多重PCR技术在检测食源性金黄色葡萄球菌 肠毒素基因中的应用

摘要:目的　金黄色葡萄球菌A、B、C、D和E型肠毒素是引起食源性疾病的主要类型,采用多重PCR技术分析食源性金黄色葡萄球菌分离株肠毒素基因携带状况。方法　以19株食源性金黄色葡萄球菌分离株为研究对象,利用多重PCR技术对核酸酶基因以及肠毒素A、B、C、D和E型基因进行检测。结果　19株菌中均检出金黄色葡萄球菌特异性核酸酶基因,与传统菌落分离培养鉴定结果一致;9株菌含肠毒素SEA基因,1株同时含SEA和SEB基因,没有检测到肠毒素C、D和E基因。结论　在19株食源性金黄色葡萄球菌分离株中,10株携带肠毒素基因,以携带肠毒素A基因为主。     

胶体金免疫层析法检测葡萄球菌B型肠毒素

目的通过优化制备中各关键步骤的实验条件,建立快速检测葡萄球菌B型肠毒素的胶体金免疫层析法。方法采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备直径16nm的胶体金溶液,葡萄球菌B型肠毒素多克隆抗体制备免疫胶体金复合物,组装胶体金免疫层析快速检测试纸条。结果用柠檬酸三钠还原法制备的16nm胶体金溶液呈亮红色,其颗粒大小比较均一。胶体金标记抗体蛋白的最低稳定量为15μg／mL,最适稳定量为18μg／mL,标记的最适pH为7．8。此方法检测限为0．2μg/mL,准确度为94．9％。结论制备了葡萄球菌B型肠毒素胶体金免疫试纸条,该方法简便、快速,而且灵敏度高、稳定性强,适用于食品中葡萄球菌B型肠毒素的快速检测。     

PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、E基因的研究

目的:建立检测金黄色葡萄球菌肠毒素SEA、SEB、SEC、SEE的PCR方法,实现同一台PCR仪、同一PCR反应条件下同时检测SEA、SEB、SEC、SEE,用于金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒的诊断。方法:根据已公布的SEA、SEB、SEC、SEE编码的基因序列,设计4对引物,优化反应条件,建立检测方法,对特异性和敏感性进行分析,并对扩增产物进行测序鉴定。结果:方法特异性分析表明能很好区分各种肠毒素基因型,灵敏度达0.8-1.0×102 CFU/ml。结论:建立了一种在同一台PCR仪、同一PCR条件下同时检测SEA、SEB、SEC、SEE的方法,可用于金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒的诊断和肠毒素的分型检测。     

PCR技术检测金黄葡萄球菌肠毒素A基因

目的 建立一种快速、准确检测金黄葡萄球菌肠毒素A的PCR方法,了解引起临床感染的金黄葡萄球菌携带肠毒素A基因的情况. 方法 根据金黄葡萄球菌肠毒素A基因编码序列设计一对PCR引物来特异性扩增靶基因片段,建立快速、特异、灵敏的检测金黄葡萄球菌肠毒素A基因的方法.同时对我院2006年8月-2008年10月临床分离的120株金黄葡萄球菌进行肠毒素A基因检测. 结果 成功的对肠毒素A基因进行检测并进行基因测序.在我院120株受检金黄葡萄球菌中,基因阳性株占83.3%. 结论 用PCR技术检测金黄葡萄球菌肠毒素A基因具有特异性强,灵敏度高,速度快和易操作特点.金黄葡萄球菌肠毒素A阳性株在临床分离的金黄葡萄球菌中占有较高比例,应予以足够重视.     

PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、E基因

目的 建立一种用PCR快速敏感地检测金黄色葡萄球菌肠毒素A、E的方法.方法 根据genebank报道的编码金黄色葡萄球菌肠毒素A、E的基因序列,设计一对特异性引物来扩增靶基因片段,长度为327 bp,通过对金黄色葡萄球菌产肠毒素A、E菌株和14株非金黄色葡萄球菌产肠毒素A、E菌株进行检测,评价该方法的特异性;对金黄色葡萄球菌产肠毒素E菌株做系列10倍稀释,进行PCR检测,对其敏感性进行分析;PCR扩增产物进行电泳和测序鉴定.结果 金黄色葡萄球菌肠毒素A、E菌株出现PCR扩增反应,14株非金黄色葡萄球菌产肠毒素A、E菌株没有出现PCR扩增反应,通过测序分析证实了PCR产物的特异性;PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素E基因的检测下限为120 cfu/ml.结论 建立了一个快速、特异、敏感的金黄色葡萄球菌肠毒素A、E基因的PCR检测方法,可用于金黄色葡萄球菌肠毒素的临床诊断和食品安全监测.     

实时荧光聚合酶链反应检测粪便标本中的金黄色葡萄球菌肠毒素A、D

目的:建立一种快速、准确、特异、定量检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素A、D的方法并探讨肠毒素在食物中毒引起腹泻中的意义。方法:选择femB、SEA和SED基因分别作为金黄色葡萄球菌菌株、肠毒素A、肠毒素D的靶序列,设计合成引物和探针;收集食物中毒导致腹泻患者粪便标本487份,并对其进行检测分析。结果:采用荧光聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌和肠毒素A的灵敏度为1.0×102拷贝,而检测肠毒素D的灵敏度为1.0×103拷贝;487份粪便标本中检出金黄色葡萄球菌femB基因72例(14.8%),检出产肠毒素A菌株为11例(15.3%,11/72),产肠毒素D菌株为9例(12.5%,9/72),同时产肠毒素A、D菌株1例(1.4%,1/72)。结论:应用Taqm an探针实时荧光PCR技术能够快速、准确检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素,适合于大样本筛查。     

一起食物中毒事件金黄色葡萄球菌肠毒素及肠毒素基因检测与分析

目的了解分离自食物中毒事件的金黄色葡萄球菌肠毒素的型别,并对肠毒素基因携带情况及菌株分子分型进行分析。方法对分离自某起食物中毒的12株金色葡萄球菌分离株进行生化鉴定,采用微孔板酶联免疫法(ELISA)、酶联荧光免疫法(ELFA)、聚合酶链反应(PCR)进行肠毒素型别和肠毒素基因检测,并应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)法对菌株进行分子分型,应用Bio Numerics软件对不同来源的菌株进行比对,分析菌株之间的相关性。结果 12株来源于患者和食物样本的菌株经ELFA、ELISA法检测,结果均为阳性,其中1株来源于某患者呕吐物样本的菌株为肠毒素B型,其余11株来源于该患者的肛拭样本和其他样本的菌株均为肠毒素A型。肠毒素基因检测结果显示,除1株未能检出肠毒素基因外,1株检出肠毒素基因seb,10株检出肠毒素基因sea,其中8株同时检出肠毒素基因see。PFGE分型结果显示,11株菌为1型,1株菌为2型。结论金黄色葡萄球菌肠毒素检测对明确引起食物中毒的原因十分重要,PFGE分型技术有助于食物中毒的溯源研究。     

金黄色葡萄球菌食物中毒菌株肠毒素检测及基因分析

目的:了解一起食物中毒中分离到的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)的生物学特性及其肠毒素基因检测。方法:采用VITEK-32全自动微生物鉴定/药敏分析系统对分离到的金黄色葡萄球菌菌株进行生化鉴定和药敏试验,并采用mini-VIDAS全自动荧光酶标免疫仪对菌株进行肠毒素检测,再采用PCR技术对产肠毒素的菌株进行基因分型。结果:总共分离到的19株金黄色葡萄球菌,所有分离株均对青霉素G耐药,均分泌β-内酰胺酶,肠毒素基因分型检测均为SEA与SEE。结论:19株分离株均携带肠毒素,经鉴定均为SEA与SEE肠毒素混合型,由此对食物中毒的原因有一个较圆满的解释。     

食物中毒样品中金黄色葡萄球菌及肠毒素检测

[目的]对3个可疑食物中毒样品进行金黄色葡萄球菌及肠毒素检测.[方法]按照GB/T4789.10-2003进行金黄色葡萄球菌检测,同时设计4对引物,分别扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc基因)和相关肠毒素基因(SEA、SEB、SECs),建立一种快速检测金葡菌和肠毒紊的方法.[结果]3个样品通过增菌接种,均检出有完全溶血环、G 葡萄球菌,血浆凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌;Baird-Parker直接计数菌落结果分别为:9.6x107cfu/g、1.5x105 cfu/g、1.7x108 cfu/g;PCR检测3个样品均扩增出了金黄色葡萄球菌nuc基因(279 bp)和肠毒素A(SEA)基因(288 bp).[结论]3个样品中均检出含有葡萄球菌肠毒素A的金黄色葡萄球菌,是引起该次食物中毒的主要原因.     

四起金黄色葡萄球菌引起的食物中毒及毒素分析

目的对4起食物中毒的10株菌株进行金黄色葡萄球菌的鉴定及毒素分析。方法按照食品卫生检测标准GB 4789.10-94、《葡萄球菌食物中毒诊断标准及处理原则》W S/T 80-1996及葡萄球菌肠毒素检测试剂盒说明书进行操作。结果这10株菌均鉴定为金黄色葡萄球菌,并检出葡萄球菌A型肠毒素,且其中1株同时检出葡萄球菌C型肠毒素。结论应加强食品卫生的管理工作,防止金黄色葡萄球菌污染食品,防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成。     

食品中金黄色葡萄球菌的肠毒素检测及耐药性

目的了解食品中金黄色葡萄球菌对药物的敏感性及产肠毒素的情况,对食物中毒检测提供理论依据和指导临床用药。方法药物敏感性试验采用1997年美国NCCLS药敏试验(纸片法)方法进行,用反向被动乳胶凝集试验检测肠毒素。结果金黄色葡萄球菌除对万古霉素、替考拉宁敏感外,对其余10种存在不同程度的耐药;金黄色葡萄球菌产肠毒素总检出率为38%,其中A型为25%,C型为12.5%,其次为D型为5%,E型为2.5%,B型未检出。结论检测食物中毒及食品样品中的金黄色葡萄球菌时,应考虑肠毒素的检测;临床治疗金黄色葡萄球菌感染,应建立在体外药敏试验的基础上,有针对性地选择抗菌药物。     

应用实时荧光PCR技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素基因

目的:建立一种简便、特异的荧光PCR检测方法,用于金黄色葡萄球菌肠毒素的检测。方法:按金黄色葡萄球菌SEA～SEE型肠毒素基因序列设计引物,在普通PCR检测体系中,加入SYBR Green I荧光染料,建立荧光PCR检测体系。结果:46株金黄色葡萄球菌中检出22株携带肠毒素基因,阳性率为47.83%。以SEA、SEB检出率较高,分别为31.82%和27.27%;不同来源的分离株携带肠毒素基因的比例不同,同时携带2种及以上毒素基因的菌株占27.27%。结论:荧光PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法具有快速、敏感、特异性高的特点,适用于肠毒素基因的分型与分布的研究,适合基层疾控部门使用。     

台州市食源性金黄色葡萄球菌的主动监测及肠毒素基因分布研究

目的:了解台州市食源性金黄色葡萄球菌的污染状况及肠毒素基因的分布特征,为食品安全的风险评估和食源性致病菌的预防提供科学依据。方法:在2005年-2010年间按照监测网的工作要求对采集的各类食品样品进行金黄色葡萄球菌的定性检测,并对保存的菌株用多重PCR方法进行18种肠毒素基因(sea～seu)的检测分析。结果:380份食品样品中共有47份检出金黄色葡萄球菌,总检出率为12.4%,其中即食食品检出率最高为13.2%,生肉类为11.7%,豆制品为7.7%;保存的42株菌中共有22株菌检出12种肠毒素基因,基因携带率为52.4%,sea、seq、sei基因的检出率较高,分别为21.4%、16.7%、11.9%。结论:台州市市售食品中金黄色葡萄球菌的污染程度较高,肠毒素基因携带率较高,监测结果应引起食品监管部门的重视。     

Enterotoxin A and B production in strains of Staphylococcus aureus isolated from human beings and foods.

The production of enterotoxin A and B by strains of Staphylococcus aureus isolated from nasal swabs of healthy carriers, from lesions of hospital patients and from foods unconnected with outbreaks of food-poisoning was investigated. Sixty-six strains of S. aureus were obtained from human beings, two produced enterotoxin A, 45 produced enterotoxin B, seven produced enterotoxins A + B. Thirty-six strains were isolated from 111 samples of food, one produced enterotoxin A, 16 produced enterotoxin B. The relative incidence of A, B and A + B enterotoxigenicity was assessed.     

蜡样芽胞杆菌及毒素引起食物中毒的实验室检测

目的:探讨食物中毒实验室检测机制。方法:采集中毒者肛拭子、剩余食物,带回实验室进行金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌检验。结果:4份剩余食物其中3份样品检出蜡样芽胞杆菌,并蜡样芽胞杆菌菌落总数>105 cfu/g,所有样品的细菌生化反应结果一致。并在剩余食物中检出蜡样芽胞杆菌肠毒素。肛拭子和剩余食物均未检出金黄色葡萄球菌。结论:按WS/T.82-1996诊断标准,可判定此次是由蜡样芽胞杆菌所引起的食物中毒。     

Enterotoxin production, phage typing and serotyping of Staphylococcus aureus strains isolated from clinical materials and food

The production of enterotoxins A, B, C and F by strains of Staphylococcus aureus isolated from various clinical sources and from isolates implicated in food poisoning was investigated. One hundred and ninety one of the 374 clinical strains (51.1%) were found to be enterotoxigenic; of these, 81 (27.7%) strains produced enterotoxin A, 57 (15.3%) strains produced enterotoxin B, 23 (6.2%) strains produced enterotoxin C, and 64 (17.1%) strains produced enterotoxin F. These enterotoxigenic strains were most frequently lysed by phages of group III (21.5%) or were not typable (22%). Eighteen of the 29 strains implicated in food poisoning were enterotoxigenic. The correlation of antigens and bacteriophage patterns with enterotoxigenicity was determined: enterotoxin A being related to a4 antigen, enterotoxin B to phages of 94/96 complex with c1, o antigens, and enterotoxin F to phages of group I with 2632, k1k2, m antigens.     

Enterotoxin production, phage typing and serotyping of Staphylococcus aureus strains isolated from clinical materials and food.

The production of enterotoxins A, B, C and F by strains of Staphylococcus aureus isolated from various clinical sources and from isolates implicated in food poisoning was investigated. One hundred and ninety one of the 374 clinical strains (51.1%) were found to be enterotoxigenic; of these, 81 (27.7%) strains produced enterotoxin A, 57 (15.3%) strains produced enterotoxin B, 23 (6.2%) strains produced enterotoxin C, and 64 (17.1%) strains produced enterotoxin F. These enterotoxigenic strains were most frequently lysed by phages of group III (21.5%) or were not typable (22%). Eighteen of the 29 strains implicated in food poisoning were enterotoxigenic. The correlation of antigens and bacteriophage patterns with enterotoxigenicity was determined: enterotoxin A being related to a4 antigen, enterotoxin B to phages of 94/96 complex with c1, o antigens, and enterotoxin F to phages of group I with 2632, k1k2, m antigens.     

Studies on staphylococci from toxic shock syndrome in France, 1981-1983.

Staphylococci from 22 cases of toxic shock syndrome with onsets between 1981 and March 1983 have been studied. Another four cases were detected by abstract surveillance. Three of these patients died. The case histories show that the syndrome occurs in women during menstruation as well as in males and in children, and is associated with Staphylococcus aureus infections. The production of enterotoxins (A, B, C) and toxic shock toxin by S. aureus isolates from toxic shock syndrome was investigated. Twenty-two of the 23 isolates were found to be toxigenic: 7 produced enterotoxin A, 8 produced enterotoxin B, 3 produced enterotoxin C and 13 produced toxic shock toxin. The latter was found with enterotoxin A in five cases, and with enterotoxins A and B in only one case. Sixty-three percent of 46 S. aureus strains isolated from the vagina of patients with diseases other than toxic shock syndrome produced toxin; eight of these strains produced toxic shock toxin.