端粒重复扩增—微孔板杂交法用于端粒酶活性测定的研究

目的 探讨用端粒重复扩增（ＴＲＡＰ）－微孔板杂交法,检测人端粒酶方法学研究及临床应用。方法 利用Ｋｉｍ法处理组织与胸腹水细胞及扩增端粒酶产物,引物ＴＳ含量生物素,扩增产物与包被有亲和素的微孔板结合,并含荧光素特异探针杂交,酶标记抗荧光素抗体与之结合而呈色。结果 该方法ＮａＯＨ的最佳变性浓度为０．６ｍｏｌ／Ｌ,最佳杂交时间为１小时,批内变异系数（ＣＶ）为９．６％。在９４例各种恶性肿瘤组织与恶性胸腹水     

端粒重复扩增-微孔板杂交法用于端粒酶活性测定的研究

目的探讨用端粒重复扩增（ＴＲＡＰ）微孔板杂交法,检测人端粒酶方法学研究及临床应用。方法利用Ｋｉｍ法处理组织与胸腹水细胞及扩增端粒酶产物,引物ＴＳ含生物素,扩增产物与包被有亲和素的微孔板结合,并与含荧光素特异探针杂交,酶标记抗荧光素抗体与之结合而呈色。结果该方法ＮａＯＨ的最佳变性浓度为０６ｍｏｌ／Ｌ,最佳杂交时间为１小时,批内变异系数（ＣＶ）为９６％。在９４例各种恶性肿瘤组织与恶性胸腹水端粒酶活性总检出率８９４％,其中５例胸腹膜转移癌的胸腹水检出率为８０％,５８例肿瘤远端组织与良性胸腹水为８６％。结论该法有较好的测定敏感度与重复性,较银染色法更为简便快速,无同位素污染,检测成本低,值得临床推广     

荧光素和地高辛标记探针在聚合酶链反应-微孔板杂交检测TTV DNA中应用比较

目前聚合酶链反应 ( PCR)扩增产物常规检测采用琼脂糖凝胶电泳法 ,其敏感度、特异性均不能满足临床要求。对PCR产物进行限制性内切酶酶切片段长度多态性 ( PCR-RFLP)分析、变性梯度凝胶电泳 ( PCR-DGGE或 PCR-SS-CP)及 PCR产物直接测序 ,虽可特异性检测 PCR产物 ,但因操作繁杂 ,且需特殊试剂和仪器 ,无法在临床普遍开展。利用特异性探针与扩增产物杂交 ,引用微孔板杂交酶呈色技术 ,由于其特异性和敏感度高而被应用于临床。我们采用荧光素和地高辛分别标记探针 ,建立荧光素 -抗荧光素、地高辛 -抗地高辛酶偶联系统微孔板杂交酶…     

聚合酶链反应检测肿瘤细胞株的端粒酶活性

目的比较聚合酶链反应酶免法（ＰＣＲＥＬＩＳＡ）和聚合酶链反应聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＣＲＰＡＧＥ）方法检测白血病细胞端粒酶活性的临床应用价值。方法ＰＣＲＥＬＩＳＡ以地高辛标记对端粒重复片段特异的探针与ＰＣＲ变性产物杂交，通过ＥＬＩＳＡ系统检；ＰＣＲＰＡＧＥ方法直接用电泳法分离ＰＣＲ扩增端粒酶的合成产物，经溴乙啶染色，分析端粒酶活性。结果ＰＣＲＥＬＩＳＡ方法能准确特异地检测白血病细胞的端粒酶活性，检测灵敏度可达１×１０２细胞数。经ＰＡＧＥ分离显示，端粒酶的ＰＣＲ产物有含５０ｂｐ等６条梯带。结论两种方法均可用于临床检测。ＰＣＲＥＬＩＳＡ方法似更简单、方便一些。     

改良PCR-ELISA的建立及初步应用

目的　建立操作简单、灵敏、特异的PCR -ELISA。方法　采用短DNA片段扩增 ,其中上游引物 5′端标记有生物素 ,使PCR扩增产物的一条链上带有生物素 ,随着PCR反应的结束 ,PCR反应液中的地高辛标记的探针与PCR产物中的生物素标记的DNA链杂交 ,形成杂交产物 ,然后杂交产物通过生物素与微孔板上固定的链霉亲合素结合 ,被固定在微孔板上 ,最后用ELISA检测被固定的杂交产物。结果　该方法可以检测出 1× 10 1拷贝的HBVDNA模板 ,对 10 0例乙型肝炎患者的血清进行检测 ,HBSAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清 10 0 %(30 /30 )检出HBVDNA ;HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清HBVDNA阳性为 78 6 %(2 2 /2 8) ;HBsAg(+)、抗HBc(+)的血清HBVDNA阳性为 6 6 7%(16 /2 4) ,其余为阴性。非乙型肝炎血清的结果均为阴性。结论　该PCR -ELISA操作简单 ,方法灵敏、特异。     

PCR—ELISA检测TB—DNA方法学建立及临床应用评价

目的 建立PCR－ELISA检测TB－DNA的方法学，探讨其最佳实验条件及优化组合，结合涂片法、培养法和PCR电泳法评价其临床应用价值。方法 常规PCR引物用地高辛标记，使扩增产物带有地高辛标记成分，再通过亲和素－生物素系统把生物素标记探针包被在固相聚丙乙烯微孔中，通过固相探针与TB－DNA扩增产物进行杂交与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应，经NPP显色后测其A405nm值的大小，与同样操作处理的不同浓度标准菌株A值比较，推出样品中TB－DNA含量。结果 建立该法的最佳实验条件为PCR循环次数为35次，杂交温度为42℃，杂交时间为1h，探针浓度为0.2uM，包被浓度为10μg/ml。经北京胸部肿瘤结核病医院、北京胸科医院及中国人民解放军第309医院三家医院621例临床标本验证，其中结核组464例，该法检出率为57．3％（266／464），而涂片法仅为31．7％（147／464），培养法为35．8％（166／298），PCR电泳法检出率为45．7％（212／464），各法比较存在显差异（P＜0．01）。结论 本法作为结核病的一项免疫学和分子生物学检测指标，具有较高的临床推广应用价值。     

107非同位素同源PCR检测宫颈分泌物中HPV

[英]／CoutleeF…∥JClinMicrobiol.-1995，33（8）．-1973～1978人类乳头瘤病毒（HPV）引起尖锐湿疣，其不同型与生殖器的良、恶性增生有关。如HPV16和18型常与侵袭性宫颈癌有关，而6和11型则多见于良性增生。实验室对HPV的培养法及特异性抗原的检测较为困难，而多采用核酸杂交分析。作者等报告—种新的非同位素PCR（（PCR-EIA法）诊断HPV并分型。首先用通用引物PCR扩增大多数HPV型L1DNA，扩增产物再与地高辛（dig）标记型特异性巢式RNA探针杂交，杂交产物被预先包被于微孔板的地高辛抗体捕获，最后用碱性磷酸酶标记的抗D…     

人乳头瘤病毒PCR产物酶标-微孔板杂交分型

目的建立聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物直接酶标记微孔板反向分子杂交法用于人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）型别鉴定。方法利用ＨＰＶ通用引物介导ＰＣＲ（ＧＰＰＣＲ）扩增靶ＤＮＡ，然后对产物直接标记辣根过氧化物酶复合物（ＨＲＰＰＥＩＱＩ），与预先包被在微孔板上的ＨＰＶ寡核苷酸探针杂交后酶显色法检测。结果ＨＰＶ各型之间无交叉杂交；杂交灵敏度可达１３～７６个病毒ＤＮＡ拷贝，比ＰＣＲ琼脂糖凝胶电泳检测高１０倍；该法重复性好，阳性孔批内ＣＶ为６．３４％，批间ＣＶ为１０．５３％，阴性孔批内ＣＶ为１％，批间ＣＶ为５．７９％；而且杂交影响因素较少。结论该法特异性强、灵敏度高、操作简便，无放射性和ＥＢ染料污染，杂交时间短、仪器读取结果，便于大量常规临床样本定性或定量检测。     

检测乙型肝炎病毒基因型的分子杂交方法有何特点?

答 :现行的分子杂交方法主要有 2种。一种为反向杂交法 ,即将型特异性探针对包被在膜上 ,再将聚合酶链反应(ＰＣＲ)扩增的乙型肝炎病毒基因片段与膜上的探针杂交。另一种杂交方法是在微孔板上进行 ,以通用探针包被微孔板 ,ＰＣＲ扩增产物与之杂交后 ,再以型特异型探针检测 ,该方法快速、简便 ,适宜于大量标本的检测和流行病学调查。检测乙型肝炎病毒基因型的分子杂交方法有何特点?@魏来     

PCR-反向微孔板杂交法检测医学真菌初步应用

目的通过建立PCR-反向微孔板杂交法鉴定临床常见的致病真菌,为临床治疗提供可靠依据。方法应用通用引物对真菌ERG11基因的保守序列进行扩增,扩增片段包被于微孔板中,再将真菌特异性引物与之杂交,经漂洗后显色,读取450nm处吸光度值判断结果。结果8种真菌特异性探针不与其他种的真菌、细菌和人类DNA分子杂交,而只和其对应的真菌DNA扩增产物反应,呈现阳性杂交结果。55例临床血液病、肿瘤等患者的血液、脑脊液及痰等标本分别用PCR一反向微孔板杂交法和真菌培养法（API20C）鉴定,2种方法的结果基本一致（阳性率分别为34．5％和30．9％）。结论PCR-反向微孔板杂交法可用于临床不同标本致病真菌的检测。     

Bioluminescent method for detecting telomerase activity

BACKGROUND: Telomerase is a promising biomarker in cancer diagnosis and therapy. The elongation of telomeric repeats catalyzed by telomerase is accompanied by release of six PP(i) for each TTAGGG repeat (1 pmol PP(i)/310 pg telomeric repeats). We developed a novel method to measure telomerase activity by use of an enzymatic luminometric PP(i) assay (ELIPA). METHODS: Extracts of cell lines and tissues were incubated with primer at 30 degrees C for 30 min. Released PP(i) was converted to ATP by sulfurylase, and ATP was detected by a luciferase bioluminescence system. The ELIPA results were compared with results obtained with the conventional telomeric repeat amplification (TRAP)-ELISA in 42 lung carcinoma tissues and 27 control tissues without malignancy. RESULTS: The lower detection limits of ELIPA and TRAP-ELISA were 5 and 10 cells, respectively. The within-run imprecision (CV) of ELIPA was < or =12%. When compared with TRAP-ELISA, the correlation coefficient (r) was 0.79. When we used the cutoff value from ROC analysis to distinguish malignant and nonmalignant tissues, the sensitivity and specificity of ELIPA were 83% and 96%, respectively, whereas the sensitivity and specificity of TRAP-ELISA were 71% and 96%, respectively. CONCLUSION: ELIPA is a simple and sensitive homogeneous method to quantify telomerase activity.     

食管癌组织和切缘端粒酶活性表达的研究

目的:研究食管癌组织和切缘端粒酶活性表达的意义及其与预后的关系。方法:应用RT-PCR技术检测80例食管癌和10例食管良性肿瘤组织中及切缘(近心端切缘病理切片无癌组织残留)的端粒酶活性。结果:在80例食管癌组织中端粒酶活性表达为82.5%(66例),切缘端粒酶活性表达为12.5%(10例)。10例食管良性肿瘤组织中及切缘均未发现端粒酶阳性表达。癌组织端粒酶活性与食管癌TNM分期、病理分化程度、淋巴结转移及预后有显著性相关。切缘端粒酶活性与食管癌TNM分期、肿瘤部位有显著性相关。术后随访6个月～3年,共有9例胃吻合口复发,其中8例为术后食管切缘端粒酶活性阳性患者。结论:端粒酶活性表达与食管癌进展与预后有关,检测食管切缘端粒酶活性可作为早期预测食管癌术后吻合口复发的重要依据。     

肺癌组织端粒酶活性的研究

目的：探讨端粒酶活性检测在肺癌诊断中的临床应用价值。方法：用TRAP方法检测29例肺癌组织，27例癌旁组织，6例良性病变组织中的端粒酶活性，并以5例正常肺组织作对照。结果：29例肺癌中21例显示端粒酶活性（72．4％），且端粒酶活性随着癌细胞分化程度的降低而增高，而与淋巴结有无转移无相关性。癌旁组织的阳性率为22．2％（6／27），6例良性病变及5例正常肺组织的阳性率为0％，结论：端粒酶活性检测对于鉴别肺肿瘤的良恶性具有重要价值。并有望成为恶性肿瘤诊断的有效标记物。     

乳腺癌的端粒酶活性检测

目的探讨端粒酶活性与乳腺癌的相关性、端粒酶活性检测在乳腺肿瘤诊断和判断预后中的意义。方法运用端粒重复扩增法（ＴｅｌｏｍｅｒｉｃＲｅｐｅａｔＡｍｐｌｉｆｉｅａｔｉｏｎＰｒｏｔｏｃｏｌ,ＴＲＡＰ）检测了３０树新鲜冰冻乳腺癌标本,以及２０例良性乳腺肿瘤组织和３０例癌旁正常乳腺组织。结果在新鲜乳腺癌标本３０例中２７例阳性,阳性率９０％,其中伴有淋巴结转移的１９例,阳性率１００％;３０例癌旁正常乳腺组织中有１例阳性,阳性率为３％;２０例良性乳腺肿瘤组织中均未检测出端粒酶活性。结论乳腺癌发生与端粒酶活性相关。提示在乳腺癌发生发展中可能存在着端粒酶活性的再激活,使乳腺癌细胞获得永生,端粒酶活性检测对于乳腺肿瘤的良、恶性鉴别具有十分重要的意义。端粒酶活性的抑制剂可能对乳腺癌的治疗有一定的作用。     

食管癌端粒酶活性及ras基因突变的研究

目的 :探讨食管癌端粒酶活性的表达及ras基因的突变。方法 :采用PCR技术为基础的端粒重复序列扩增 ,对 38例食管鳞癌及食管炎、癌旁组织进行端粒酶及食管癌端粒酶活性及ras基因突变的检测。结果 :38例食管癌中 32例端粒酶阳性 ,检出率为 84.2 % ,ras基因阳性 31例 ,阳性率 81 .2 % ;癌旁组织 2例呈阳性 ,检出率为 1 6 .7% ;ras基因阳性 4例 ,阳性率 33 .3 % ;食管炎 2例呈阳性 ,检出率为 1 6 .7% ;ras基因阳性 2例 ,阳性率 1 6 .7% ;食管癌组与癌旁组织组及食管炎组分别对照均有显著性差异 (P <0 .0 5) ;38例食管癌端粒酶和ras基因突变存在显著相关性 (χ2 =1 1 .4 ,P <0 .0 0 5) ;端粒酶及ras基因与食管癌发生部位、肿瘤分化程度、有无淋巴结转移无明显关系。结论 :端粒酶的激活及ras基因突变在食管癌的发生、发展中起重要作用可作为食管癌的诊断指标 ,二者具有显著相关性     

肺癌端粒酶活性及外周血T淋巴细胞Ag-NORs的研究

【目的】探讨端粒酶活性与肺癌临床病理特征的关系,以及端粒酶活性强度与外周血T淋巴细胞 嗜银蛋白(Ag NORs)含量的关系。【方法】采用PCR TRAP方法检测48例肺癌组织和28例癌旁组织端粒 酶活性,并用免疫图像分析的方法术前检测20例病人的外周血T淋巴细胞Ag NORs含量。【结果】肺癌组 织与癌旁组织的端粒酶阳性表达率差异有显著性(P<0.01);肺癌端粒酶活性与淋巴结转移、TNM分期有 显著相关性(P<0.05);肺癌端粒酶活性强度与外周血T淋巴细胞Ag NORs含量呈负相关关系(R=-0. 808)。【结论】端粒酶活化与肺癌的发生发展有关,并与机体免疫功能有着密切的关系,结合分析端粒酶活性 与外周血T淋巴细胞Ag NORs含量对了解肺癌的进展情况有意义。     

乳头溢液脱落细胞端粒酶活性检测

目的探讨乳头溢液脱落细胞端粒酶活性检测在临床诊断中的应用。方法采用ＴＲＡＰ－ＰＣＲ银染定性法及ＴＲＡＰ－ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ定量法对５０例溢乳进行脱落细胞端粒酶活性分析。结果５０例溢乳脱落细胞端粒酶阳性率高达７８％（３９／５０）,随着年龄的增大,端粒酶阳性率呈逐步下降趋势,而同期送检的细胞病理诊断则无１例找到癌细胞。结论溢乳脱落细胞端粒酶阳性检出率明显增高。随着疾病的发展,端粒酶阳性患者易发生恶变的可能性是否大于端粒酶阴性患者需进一步研究。     

脑胶质瘤端粒酶活性表达的研究

目的：探讨端粒酶在脑胶质瘤发生、发展中的作用，并研究端粒酶活性是否与其恶性程度相关。方法：应用端粒重复序列扩增技术(TRAP)对48例胶质瘤标本和8例正常脑组织的端粒酶活性进行检测。结果：8例正常脑组织端粒酶活性均为阴性表达，48例胶质瘤标本中23例为表达阳性(47．92％)，低度恶性组与高度恶性组胶质瘤之间端粒酶活性阳性率有明显差异(P=0．001)。结论：端粒酶活性与胶质瘤恶性程度明显相关，端粒酶在胶质瘤发生发展过程中可能具有重要作用。     

Effects of telomerase activity on carcinogenesis and survival in laryngeal carcinoma

This study aimed to look at whether a correlation exists between telomerase activity and survival of laryngeal carcinoma patients. Telomerase activity was measured by telomerase repeat amplification protocol in 31 laryngeal carcinomas and adjacent normal tissues, and in 21 vocal cord polyps (controls). Follow-up was for at least 60 months. Telomerase activity in tissues adjacent to laryngeal carcinomas was significantly higher than in the carcinomas which was, in turn, significantly higher than in vocal cord polyps. There was no significant difference between telomerase activity in carcinomas or adjacent tissues and clinicopathological characteristics. Patients with high telomerase activity in carcinoma tissue had significantly shorter survival times than those with low activity, but no significance difference was observed between survival time and telomerase status in adjacent tissues. Linear regression showed significant association between telomerase activity levels in carcinoma tissues and survival time, but this was not observed in adjacent tissues. This study suggests that telomerase activation probably takes place before the cancer phenotype develops and has prognostic significance for survival of patients with laryngeal carcinoma.