导的凋亡能力增强,而过表达STC2后的231细胞抗射线诱导凋亡的能力降低。结论 STC2可能通过调节乳腺癌中PKC/Claudin-1通路进而调节EMT过程最终影响乳腺癌细胞的侵袭、转移能力。     

小檗碱抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞增殖及其与过氧化物酶体增殖物激活受体γ的关系

目的 探讨小檗碱对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 体外生长的影响及其与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的关系,以评价其在乳腺癌治疗中的应用潜力。方法 采用 MTT 法检测小檗碱对 MDA-MB-231 细胞的生长抑制效应;TUNEL 法检测细胞凋亡;联合 PPARγ拮抗剂 GW9662,分析小檗碱对 MDA-MB-231 细胞增殖的影响与 PPARγ受体的关系;实验同时采用罗格列酮作为阳性药进行平行比较分析。结果 小檗碱呈量-效和时-效关系抑制 MDA-MB-231 细胞生长,24 h 的半数抑制浓度 (IC₅₀) 为 0.21 μmol/L;小檗碱诱导 MDA-MB-231 细胞凋亡作用随药物浓度的增加而增强;PPARγ受体拮抗剂不能逆转小檗碱对细胞增殖的抑制作用。结论 小檗碱可明显抑制 MDA-MB-231 细胞生长,但与罗格列酮不同,其作用不通过 PPARγ受体介导;小檗碱诱导 MDA-MB-231 细胞凋亡的效应较罗格列酮更为显著;小檗碱可望成为治疗乳腺癌的有效药物。     

抗增殖蛋白TOB1影响乳腺癌细胞MDA-MB-231体外转移的作用研究

目的研究抗增殖蛋白家族成员TOB1对乳腺癌细胞MDA-MB-231体外侵袭与转移的生物学作用与机制。方法采用脂质体介导的质粒转染和G418筛选培养法获得稳定高表达TOB1的高转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231。通过人工基底膜侵袭实验和划痕实验检测TOB1过表达对MDA-MB-231细胞体外侵袭能力和转移能力的影响。采用super array基因芯片法检测TOB1引起的肿瘤转移相关基因表达的变化。结果与对照组相比,外源性TOB1高水平表达使MDA-MB-231的体外侵袭能力显著降低（P〈0.05）,同时抑制MDA-MB-231的体外迁移能力;TOB1表达水平的增加引起MDA-MB-231细胞中肿瘤转移抑制基因BRMS1表达的明显增加,同时显著抑制肿瘤转移相关基因HSP90、FXYD5、RHOC、S100A4等的表达（均P〈0.05）。结论 TOB1过表达抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的体外侵袭、转移,涉及的机制可能与TOB1对多种重要的肿瘤转移相关基因的表达调控有关。     

丝氨酸缺乏和p53依赖的代谢重构对乳腺癌细胞的影响

【立论依据】 丝氨酸对肿瘤细胞增殖具有重要作用。丝氨酸缺乏可导致肿瘤细胞氧化应激,对其增殖产生抑制。肿瘤抑制基因p53在抗氧化代谢中发挥不可或缺的作用,因此p53可帮助肿瘤细胞耐受丝氨酸缺乏。这与p53的抑癌功能是一对矛盾,利用此矛盾可为肿瘤治疗提供新的思路。 【设计思路】 选取p53突变或缺失的三阴性乳腺癌细胞系,给予丝氨酸缺失的培养环境,观察其增殖情况、相关基因和蛋白表达情况。以p53阳性的乳腺癌细胞和正常培养基作对照 【实验内容】 MDA-MB-157(P53 null)或HCC1937(P53 mutant)分别用不含丝氨酸的培养基(-SG)、加入丝氨酸的-SG、加入丙酮酸和GSH的-SG,进行72 h培养,每24 h用流式细胞仪检测细胞数量、细胞周期和细胞内ROS水平,酶标仪检测抗氧化能力、GSH和GSSG水平,Real-time PCR检测P53、PHGDH的mRNA转录,蛋白质印迹检测p53、PHGDH的蛋白表达。MCF-7(P53 wildtype)作为P53的阳性对照。 【材料】 MCF-7、MDA-MB-157或HCC1937、MEM培养液(HyClone SH30024)、丝氨酸、丙酮酸、GSH,相关的试剂盒和试剂。 【可行性】 已进行预实验,已实践过实验内容中提及的操作,已观察到MCF-7在丝氨酸缺乏时增殖先受抑制后恢复、细胞内ROS水平上升、PHGDH表达上升 【创新性】 p53对肿瘤细胞代谢的影响已成为研究热点。多数肿瘤中近一半存在p53基因的突变,丝氨酸在肿瘤增殖中的重要地位,使得丝氨酸、p53以及相关的信号调节通路和酶可能成为肿瘤治疗的新靶点。     

EphrinA2基因促进MDA-MB-231乳腺癌细胞迁移的初步研究

目的 在MDA-MB-231人乳腺癌细胞系中过表达EphrinA2基因,研究其对肿瘤细胞迁移能力的影响,并初步探讨其可能的作用机制。 方法 用脂质体法将EphrinA2真核表达质粒转染至MDA-MB-231细胞中,用Western blot法检测转染前后细胞中EphrinA2、E-Cadherin及p27/Kip1蛋白的表达;并用细胞疏散、细胞划痕及Transwell小室试验检测转染前后细胞迁移能力的变化;用Rac1抑制剂NSC23766抑制Rac1活性后用细胞划痕试验检测细胞迁移能力变化。 结果 转染EphrinA2后的细胞迁移能力更强,并且呈现出E-Cadherin及p27/Kip1蛋白表达下降;用NSC23766抑制Rac1活性能抑制EphrinA2介导的细胞迁移。 结论 EphrinA2能促进MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移,其机制可能与E-Cadherin和p27/Kip1蛋白下调及Rac1活性抑制有关。     

RNAi干扰WT1和Pax2表达对逆转肾小管上皮间充质转化的作用

 【目的】 探讨抑制肾小管上皮间充质转化(EMT)过程中胚胎发育关键基因WT1和Pax2的表达对EMT的逆转作用。【方法】 采用RNAi技术分别抑制WT1和Pax2。分别构建pshRNA-WT1和pshRNA-Pax2表达载体,采用脂质体转染技术,使质粒瞬时转染NEK52E细胞后用10 ng/mL IL-1α刺激细胞,分别提取不同时间点细胞的RNA和蛋白质,采用RT-PCR和Western blot检测细胞WT1、Pax2、Snail、上皮细胞标志E-cadherin和间充质标志α-SMA的mRNA和蛋白质的表达,并观察NRK52E细胞的形态。【结果】构建的pshRNA-WT1和pshRNA-Pax2表达载体可在转染细胞内发挥RNAi作用抑制WT1和Pax2基因的表达,抑制率分别为80.4 %和82.7 %。分别抑制WT1和Pax2基因后EMT过程受阻,α-SMA和Snail的表达显著减少,E-cadherin的表达无显著性变化,细胞形态未发生明显的成纤维化样改变。【结论】 WT1和Pax2基因是EMT中的关键基因,分别抑制胚胎发育关键基因WT1和Pax2均可使EMT受阻。阻断WT1和Pax2的表达有望中止EMT及肾纤维化的发生。     

肝刺激因子表达下调通过ERK促进肝癌细胞转移的研究

【目的】 肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)能促进肝细胞增殖、抑制肝细胞凋亡,是细胞内重要的存活因子。本课题组前期研究发现多种促癌因素可下调肝癌细胞中HSS的表达,其表达水平的降低可以促进肝癌细胞发生转移侵袭,但相关机制尚不明了。研究表明细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与肝癌转移,因此本研究旨在阐明HSS表达降低与EMT的关系并探究其中的分子机制。 【方法】 利用实验室已经构建好的稳定低表达HSS的HepG2细胞(shRNA)和稳定高表达HSS的HepG2细胞(HSS)作为研究对象,首先应用蛋白质印迹方法检测不同细胞的上皮细胞分子标志物(如E-cadherin和ZO-1)和间质细胞分子标志物(例如vimentin、fibronectin)表达的变化,确定HSS表达改变与EMT的关系;选择在EMT中发挥重要作用的激酶磷酸化抗体,利用蛋白质印迹的方法,筛选参与HSS表达下调诱导EMT发生的激酶,并应用特定激酶抑制剂,通过Transwell转移和侵袭实验,检测细胞迁移侵袭能力的改变,进一步确定候选激酶的作用;最后运用脾注射肝转移实验分析HSS表达下降与裸鼠生存率的关系。 【结果】 蛋白质印迹结果显示shRNA细胞的间质细胞分子标志物表达明显增高,上皮细胞分子标志物表达明显降低,说明HSS表达降低后肝癌细胞发生EMT。AKT和细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)在EMT的发生过程中具有重要作用,蛋白质印迹结果显示shRNA细胞中AKT磷酸化水平没有明显改变,但ERK的磷酸化水平明显增高;使用不同浓度的ERK抑制剂PD98059后进行trans-well迁移和侵袭实验,结果显示shRNA细胞无论迁出小孔还是穿过铺有基质胶的小孔的数目都明显减少,而且随着抑制剂浓度的增加,发生迁移侵袭的细胞数目随之减少,具有剂量依赖性,说明ERK在HSS表达降低诱导的EMT过程中具有关键的作用。脾注射shRNA细胞4周后,裸鼠体重明显下降,腹部变黑并明显增大,不足9周全部死亡,而注射HSS细胞后,裸鼠体重下降不明显,10周后才开始出现死亡,说明HSS表达降低后促进细胞的迁移侵袭使裸鼠生存时间明显缩短。 【结论】 肝刺激因子表达降低激活ERK,诱导肝癌细胞发生上皮-间质转化从而促进肝癌的转移。     

岩五加中具有抗癌转移活性的吲哚类生物碱的分离

[目的] 对岩五加（Tetrastigma obtectum）全植株进行植物化学研究,分离出2种新的吲哚类生物碱。[方法] 通过有机波谱解析鉴定结构,并以人乳腺癌细胞系MDA-MB-231为模型进行抗癌转移活性筛选。[结果] 分离得到2种新的吲哚类生物碱,分别为崖爬藤碱A（1）和崖爬藤碱B（2）。[结论] 在以人乳腺癌细胞系MDA-MB-231为模型进行抗癌转移活性筛选过程中,化合物1和2显示出阳性抗癌转移作用。     

MyoD对癌症骨骼肌转移的抑制作用研究

【立论依据】 国内外研究表明:(1)骨骼肌,淋巴管分布广泛,血供丰富,但未有癌症转移到骨骼内生长。(2) MyoD是骨骼肌成肌调节因子,有以下作用:让某些细胞转化为骨骼肌细胞。人工合成高亲和力的MyoD,可与分化抑制因子ID结合,抑制癌细胞增殖。预实验结果显示:骨骼肌细胞因子作用:(1)抑制癌细胞增殖; (2) 使癌细胞的生长形态变为梭状或细长状。 【设计思路】 猜想:MyoD是抑制癌细胞转移到骨骼肌内生长的内源性细胞因子。体外实验:(1)骨骼肌细胞与癌细胞共培养探索骨骼肌细胞对癌细胞的影响。(2)在癌细胞培养基中添加MyoD探索MyoD对癌细胞增殖及迁移能力的影响。(3)构建siRNA靶向沉默MyoD骨骼肌细胞株与癌细胞共培养探索其它细胞因子对癌细胞增殖的影响。体内实验:构建裸鼠肿瘤模型,肿瘤部位注射MyoD MyoD是内源性抑制肿瘤生长的因子。若实验假设不成立,则寻找新的细胞因子,进行新的探索。 【实验内容】 实验组:(1)在癌细胞培养基中添加MyoD。(2)骨骼肌细胞、siRNA靶向沉默骨骼肌细胞与癌细胞共培养24 h。(3)构建裸鼠肿瘤模型,往肿瘤部位注射骨骼肌细胞培养上清液、MyoD。对照组: (1)在癌细胞培养基中添加DMEM。(2)癌细胞与癌细胞共培养24h。 (3)构建裸鼠肿瘤模型,往肿瘤部位注射生理盐水。Brdu测细胞增殖率,流式、WB测蛋白表达,电镜、光学显微镜下观查细胞生长形态以及超微结构,称量体重等观察肿瘤生长。 【材料】 人骨骼肌细胞,人乳腺癌细胞(淋巴转移),人肝癌细胞(血道转移),人鼻咽癌细胞(高转移率),裸鼠。实验采用空隙为0.4 μm的Transwell嵌入式培养板。 【可行性】 本实验理论基础牢靠、前期研究充足,实验设计切合实际。 【创新性】 新思路、新分子,从骨骼肌转移癌低发生率出发,寻找内源性的癌症治疗分子或者靶点。     

虫草素对MDA-MB-231细胞增殖的影响与TMSG-1表达的研究

目的 研究虫草素对乳腺癌细胞株MDA-MB-231的作用与人肿瘤转移抑制基因TMSG-1mRNA表达的影响,探讨其抗癌作用机制.方法 体外培养乳腺癌细胞株MDA-MB-231,加入虫草素干扰,免疫组化技术检测TMSG-1蛋白表达;半定量RT-PCR检测MDA-MB-231细胞中TMSG-1mRNA表达状况;使用MTT法检测对肿瘤细胞增殖的抑制作用.结果 虫草素可使乳腺癌MDA-MB-231细胞中TMSG-1mRNA与蛋白表达上调,同时对乳腺癌细胞生长有抑制作用.结论 虫草素能抑制乳腺癌细胞的增殖,可以上调TMSG-1 mRNA与蛋白的表达发挥潜在的抗肿瘤细胞转移的作用,为国产新型抗肿瘤药物的临床研发及运用提供实验室依据.     

凋亡抑制蛋白ILP-2对乳腺癌细胞MCF-7氧化应激损伤的保护作用

【立论依据】 文献表明氧化应激会损伤体内核酸等生物大分子物质而促进肿瘤的发生发展;凋亡抑制蛋白ILP-2在生长中的乳腺癌有高表达,由此,我们猜想乳腺癌中高表达的ILP-2可能与氧化应激的损伤作用存在联系 【设计思路】 实验以乳腺癌细胞株MCF-7制备氧化应激的细胞模型,研究氧化应激状态下MCF-7内ILP-2的表达情况;RNAi ilp-2基因表达,分析ILP-2与氧化应激损伤之间的关系 【实验内容】 利用H2O2对乳腺癌细胞株MCF-7进行氧化应激造模,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),分光光度法检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平;通过瞬时转染敲低MCF-7 ilp-2表达,利用RT-PCR和蛋白质印迹法检测基因和蛋白质表达情况;干扰细胞ilp-2表达并同时进行氧化应激处理,通过MTT、Scratch、FCM等方法检测细胞的存活状态 【材料】 乳腺癌细胞株MCF-7,H2O2,转染试剂,RNeasy Mini Kit,QuantiFast Probe Assay,RIPA 裂解液,一抗,二抗,ROS试剂盒,GSH试剂盒,MDA试剂盒,MTT试剂盒等。 【可行性】 该研究内容所需技术在生物分子研究领域已经非常成熟,所需设备完善,可操作性强 【创新性】 首次研究ILP-2促癌细胞生长作用与氧化应激损伤之间的关系,为进一步阐明ILP-2的作用机制奠定基础。     

探究DLC1与RhoA-ROCK通路对乳腺癌淋巴道转移的影响

【立项依据】 转移是恶性肿瘤的基本特征,且癌细胞转移与细胞运动密切相关,而RhoA-ROCK通路可作用于肌球蛋白,参与细胞骨架重组,影响细胞运动。那么RhoA-ROCK通路与癌细胞转移是否有一定相关性呢?查阅相关资料得知,RhoA-ROCK通路确实能影响癌细胞转移,并可受DLC1调控抑制肝癌、胃癌、前列腺癌等恶性肿瘤的生长,另有文献报道,用real-time PCR方法分析DLC1的mRNA表达量在乳腺癌非转移细胞系中比高转移细胞系中多。由此我们猜想DLC1与RhoA-ROCK通路对乳腺癌转移可能产生一定影响。于是我们拟选择DLC1、RhoA作为测定指标,探究DLC1与RhoA-ROCK通路对乳腺癌淋巴道转移的影响。 【实验内容】 分别选取已发生淋巴结转移和未发生转移的乳腺癌病变组织标本各25例,应用免疫组织化学法和蛋白质印迹法检测DLC1、RhoA在两组标本中的表达,对实验结果进行分析。 【材料】 已发生淋巴结转移和未发生转移的乳腺癌病变组织标本,DLC1抗体,RhoA抗体,相关试剂盒。 【可行性】 (1)应用免疫组织化学法预实验结果显示,发生转移与未发生转移的乳腺癌病变组织比较:DLC1表达较少,RhoA表达较多,二者间差异有统计学意义,用spearman等级相关分析显示DLC1与RhoA间存在相关性,由此提示乳腺癌淋巴道转移与DLC1、RhoA-ROCK通路可能存在一定联系。(2)已有文献报道从理论上支持我们通过检测两组标本中DLC1、RhoA的表达来探究其与乳腺癌淋巴道转移的关系。 【创新性】 (1)学习《病理生理学》,获知RhoA-ROCK通路可影响细胞运动,而学习《病理学》,我们知道癌细胞转移是恶性肿瘤的基本特征,本课题将病理生理学与病理学知识相联系,由RhoA-ROCK通路影响细胞运动联想到乳腺癌淋巴道转移。(2)大量文献报道DLC1能通过抑制RhoA-ROCK通路发挥抑癌作用,但其是否会影响乳腺癌淋巴道转移的文献却未见发表。(3)经实验探究,初步认识到DLC1能通过抑制RhoA-ROCK通路而抑制乳腺癌淋巴道转移,若进一步探究DLC1抑制RhoA-ROCK通路的机制,将为临床上抑制乳腺癌淋巴道转移提供新的治疗靶点和理论依据。     

转染INPP4B基因对三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖的影响

目的 检测转染聚磷脂酰肌醇4-磷酸酶Ⅱ(INPP4B)基因对三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖的影响。方法 采用反转录PCR法、Western blotting印迹法检测INPP4B在三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231中的表达;通过慢病毒转染,使MDA-MB-231细胞表达INPP4B;实时定量PCR法检测转病毒后MDA-MB-231细胞INPP4B mRNA的相对表达量;Western blotting印迹法检测转病毒后MDA-MB-231细胞磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B (p-AKT)以及INPP4B的蛋白表达。CCK-8法、流式细胞术分别检测转病毒后MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及周期分布。结果 INPP4B在三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231中低表达;慢病毒转染使MDA-MB-231细胞INPP4B mRNA和蛋白的表达均上调,p-AKT蛋白的表达降低;转病毒后MDA-MB-231细胞增殖受到明显抑制,并阻滞于G0/G1期。结论 INPP4B基因能明显抑制三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖,并可通过影响PI3K/AKT信号通路发挥抗肿瘤作用。     

RNA干扰YAP基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响

目的 探讨RNA干扰YAP基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法 使用阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将靶向沉默YAP基因的siRNA序列转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中,采用qRT-PCR和Western印迹法分别检测转染后MDA-MB-231细胞中YAP基因及蛋白的表达水平,噻唑蓝(MTT)实验和细胞平板克隆实验检测转染前后细胞增殖的变化,Transwell小室和划痕实验观察转染对细胞侵袭及迁移的影响,流式细胞术评价转染后细胞周期及凋亡的变化情况。结果 转染siRNA后,YAP RNA和蛋白的表达量相对于空白对照及阴性对照组均明显下降(P<0.01)。MTT实验及细胞平板克隆实验显示,siRNA干扰YAP表达可以显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖活性;Transwell小室及划痕试验显示,siRNA干扰YAP的表达可以明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭及迁移能力;细胞周期实验显示,沉默YAP后,细胞周期出现G₀/G₁期阻滞,细胞凋亡检测证实沉默YAP后细胞凋亡率并未出现明显上升。结论 抑制YAP在乳腺癌细胞的表达可有效降低细胞的增殖、迁移和侵袭能力,改变细胞周期分布,但对细胞凋亡无明显影响。     

乳康饮及拆方对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖及凋亡的影响

目的 研究乳康饮及拆方对人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖抑制及诱导凋亡的作用。方法 采用乳康饮及拆方含药血清处理人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,分别在24、48、72h时间点,用cell counting kit-8（CCK-8法）检测乳康饮及拆方在不同时间点对MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用,FCM法（流式细胞术）检测乳康饮及拆方诱导MDA-MB-231细胞凋亡。结果 各组中药处理48h后,细胞增殖出现明显抑制,抑制率分别为46.05%、31.85%、41.24%,相对氟尿嘧啶组抑制作用时间有明显延迟,乳康饮组在48h与氟尿嘧啶组抑制率之间差异无统计学意义（P=0.076）。各处理组48h凋亡率分别为40.7%、16.3%、23.2%、57.5%,比空白对照组凋亡率显著增加（P<0.05）,乳康饮组与氟尿嘧啶组凋亡率差异无统计学意义,但高于拆方2组（P=0.000）。结论 乳康饮及其拆方能够显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,并诱导其凋亡。