破伤风毒素C片段在乳链菌内的表达

目的：构建破伤风毒素C片段(TETC)乳链菌表达载体,并验证其生物活性。方法: 将采用基因拼接方法获得的TETC基因从测序正确的质粒pBS-TETC上以Sal I、Hind Ⅲ切下,分别定向连接到以Xho I、 Hind Ⅲ酶切的质粒分泌表达的乳链菌表达载体pNBC1000和膜锚定表达的乳链菌表达载体pNBC2000。电穿孔转化乳链菌,分别提取分泌蛋白及膜锚定蛋白,通过蛋白电泳及Western-blot检测蛋白定位表达情况。结果：构建了分泌表达及锚定表达TETC的乳链菌表达载体pNBCL1002与pNBCL2002,电穿孔转化乳链菌获得了分泌表达及膜锚定表达TETC的乳链菌,SDS-PAGE分析显示分泌表达的TETC大小约为57.8kDa,表达量占总体蛋白的8.06%、上清蛋白的9.82%,锚定表达的TETC大小约为73.5 kDa的表达蛋白,表达量占总体蛋白的10.7%,膜蛋白的17.9%; Western-blot检测显示所表达的TETC均可与破伤风抗毒素血清发生免疫印迹。结论：成功构建了TETC乳链菌表达载体,并在乳链菌内表达了TETC,并初步验证了表达的TETC的免疫反应性,这一结果可能为进一步研究生物佐剂及防治破伤风疫苗奠定了基础。     

艰难梭菌A毒素受体结合区基因在乳链菌中的表达

目的：在乳链菌内表达艰难梭菌A毒素受体结合区并检测其活性．方法：提取艰难梭菌标准株基因组DNA,扩增编码艰难梭菌毒素A毒素受体结合区的羧基未端基因重复序列（14CDTA）,分别连接到乳链菌表达载体pNBC1000及pNBC2000,转化乳链菌,蛋白电泳及Western—blot检测蛋白定位表达情况．结果：成功构建了14CDTA乳链菌表达载体,并在乳链菌内表达了艰难梭菌受体结合区蛋白,分泌表达的艰难梭菌受体结合区蛋白大小约39．2ku,膜锚定表达的受体结合区蛋白大小约为55．1ku,所表达的蛋白均可与艰难梭菌A毒素多克隆抗体发生免疫印迹反应．结论：表达艰难梭菌受体结合区蛋白的重组乳链菌可以识别艰难梭菌A毒素多克隆抗体,为研制防治艰难梭菌疫苗的口服生态活菌亚单位疫苗奠定了一定基础．     

重组hGM-CSF乳酸链球菌的构建及初步验证

目的 运用基因克隆技术将自行合成的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)转化于乳酸链球菌.并筛选获得高表达重组hGM-CSF的乳酸链球菌稳定株.方法 将经过优化适合在乳链菌表达的hGM-CSF基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽、终止密码子的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF,然后将pNCSF进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,获得乳链菌表达载体pTRCSF,通过电穿孔转化于乳链菌,并通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳验证hGM-CSF的表达.结果 获得了重组质粒pNCSF并经酶切鉴定和测序证实.酶切鉴定显示构建乳链菌表达载体pTRCSF及重组hGM-CSF乳链菌成功,蛋白电泳初步验证获得了高表达重组hGM-CSF的乳链菌株LL-CSF.结论 运用基因克隆技术成功构建了重组乳酸链球菌LL-CSF,为进一步研究重组hGM-CSF的生物学特性及评价其潜在临床.应用价值打下了基础.     

人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆中国人的肥胖基因,并在大肠杆菌中高效表达人瘦素蛋白。方法 用RT-PCR从培养的中国人脂肪细胞提取的总RNA中扩增出肥胖基因,与TA载体连接后进行核酸序列测定,并将该基因定向克隆至高效表达质粒pBV220,在大肠杆菌中表达。结果 克隆出中国人肥胖基因,其cDNA序列与文献报道的一致,构建了重组质粒pBV220-OB,并成功地实现了人肥胖基因在大肠杆菌中的表达。结论 人肥胖基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达,为进一步研究该基因在肥胖症及其相关疾病中的作用,以及在脂肪代谢与脂肪细胞分化中的调控机制奠定基础。     

干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因的扩增、克隆及蛋白表达

目的 研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1(interferon-inducible transmembrane protein-1,IFITMP-1)基因的扩增、克隆及蛋白表达。方法 以含IFITMP-1基因的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将目的基因克隆到pUCm-T质粒测序。进一步克隆到pET-Trx蛋白表达载体质粒,优化蛋白表达条件。结果 含有IFITMP-1基因的PCR产物约1000bp。重组pUCm-T质粒经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,有相应大小的cDNA片段插入,测序结果显示其序列正确,证实目的基因的扩增、克隆成功,并成功克隆进pET-Trx蛋白表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)plysS中有融合蛋白表达。结论 成功扩增克隆IFITMP-1基因,并成功表达该基因编码的蛋白,为进一步研究IFITMP-1基因在大肠癌中的作用奠定了基础。     

小鼠CTLA4-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4Fc融合基因（CTLA4-Fc）的真核表达质粒,并检测其在293T细胞中的表达,为后续在小鼠体内研究CTLA4-Fc抗肿瘤作用机制奠定基础。方法 Gene Runner 软件设计并合成互为搭桥、互为模板的CTLA4融合基因引物,利用重叠PCR方法扩增获得CTLA4基因片段,与pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒同时进行双酶切,连接合成CTLA4-Fc融合基因表达质粒;菌落PCR扩增、双酶切以及测序鉴定后,在293T细胞中瞬时转染表达融合基因的质粒,ELISA法检测其在293T细胞内的蛋白表达含量。结果 成功构建CTLA4-Fc融合基因。经菌落PCR和双酶切,琼脂糖电泳检测到CTLA4-Fc片段长度为1 200 bp,CTLA4片段长度为568 bp DNA。将阳性重组克隆菌落挑于液体LB培养基中扩大培养并将菌液送公司测序,测序结果证实DNA序列与GenBank同源性为100%。通过ELISA方法能够检测到CTLA4-Fc质粒在293T细胞中的表达。结论 CTLA4-Fc融合基因正确克隆入pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒中,该质粒能够在293T细胞中表达。本研究利用重叠PCR技术扩增获得CTLA4基因序列,能够快速获得目的 基因扩增产物,提高了实验的成功率。     

人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体的构建

目的 构建带信号肽和不带信号肽的人血小板衍生生长因子B(PDGF-B)链基因酵母表达载体,探讨该基因在酵母中的表达效率和活性。方法 利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人血管内皮细胞总RNA中扩增出PDGF-B的cDNA,克隆入pGEM-T载体,进行序列测定。进而克隆至酵母表达质粒pMETB和pMETαA并进行重组子双酶切鉴定。结果 扩增获得了含信号肽(578 bp)和不含信号肽(340 bp)的编码PDGF-B链基因;构建了PDGF-B的酵母表达载体pMETB-PDGFB₁,pMETαA-PDGFB₂。测序结果显示,重组载体中目的基因序列与GENE BANK公布的序列一致。结论 人血小板衍生生长因子B链基因酵母表达载体构建成功,为进一步在酵母中的高效表达奠定基础。     

中华按蚊防御素基因的克隆、原核表达及其重组产物生物活性的初步评价

目的 克隆、原核表达中华按蚊的防御素基因,并对其表达产物的生物学活性进行评价。方法 根据已发表的埃及伊蚊和冈比亚按蚊防御素基因序列设计合成两对引物,以中华按蚊成蚊cDNA为模板进行PCR扩增,将预期片段克隆测序并进行分析;根据表达质粒pET32a(+)上的克隆位点及测序结果设计PCR引物,将截短的基因片段重组入质粒pET32a(+)中进行表达,纯化表达产物并进行体外抑菌试验。结果 PCR扩增产物大小约270bp,目的基因的序列与冈比亚按蚊防御素基因同源性为85%;截取其保守功能区域序列(162bp),构建成功重组表达质粒pET32a(+)-tDEF,含重组质粒的转化菌用IPTG诱导表达后,于M_r26000处可见一预期的特异表达带,该蛋白与抗6-His抗体有特异性的反应;琼脂扩散法显示,纯化的重组防御素融合蛋白未出现抑菌环。结论 首次克隆了中华按蚊防御素基因,其截短片段在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达,但重组融合蛋白不具备抑菌活性。     

活化转录因子ATF1、ATF2对USP22基因启动子活性的调节

目的克隆人活化转录因子ATF1基因和ATF2基因蛋白编码序列,分别构建真核细胞表达载体,进而研究高表达ATF1和ATF2对泛素水解酶22(ubiquitin-specific processing enzyme 22,USP22)基因启动子转录活性的影响。方法 RT-PCR扩增ATF1基因和ATF2基因蛋白编码序列,分别与pVAX1真核表达载体连接;测序、酶切鉴定重组载体;Western Blot检测外源性ATF1和ATF2在靶细胞Hela细胞中的表达;pVAX1-ATF1、pVAX1-ATF2分别与含野生型USP22启动子的萤光素酶报告质粒或其CREB位点突变体质粒共转染,双萤光素酶报告系统检测萤光素酶活性的表达。结果重组质粒pVAX1-ATF1、pVAX1-ATF2构建成功,外源性ATF1、ATF2在Hela细胞内有效表达;转染pVAX-ATF1促进USP22启动子活性升高(83%±11%),转染pVAX-ATF2促进USP22启动子活性升高约(52%±8%);而突变CREB位点均可导致上升作用的消失。结论成功构建了ATF1、ATF2真核表达质粒,高表达外源性ATF1和ATF2均可通过CREB位点激活USP22启动子的转录活性。     

含血管内皮生长因子启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒的制备及其体外杀伤作用观察

目的 应用AdEasier-1系统高效制备含血管内皮生长因子(VEGF)启动子驱动CD自杀基因重组腺病毒并观察其体外肿瘤杀伤作用。方法 以JM109细菌基因组为模板,PCR扩增出含Hind Ⅲ/Bam HⅠ酶切位点的CD基因,亚克隆到pREP8,继而用Hind Ⅲ/XbaⅠ切出含pA加尾信号的CD基因,插入到预先构建的含VEGF启动子的转移质粒pAdtrack-VEGFP构建pAdtrack-VEGFP-CD。经PmeⅠ线性化后转化AdEasier-1细菌,用25 μg/ml卡那霉素筛选阳性克隆,先后进行琼脂糖电泳和PacⅠ酶切鉴定,筛选出正确重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CD。经293细胞包装、扩增获得重组腺病毒Ad-VEGFP-CD,行PCR鉴定。通过测定细胞克隆形成率和细胞存活率观察重组腺病毒对体外培养的LoVo细胞的细胞毒作用。结果 构建重组腺病毒质粒的成功率为70%(7/10)。包装扩增后重组腺病毒的滴度为4.8×10¹² CFU/ml,PCR扩增结果与预期相符。在前药5-氟胞嘧啶存在下,重组腺病毒对LoVo具有明显杀伤作用,细胞克隆形成率和细胞存活率都明显下降。结论 应用AdEasier-1系统可以成功制备含VEGF启动子驱动CD自杀基因的重组腺病毒,该重组体具有明显的肿瘤杀伤作用。     

干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因的扩增、克隆及蛋白表达

目的研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1（interferon-inducible transmembrane protein-1,IFITMP-1）基因的扩增、克隆及蛋白表达.方法以含IFITMP-1基因的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切,将目的基因克隆到pUCm-T质粒测序.进一步克隆到pET-Trx蛋白表达载体质粒,优化蛋白表达条件.结果含有IFITMP-1基因的PCR产物约1000 bp.重组pUCm-T质粒经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,有相应大小的cDNA片段插入,测序结果显示其序列正确,证实目的基因的扩增、克隆成功,并成功克隆进pET-Trx蛋白表达载体,经IPTG诱导,在BL21（DE3）plysS中有融合蛋白表达.结论成功扩增克隆IFITMP-1基因,并成功表达该基因编码的蛋白,为进一步研究IFITMP-1基因在大肠癌中的作用奠定了基础.     

重组腺病毒载体pAd-NY-ESO-1-EGFP的构建及鉴定

目的:利用细菌内同源重组法构建含人肿瘤特异性抗原的腺病毒质粒。方法:设计NY-ESO-1 cDNA扩增引物,从pET15b-NY-ESO-1质粒中扩增NY-ESO-1的DNA序列,与pShuttle-IRES-hrGFP-2进行连接,PCR和EcoRⅤ酶切鉴定重组质粒pShuttle-NY-ESO-1-EGFP,经Pm eⅠ酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-NY-ESO-1-EGFP;质粒经PacⅠ酶切鉴定,DNA测序。结果:线性化的pShuttle-NY-ESO-1-EGFP转化含pAdeasy-1的超感受态B J5183大肠杆菌,重组质粒经酶切获得一大于23 kb的大片段和4.5 kb的片段,PCR反应扩增出了340 bp的片段。结论:用细菌内同源重组法成功地构建了含NY-ESO-1的重组腺病毒质粒,为进行表达NY-ESO-1的重组腺病毒的制备及肿瘤特异性抗原NY-ESO-1的核酸疫苗在肿瘤方面的研究奠定了基础。     

喉癌来源的MAGE-A3基因真核表达载体及其稳定表达模型的构建和鉴定

目的：克隆人黑色素瘤相关抗原MAGE—A3基因,构建真核表达载体,检测、鉴定其在细胞中的表达。方法：MAGE-A3基因进行PCR扩增,凝胶回收PCR产物片段并连接至pMDl8一T载体。测序后将MAGE—A3基因片段亚克隆至真核表达载体,构建成plRES2-EGFP／MAGE—A3重组质粒。经脂质体转染至293T细胞株后,荧光定量PCR、Western-blotting法鉴定MAGE—A3基因的表达。结果：MAGE-A3基因正确克隆在plRES2-EGFP／MAGE-A3,测序结果与GenBank公布的MAGE—A3序列一致。转染293T细胞后能检测到MAGE-A3基因和蛋白的表达。结论：成功构建plRES2-EGFP／MAGE—A3真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE—A3蛋白,奠定了其作为DNA疫苗应用的基础。     

前列腺特异性膜抗原启动子增强子调控UPRT基因真核质粒的构建及表达

目的 构建前列腺特异性膜抗原启动子增强子靶向性调控的UPRT基因真核表达重组质粒(pPSMAenhaocer／promoter-UPRT)。方法 采用PCR技术从大肠杆菌JMpPSMAenhaocer／promoter-UPRT109基因组中扩增UPRT基因，通过分子克隆技术将其克隆到包括前列腺特异性膜抗原启动子增强子靶向性调控的pEGFP-1的质粒。利用重组质粒pPSMAenhaocer／promoter-UPRT)转染LNcap细胞，MTT法检测5-氯尿嘧啶(5-FU)对转染LNcap细胞存活率的影响。结果 质粒pPSMAenhaocer／promoter-EGFP双酶切去除EGFP，连接上UPRT基因，成功构建pPSMAenhaocer／promoter-UPRT,并转染LNcap细胞。使LNcap细胞对5-FU的杀伤敏感性大大提高。结论 pPSMAenhaocer／promoter-UPRT的构建和表达，为进一步研究UPRT基因对5-FU的靶向性杀伤前列腺癌细胞增强作用和对前列腺癌自杀基因系统(CD／5一FC系统)的放大效应奠定了基础。     

抗凋亡蛋白Fortilin基因的克隆、表达与鉴定

目的在大肠杆菌中表达一种新近发现的抗凋亡蛋白Fortilin。方法用RT-PCR方法,从肺腺癌细胞中扩增出编码Fortilin蛋白的基因(GenBank中编码该蛋白的基因名为TPT1),克隆入pGEX-4T-1表达载体;重组质粒转入E.coliBL21(DE3),诱导表达Fortilin蛋白,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果经双酶切及核酸序列分析鉴定,重组质粒pGEX-4T-1/TPT1成功构建,诱导后能高效表达可溶性Fortilin融合蛋白,SDS-PAGE及Western-blot验证该蛋白,表达的融合蛋白分子量为45000,与预期理论值相符。结论Fortilin蛋白在大肠杆菌中以融合蛋白形式进行表达,可提高其在宿主细胞中的稳定性和可溶性,且在大肠杆菌中获得高效表达,获得了充足的活性蛋白,这为进一步了解该蛋白的生物学功能,研究其抗凋亡机制奠定了基础。