靶向调控TOX3基因对乳腺癌细胞增殖及周期的影响

目的 研究TOX3基因对人乳腺癌细胞增殖能力及细胞周期的影响。方法 采用Western blot法检测已构建的稳定沉默TOX3的ZR-75-1细胞和稳定过表达TOX3的MDA-MB-231细胞中TOX3蛋白的表达。MTT法检测过表达和干扰TOX3基因对乳腺癌细胞增殖活性的影响。平板单克隆实验检测过表达TOX3对MDA-MB-231细胞单克隆形成能力的影响,流式细胞术检测沉默或过表达TOX3后ZR-75-1和MDA-MB-231细胞周期的变化。结果 与阴性对照组比较,稳定沉默TOX3的乳腺癌ZR-75-1细胞TOX3蛋白表达明显下降,过表达TOX3的MDA-MB-231细胞TOX3蛋白表达明显上调。过表达TOX3后,MDA-MB-231细胞的增殖活性明显增强,单克隆形成能力增强,G₀/G₁期细胞所占比例明显减少,G₂/M期细胞比例增多。干扰TOX3后,ZR-75-1细胞增殖活性下降,G₀/G₁期细胞比例增加,G₂/M期细胞比例减少。结论 靶向调控TOX3基因的表达可改变乳腺癌细胞增殖和单克隆形成能力,影响乳腺癌细胞周期。     

RNA干扰YAP基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响

目的 探讨RNA干扰YAP基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法 使用阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将靶向沉默YAP基因的siRNA序列转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中,采用qRT-PCR和Western印迹法分别检测转染后MDA-MB-231细胞中YAP基因及蛋白的表达水平,噻唑蓝(MTT)实验和细胞平板克隆实验检测转染前后细胞增殖的变化,Transwell小室和划痕实验观察转染对细胞侵袭及迁移的影响,流式细胞术评价转染后细胞周期及凋亡的变化情况。结果 转染siRNA后,YAP RNA和蛋白的表达量相对于空白对照及阴性对照组均明显下降(P<0.01)。MTT实验及细胞平板克隆实验显示,siRNA干扰YAP表达可以显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖活性;Transwell小室及划痕试验显示,siRNA干扰YAP的表达可以明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭及迁移能力;细胞周期实验显示,沉默YAP后,细胞周期出现G₀/G₁期阻滞,细胞凋亡检测证实沉默YAP后细胞凋亡率并未出现明显上升。结论 抑制YAP在乳腺癌细胞的表达可有效降低细胞的增殖、迁移和侵袭能力,改变细胞周期分布,但对细胞凋亡无明显影响。     

联氨基姜黄素脂质体纳米颗粒对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响

目的 探讨联氨基姜黄素（hydrazinocurcumin,HC）脂质体纳米颗粒（NPs）对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响。方法 通过薄膜分散-超声法制备联氨基姜黄素脂质体纳米颗粒（HC-NPs）。用HC-NPs处理细胞后,MTT法检测细胞增殖,刘氏染色法检测细胞形态学改变,流式细胞术检测细胞周期与凋亡,Transwell检测细胞的侵袭和迁移,Western blotting检测与细胞周期、凋亡、侵袭及迁移相关蛋白分子的变化。结果 HC-NPs可抑制MDA-MB-231细胞的增殖,使细胞形态变圆,诱导细胞发生G₂/M期阻滞,使细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）,抑制细胞的侵袭和迁移。HC-NPs可下调磷酸化-信号转导和转录激活因子（p-STAT3）以及下游分子Cyclin D1、Survivin、Bcl-2及MMP-9的表达,上调Bax的表达。结论 HC-NPs可能通过抑制STAT3的激活,抑制细胞增殖、侵袭和迁移,促进细胞凋亡。     

雷公藤内酯醇对多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞周期及P21wap1/cip1和P27kip1表达的影响

目的 观察雷公藤内酯醇对多发性骨髓瘤细胞 RPMI 8226 增殖和周期的影响,探讨细胞周期调控蛋白 P21wap1/cip1 和 P27kip1 在其中的作用和意义。方法 采用 MTT 比色法和流式细胞术检测雷公藤内酯醇对 RPMI 8226 细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,半定量 RT-PCR 和 Western blotting 法检测 RPMI 8226 细胞中 P21wap1/cip1、P27kip1 mRNA 和蛋白表达。结果 雷公藤内酯醇能明显抑制 RPMI 8226 细胞增殖,其抑制作用呈时间、剂量依赖性,雷公藤内酯醇作用 48 h 的 IC₅₀ 值为 (71.18±2.01) nmol/L。雷公藤内酯醇还可以诱导 RPMI 8226 细胞周期阻滞于 G₀/G₁ 期,随着雷公藤内酯醇浓度的增加,G₀/G₁ 期细胞逐渐增多,S 期细胞逐渐减少。经雷公藤内酯醇干预后周期调节蛋白 P21wap1/cip1 和 P27kip1 的 mRNA 和蛋白表达水平明显上调。结论 雷公藤内酯醇可以抑制 RPMI 8226 细胞增殖,该抑制作用是通过调控 P21wap1/cip1 和 P27kip1 的表达,从而阻止细胞周期 G₀/G₁ 期过渡实现的。     

灭活仙台病毒Tianjin株诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡作用及其机制的研究

【目的】 研究紫外线灭活复制缺陷的仙台病毒Tianjin株致人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡作用及其机制。 【方法】 首先制备并鉴定紫外线灭活仙台病毒Tianjin株,然后用不同剂量灭活病毒感染MDA-MB-231细胞,24 h后,MTT法检测灭活病毒对MDA-MB-231细胞增殖的影响;Hoechst染色及AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞凋亡情况;JC-10染色流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞线粒体膜电位变化;分光光度法测定MDA-MB-231细胞内caspase-9、-8和-3活性;蛋白质印迹法检测MDA-MB-231细胞中Bcl-2、Bax、Cyt c、caspase-9、Fas、FasL、caspase-8和caspase-3蛋白表达水平。 【结果】 MTT检测显示灭活Tianjin株能够抑制MDA-MB-231细胞增殖,且呈剂量依赖性;Hoechst染色发现灭活病毒感染的MDA-MB-231细胞有明显形态学改变,细胞核呈致密浓染或碎块状致密浓染;AnnexinⅤ-FITC/PI标记流式细胞仪检测显示灭活病毒组细胞凋亡率呈剂量依赖性升高,JC-10染色流式细胞仪分析显示灭活病毒组细胞线粒体膜电位呈剂量依赖性降低,且与对照组比较均有统计学差异(P<0.01);caspase 活性检测显示灭活病毒组caspase-9、-8和-3活性均呈剂量依赖性升高, 与对照组比较有统计学差异(P<0.01);蛋白质印迹结果显示高剂量灭活病毒组(MOI 80)Bcl-2表达下调,Bax、Cyt C、Fas、FasL、活化caspase-9、-8和-3表达上调。 【结论】 灭活仙台病毒Tianjin株能够诱导人乳腺癌MDA-MB-231细胞发生剂量依赖性凋亡,其机制与线粒体内源性途径和死亡受体外源性途径密切相关。     

小檗碱抑制人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞增殖及其与过氧化物酶体增殖物激活受体γ的关系

目的 探讨小檗碱对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 体外生长的影响及其与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的关系,以评价其在乳腺癌治疗中的应用潜力。方法 采用 MTT 法检测小檗碱对 MDA-MB-231 细胞的生长抑制效应;TUNEL 法检测细胞凋亡;联合 PPARγ拮抗剂 GW9662,分析小檗碱对 MDA-MB-231 细胞增殖的影响与 PPARγ受体的关系;实验同时采用罗格列酮作为阳性药进行平行比较分析。结果 小檗碱呈量-效和时-效关系抑制 MDA-MB-231 细胞生长,24 h 的半数抑制浓度 (IC₅₀) 为 0.21 μmol/L;小檗碱诱导 MDA-MB-231 细胞凋亡作用随药物浓度的增加而增强;PPARγ受体拮抗剂不能逆转小檗碱对细胞增殖的抑制作用。结论 小檗碱可明显抑制 MDA-MB-231 细胞生长,但与罗格列酮不同,其作用不通过 PPARγ受体介导;小檗碱诱导 MDA-MB-231 细胞凋亡的效应较罗格列酮更为显著;小檗碱可望成为治疗乳腺癌的有效药物。     

MiR-101通过靶向RAP1B调节上皮间质转化并抑制乳腺癌的侵袭和转移

【目的】 探讨微小RNA miR-101在乳腺癌细胞转移与侵袭中的功能及靶点。 【方法】 首先通过脂质体转染的方法在MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞系中瞬时过表达miR-101模拟物,进而通过划痕实验、transwell迁移和侵袭实验来反映细胞运动能力的改变;然后应用荧光素酶报告基因分析技术和蛋白质印迹技术寻找并验证miR-101的靶基因。 【结果】 在功能学上miR-101的过表达可显著抑制MDA-MB-231、BT549和MDA-MB-4355细胞的迁移和侵袭能力(P<0.01);在线软件预测RAP1B和RAB5A是miR-101的潜在靶基因;荧光素酶报告基因分析初步证明RAP1B是miR-101的靶基因;蛋白质印迹从蛋白质水平进一步验证RAP1B是miR-101的靶基因。 【结论】 在乳腺癌中,miR-101可以通过靶向RAP1B抑制细胞的侵袭和转移能力,这是miR-101作为一种特殊的基因调节因子,在乳腺癌的发生发展中起的重要作用之一。     

瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6对子宫内膜癌细胞周期的调控作用

目的 探讨子宫内膜癌组织中瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员6（TRPC6）的表达变化及其对子宫内膜癌细胞周期的调控作用。方法 应用qRT-PCR技术和蛋白质印迹法检测30例正常子宫内膜、30例不典型增生和32例子宫内膜癌组织中TRPC6的表达。分别用SKF59636（TRPC6阻断剂）和小干扰RNA（siRNA）干扰两种方法阻断TRPC6的作用,观察子宫内膜癌细胞HEC-1A细胞周期的变化。结果 子宫内膜癌组织中的TRPC6 mRNA和蛋白表达量均高于不典型增生组织和正常子宫内膜组织（P<0.01）。SKF96365呈剂量依赖性方式将细胞阻滞于G₂/M期,使G₀/G₁期细胞减少;转染siRNA可将子宫内膜癌细胞阻滞于G₂/M期,使G₀/G₁期细胞减少,同时上调磷酸化细胞分裂周期蛋白2（pCDC2）的表达。结论 子宫内膜癌组织中TRPC6表达增高,TRPC6可能通过影响pCDC2蛋白表达参与子宫内膜癌细胞周期调控。     

虫草素对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响及其机制研究

目的 研究虫草素对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响及其机制。方法 采用CCK-8实验检测不同浓度虫草素作用于MG-63骨肉瘤细胞24h和48h后对癌细胞增殖的抑制作用;采用流式细胞术分析虫草素对MG-63细胞周期分布及凋亡的影响;采用Western blot法检测虫草素对MG-63细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3及NICD1、Hes1蛋白表达的影响。结果 虫草素对人骨肉瘤MG-63细胞有明显的增殖抑制作用,导致MG-63细胞周期阻滞于G₀/G₁期并诱导细胞凋亡;虫草素可上调Bax、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白的表达并下调Bcl-2,NICD1和Hes1蛋白的表达。结论 虫草素通过抑制骨肉瘤细胞增殖,诱导细胞周期阻滞于G₀/G₁期并通过线粒体凋亡途径诱导MG-63细胞凋亡从而发挥抗骨肉瘤作用,可能骨肉瘤细胞中Notch信号通路活性下调有关。     

白花丹醌对瘦素刺激的人肝星状细胞周期及其相关蛋白表达的影响

目的 研究白花丹醌对瘦素刺激的体外培养人肝星状细胞（HSC-LX2）细胞周期及周期相关蛋白表达的影响,探讨白花丹醌抗肝纤维化的作用机制。方法 ELISA法检测HSC-LX2细胞培养上清液中自分泌瘦素水平。将HSC-LX2细胞分成对照组,瘦素组,白花丹醌2、8 μmol/L组,秋水仙碱6.25 μg/mL阳性对照组。除对照组外,其余各组细胞用瘦素100 μg/mL刺激24 h、再与药物共同培养24 h后,流式细胞仪检测HSC-LX2细胞周期,Western blotting法检测细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin E1、p21的表达。结果 HSC-LX2细胞自分泌瘦素的浓度先随着培养时间的延长而递减,24 h达到低谷值,48 h后又升至6 h水平,每个时间点分泌的瘦素量无显著差异（P＞0.05）。与对照组相比,瘦素组HSC-LX2细胞增殖能力显著增强,S期和G₂/M期细胞比例显著增加;而白花丹醌2、8 μmol/L干预后,HSC-LX2细胞G₀/G₁期细胞的比例明显提高,而S期和G₂/M期细胞比例明显降低,且呈明显的浓度相关性。与对照组比较,瘦素组HSC-LX2细胞经瘦素刺激后细胞周期相关蛋白cyclin D1、cyclin E1的量显著增加,p21蛋白的表达受到抑制;白花丹醌2、8 μmol/L和秋水仙碱明显降低cyclin Dl、cyclin E1蛋白水平,增强p21蛋白表达。结论 白花丹醌可明显抑制瘦素诱导的HSC-LX2细胞增殖,该作用主要是通过抑制细胞由G₀/G₁期向S期转变而产生的,作用机制可能与其降低cyclin Dl、cyclin E1蛋白水平,增加p21蛋白表达相关。     

DNA复制起始的复制压力诱导子代细胞非对称分布的染色体损伤

【立论依据】 细胞对染色体在有丝分裂后子代中分布的精密调控是生物遗传过程中最基本的特征之一。迄今对染色体在有丝分裂过程中的编程机制尚不清楚。本研究着力于研究DNA复制起始位点的复制压力所诱导的DNA损伤在子代细胞中的分布信息。 【设计思路】 通过对细胞周期的同步化处理,在DNA复制起始位点诱导复制压力,再免疫荧光染色观察染色体损伤在下一个细胞周期子细胞中的分布。从DNA损伤的角度探讨染色体分布的可能调控机制和生理意义。 【实验内容】 (1)用去血清方法将大部分细胞同步于细胞周期的G₁期,通过流式细胞术进行鉴定;(2)在细胞进入G₁期后给予血清培养,使细胞同步化开始DNA复制,实验组给予APH(DNA聚合酶抑制剂)干预,对照组给予不含APH的血清。同时加入脱氧核苷酸异构物EdU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine)参与合成中的DNA,并可作为后续荧光标记DNA复制的起始位置;(3)流式细胞术观察细胞周期进入有丝分裂M期和到达下一个细胞周期G₁期所需的时间;(4)分别进行细胞爬片和滴片固定收样,并标染EdU(DNA复制起始位置)和FANCD2(DNA损伤修复蛋白)。观察各对子细胞中的DNA损伤情况,并进行统计分析。观察统计染色体的断裂频率,判断断裂位点与EdU染色位点的相对位置关系。 【材料】 人HBE上皮细胞;FANCD2抗体(美国Gibco公司);APH;EdU;1640培养基(美国Gibco公司)。 【可行性】 已完成的前期实验:(1)明确了DNA复制起始位点通过抑制DNA聚合酶更容易导致染色体损伤;(2)这些DNA起始位点的损伤在有丝分裂后的两个子代细胞中呈现明显的非随机、非对称分布,表现为一个子代细胞损伤明显增多,而另一个子细胞基本没有或很少出现损伤。这些前期实验结果与预期结果相符。 【创新性】 (1)首次在体细胞水平探讨DNA复制起始位点的复制压力所诱导的DNA损伤在子代细胞中的分布信息;(2)探讨DNA复制起始位点在复制压力下与染色体断裂的关系;(3)首次从DNA损伤的角度阐释染色体分布的可能调控机制。     

AMPK激动剂AICAR通过阻滞细胞周期于G0/G1期抑制肺动脉平滑肌细胞增殖

目的 建立PDGF-BB诱导的原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary vascular smooth muscle cells,PASMCs)的增殖细胞模型,通过AMPK激动剂AICAR干预,探讨AICAR对PASMCs细胞周期和增殖的影响及其机制,为肺血管重构防治寻找靶点。方法 通过20ng/ml PDGF-BB刺激诱导PASMCs增殖建立细胞模型,采用AICAR(0.5mmol/L)干预PDGF-BB诱导的PASMCs增殖,Western blot法检测总的和磷酸化的AMPK, CCK-8检测PASMCs增殖,流式细胞仪分析细胞周期,实时定量PCR(RT-PCR)检测cyclinD1、cyclinE、CDK2/4/6 mRNA的表达。结果 Western blot法检测表明AICAR可以活化AMPK,CCK-8检测结果表明AICAR能够抑制PDGF-BB诱导的PASMCs增殖;流式细胞仪检测结果表明AICAR能够抑制细胞周期于G₀/G₁期,RT-PCR结果表明AICAR可以抑制cyclinD1、cyclinE、CDK2、CDK4和CDK6的mRNA的表达。结论 AICAR通过抑制cyclinD1、cyclinE、CDK2/4/6 的mRNA表达阻滞细胞周期于G₀/G₁~S期,抑制PASMCs增殖。     

PAK6与HDAC6的相互结合诱导的细胞自噬在前列腺癌增殖中的作用

【立论依据】 前列腺癌 (prostate cancer,PCa)是男性恶性肿瘤的第一杀手。近期研究表明细胞自噬作为双刃剑在前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的生理与病理过程中发挥重要的作用,但目前细胞自噬如何调控前列腺癌的机制尚无报道。p21活化激酶-6(p21-activated kinase 6,PAK6)是丝/苏氨酸蛋白激酶PAK家族的一员,通过磷酸化雄激素受体与肿瘤E3连接酶而泛素化降解雄激素受体,从而负向调节前列腺肿瘤的生长。HDAC6是Ⅱ类组蛋白脱乙酰化酶的一个成员,通过调节底物乙酰化水平促进肿瘤的生长与转化。已有文献报道,PAK6在前列腺癌中呈高表达,而HDAC6具有促进自噬小体形成的作用。我们前期的研究结果发现,PAK6可通过结合HDAC6从而诱导细胞发生自噬,且临床标本的免疫荧光结果显示PAK6与HDAC6共定位于细胞质中,且恶性前列腺癌中的共定位明显高于正常前列腺组织,提示两者在前列腺癌中发挥重要作用。因此本实验旨在探讨PAK6与HDAC6相互结合诱导的细胞自噬在前列腺癌中的发挥的生物学功能及调节机制。 【设计思路】 应用体内外结合实验研究二者在细胞内的相互作用。电镜及蛋白质印迹技术检测PAK6与HDAC6与细胞自噬的关系,及PAK6与HDAC6诱导的细胞自噬在前列腺癌中的生物学功能。免疫组化检测二者在前列腺癌临床标本中表达的相关性。 【实验内容】 (1)体外GST-pull down实验证实PAK6与HDAC6直接结合。(2)共转染HDAC6和PAK6到工具细胞HEK293中,免疫共沉淀检测二者在细胞内结合。(3)成功构建过表达和沉默PAK6细胞系,利用MTT,细胞计数及蛋白质印迹实验揭示PAK6与HDAC6诱导的细胞自噬在前列腺癌中的生物学功能。(4)免疫组化分析前列腺癌组织临床标本中PAK6与HDAC6表达的相关性。 【材料】 前列腺癌及工具细胞系,相应抗体, ECL发光试剂及仪器,共聚焦激光显微镜。 【可行性】 所在实验室为教育部医学细胞生物学重点实验室。前期实验成功证明PAK6和HDAC6的结合及共定位关系,本人已熟练掌握了后续实验涉及的相关技术。 【创新性】 本研究首次发现PAK6和HDAC6在前列腺癌中的共定位表达变化及二者的相互作用,阐明PAK6通过HDAC6促进细胞自噬,为寻找前列腺癌的预警分子提供理论基础。     

白杨素抑制血小板源性生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的机制研究

目的研究白杨素对血小板源性生长因子(PDGF)-BB诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响及细胞周期调控机制。方法WST-1法测定VSMCs增殖,5-溴-2'-脱氧尿苷掺入法测定DNA合成,流式细胞术分析VSMCs细胞周期,Western blot法测定细胞周期关键调控因子周期蛋白依赖性激酶(CDK)4、CDK6和CDK抑制物p27^kip1的表达。结果20ng/ml PDGF-BB显著增强VSMCs增殖及DNA合成,而白杨素呈剂量依赖性抑制PDGF-BB刺激的VSMCs增殖及DNA合成。12.5μmol/L白杨素预处理使PDGF-BB刺激的VSMCs阻滞于G₀/G₁期,并能显著降低VSMCs中CDK4和CDK6的蛋白表达水平,同时升高p27^kip1蛋白水平。结论白杨素抑制PDGF-BB刺激的VSMCs增殖,其机制可能与CDK4和CDK6表达下调而p27^kip1表达上调导致的细胞周期阻滞有关。     

消癌解毒方通过调控PI3K/AKT通路抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖的作用与机制探讨

研究消癌解毒方抗乳腺癌细胞的活性及作用机制。方法 显微镜观察MDA-MB-231细胞形态,MTT法考察细胞的增殖抑制率,流式细胞术观察细胞周期,Western blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白P53、P21、Cyclin B1、CDK1的表达。结果 与对照组相比,消癌解毒方给药组细胞减少,排列疏松,体积变小,形态变圆;消癌解毒方可以提高MDA-MB-231细胞的增殖抑制率（P<0.05~0.01）,使肿瘤细胞的细胞周期阻滞于G₂/M期（P<0.05~0.01）,可以抑制与细胞周期相关的PI3K/AKT信号通路,上调P53、P21,下调Cyclin B1、CDK1蛋白的表达（P<0.05~0.01）。结论 消癌解毒方能阻滞MDA-MB-231细胞周期,抑制乳腺癌细胞的增殖,其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。     

WWP2干扰对Huh7肝癌细胞的增殖、凋亡及细胞周期的影响研究

目的 探讨WWP2对Huh7肝癌细胞系的增殖、凋亡及细胞周期的影响研究。方法 通过实时定量PCR （qPCR）、RNA干扰、流式细胞仪分析细胞周期及凋亡,了解WWP2在Huh7肝癌细胞周期的中作用。结果 在肝癌组织中,WWP2 mRNA水平显著性表达;敲除细胞中的WWP2会抑制细胞增殖、使细胞停滞在G₁期,并诱导细胞凋亡。结论 WWP2有可能通过调控细胞凋亡而促进肝癌细胞生长。     

荧光素酶基因标记乳腺癌细胞系鉴定

目的 利用三阴性人乳腺癌MDA-MB-231细胞,对稳定表达荧光素酶的细胞系MDA-MB-231-Luc进行功能评价及鉴定.方法 构建荧光素酶的HIV慢病毒载体,体外感染乳腺癌MDA-MB-231细胞,经嘌呤霉素筛选后得到稳定表达的细胞系,采用MTT法,利用Transwell侵袭模型,应用伤口愈合细胞划痕实验评价细胞增殖、侵袭和转移能力.结果 利用慢病毒转染的MDA-MB-231细胞能稳定表达荧光素酶,与亲本细胞相比,细胞的增殖、侵袭、迁移能力无显著影响(P>0.05).结论 慢病毒感染乳腺癌细胞能稳定表达荧光素酶,对MDA-MB-231细胞的增殖、侵袭、转移能力无明显影响,为后续的小动物活体成像实验提供细胞模型.     

熊果酸对肺癌细胞株A549及SPCA1细胞周期的抑制作用

目的 研究熊果酸(ursolic acid,UA)对肺癌细胞株A549及SPCA1细胞周期的抑制作用,探讨其分子机制。方法 采用MTS法检测不同浓度UA作用不同时间对A549及SPCA1细胞的增殖抑制作用;光镜下观察细胞形态学变化;流式细胞仪检测不同浓度UA对A549及SPCA1细胞周期分布的影响;实时荧光定量PCR分析UA作用下A549及SPCA1的相关分子表达情况。结果 MTS结果显示UA对A549及SPCA1细胞具有增殖抑制作用,且呈时间和剂量依赖性。经UA作用后,光镜下可见A549及SPCA1细胞增殖受到抑制,细胞出现变圆、回缩和脱落。流式细胞仪结果显示在UA作用后,A549及SPCA1细胞周期抑制在G₀/G₁期,S期和G₂/M期的比例降低。实时荧光定量PCR结果表明,UA作用后A549及SPCA1细胞cyclinD1 mRNA、cyclinE mRNA、Ankrd17 mRNA表达水平降低,p27 mRNA、p16 mRNA表达增加,Ankrd17 mRNA表达变化差异无统计学意义。结论 UA能明显抑制A549及SPCA1细胞增殖,呈时间和剂量依赖性,该作用是通过将细胞周期抑制在G₀/G₁期实现的。其分子机制可能与上调p27和p16的表达,下调cyclinD1和cyclinE的表达有关。     

二苯乙烯苷抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的机制研究

目的 建立PDGF-BB诱导的原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary vascular smooth muscle cells,PASMCs)增殖的细胞模型,并探讨二苯乙烯苷(2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene-2-o-glucoside,TSG)对PASMCs增殖的影响及其机制,为肺血管重构防治寻找新药物。方法 采用酶消化法分离培养大鼠原代PASMCs,通过20ng/ml PDGF-BB诱导PASMCs增殖建立细胞模型,采用1~100μmol/L TSG干预PDGF-BB诱导的PASMCs增殖,通过CCK-8检测PASMCs增殖及TSG的细胞毒作用,BRDU检测DNA的合成,流式细胞仪分析细胞周期,实时定量PCR(RT-PCR)检测CyclinD1、CyclinE、CDK2/4/6 mRNA的表达,Western blot法检测总的和磷酸化AKT/GSK3β的表达。结果 CCK-8检测结果表明TSG抑制PDGF-BB诱导的PASMCs增殖及DNA合成具有浓度依赖性,并且实验浓度的TSG对PASMCs无明显毒性不良反应;流式细胞仪分析结果表明TSG能够阻滞细胞周期于G₀/G₁~S期,RT-PCR结果表明TSG能够抑制CyclinD1、CyclinE、CDK2/4/6 mRNA的表达;Western blot法检测结果表明TSG能够抑制AKT/GSK3β活化。结论 TSG通过阻滞细胞周期于G₀/G₁~S抑制PDGF-BB诱导的PASMCs增殖。TSG抑制PASMCs增殖与抑制AKT/GSK3β信号通路的活化有关。     

激活AMPK对心肌纤维化的保护作用及其机制的研究

【立论依据】 心肌纤维化的治疗一直是困扰着国民的一大难题。心肌纤维化主要表现为:心脏重量、容积增加及形态的改变。初始阶段这种改变还能维持有效的心脏功能。长期纤维化,会导致心脏顺应性降低,最终导致心力衰竭发生。因此,如何抑制心肌纤维化的发生是改善心功能,是避免心力衰竭的关键。但是,目前临床上对心肌纤维化的治疗仍不能令人满意。心肌纤维化的主要病理改变之一,是心肌成纤维细胞(CF)的过度增殖。所以,控制心肌纤维化的关键,就是控制成纤维细胞的增殖。抑制成纤维细胞的增殖,我们就必须从成纤维细胞的细胞周期寻求突破点。正常细胞分化周期可分为G₁、S、G₂、M四个时期。其中影响细胞进程的关键时期,是G₁期向S期转化和G₂期向M期转化。目前,研究最多的是G₁期向S期转化,其过程主要是关键蛋白Rb,进而激活转录因子E2F,完成细胞由G₁期向S期的转化。Rb蛋白可由cyclinE-等复合体激活。而上述复合体又可被P21、P27、P53等蛋白抑制。所以,本实验拟cyclinE-CDK2复合体、P21、P27、P53途径对CF增殖周期进行探讨。 【设计思路】 近年来有研究发现,激活AMPK不仅具有细胞能量调节作用,同时也具有抑制内皮细胞增殖的作用。主要是通过抑制内皮细胞由G₁期向S期转化,最终抑制内皮细胞增殖。进一步研究显示,AMPK在心肌成纤维细胞中也有表达。那么激活AMPK能否抑制CF增殖及其发生的机制是本课题研究的重点。 【实验内容】 分为在体实验和离体实验。在体部分主要是在活体小鼠上探究注射AMPK的激动剂和阻断剂观察CF的增殖情况。离体实验分为三部分,分别验证激活AMPK对CF增殖的抑制作用;激活AMPK对CF周期蛋白的调节作用;激活AMPK抑制CF增殖通过P21、P27周期蛋白途径。 【材料】 AICAR,CompoundC,cyclinA抗体,cyclinD1抗体,cyclinE抗体,cyclinB抗体,CDK2抗体,P21抗体,P27抗体,P53抗体,小白鼠 【可行性】 本实验室硬件设施完善,能够达到实验中涉及到的蛋白质印迹,流式细胞仪技术,细胞计数,ELISA,MTT等技术要求。 【创新性】 该课题致力于研究激活AMPK在CF增殖中起到的调节作用,并且为临床上治疗心肌纤维化提供了新的靶点。