携带前强啡肽基因的Ad5 F35重组腺病毒制备及鉴定

目的 用Ad5F35载体制备携带前强啡肽基因的重组腺病毒Ad5F35-PDP并对其进行鉴定.方法 利用NheI和Agel分别对合成的目的 基因prodynorphin聚合酶链反应(PCR)产物和pDC316-LacZ-a载体质粒进行双酶切.将PDP目的 基因片段和线性化的pDC316连接,克隆构建pDC316-PDP.pDC316-PDP与腺病毒骨架pBHG-fiber5/35共转染293细胞制备Ad5F35-PDP重组腺病毒,收获并纯化病毒,检测重组病毒滴度,运用PCR进行鉴定.结果 编码PDP的基因序列经测序鉴定证实与Gene Bank中的一致,pDC316-PDP构建成功.pDC316-PDP与腺病毒骨架共转染293细胞后见明显的毒斑,说明两者在293细胞中同源重组并包装成功.经PCR证实Ad5F35-PDP重组腺病毒构建完成.病毒滴度为1×1012v.P./ml.结论 本实验成功制备了含PDP全序列的高滴度、高纯度的Ad5F35-PDP重组腺病毒,为下一步进行该重组病毒生物安全性能和生物学功能研究及今后应用Ad5F35-PDP重组腺病毒对吗啡成瘾患者进行基因治疗奠定了基础.     

表达前强啡肽基因的Ad5型腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建且鉴定含前强啡肽基因(prodynorphin)的血清5型腺病毒载体(Ad5).方法 应用分子生物学方法 将前强啡肽基因序列克隆入腺病毒穿梭质粒pDC316-PDP,后者与骨架质粒共转染HEK293细胞,包装得到含前强啡肽转基因的腺病毒Ad5-PDP.用聚合酶链反应(PCR)方法 对转基因病毒进行鉴定,TCID50法测定病毒滴度.结果 PCR法证实转基因正确插入了Ad5型病毒基因组内,且没有野生型病毒污染,病毒滴度为1×1012v.p./mL.PCR鉴定Ad5-PDP重组成功.结论 获得的Ad5-PDP滴度高,感染性好,可以用于转基因治疗的实验研究.     

人骨形成蛋白7基因重组35型腺病毒载体的构建与鉴定

目的探讨构建携带人骨形成蛋白7(human bone morphogenetic protein-7,hBMP-7)基因的重组35型腺病毒(serotype35adenovirus,Ad5F35)载体,为基因治疗研究提供一种新的方法,并观察其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法以pcDNA1.1/Amp-hBMP7质粒为模板扩增骨形成蛋白(BMP-7)基因(1.3kb),将回收的PCR产物片段克隆入pDC316载体,获得重组质粒pDC316-hBMP7。骨架质粒pBHG-fiber5/35和穿梭质粒pDC316-hBMP7共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7。同样的方法构建rAd5/F35-EGFP。在体外用不同感染复数(M.O.I)值的rAd5/F35-hBMP7和rAd5/F35-GFP分别转染兔MSCs,并留置空白对照。采用流式细胞仪、RT-PCR方法检测目的基因的转染效率和表达。结果PCR、酶切鉴定以及序列测定与比对分析表明,重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7质粒构建正确。转染兔MSCs的最高效率可达99%,hBMP-7基因存在于转染后的MSCs中并表达相应的mRNA。结论本实验成功构建了含hBMP-7基因的重组腺病毒rAd5/F35-hBMP7载体,在体外能高效转染兔MSCs。     

大鼠galectin-9基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的克隆大鼠galectin-9基因全长cDNA,构建含大鼠galectin-9基因的重组腺病毒载体,并予以鉴定。方法从大鼠的肝脏组织中用RT-PCR的方法克隆扩增大鼠galectin-9基因,再定向插入到带NotⅠ和HindⅢ酶切的pDC316-GFP穿梭质粒中,获得穿梭质粒pDC316-GFP-galectin-9。经PCR、NotⅠ和HindⅢ酶切及测序鉴定后,用脂质体将穿梭质粒pDC316-GFP-galectin-9与腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1.3Cre共转染HEK-293细胞。经位点特异性重组获得含目的基因的重组腺病毒Ad5-galectin-9,行PCR鉴定,经HEK-293细胞扩增及纯化制备高滴度病毒液,用细胞培养方法测定病毒TCID50滴度。结果 PCR、酶切及测序证实穿梭质粒构建正确,PCR鉴定证实大鼠galectin-9基因重组腺病毒载体构建正确,病毒的感染滴度为1.4×109U/ml。结论成功构建了含大鼠galectin-9基因的重组腺病毒表达载体,为进一步研究大鼠galectin-9基因的功能奠定了基础。     

构建携带EGFP标志人白细胞介素10基因的重组腺病毒载体

目的 构建携带EGFP标志人白细胞介素10(hIL-10)基因腺病毒载体.方法 以pSNAV2.0-hIL-10重组质粒为模板.PCR扩增hIL-10基因,获得hIL-10 cDNA片段,并酶切连接到带有含强绿色荧光蛋白基因(EGFP)标记的pDC316-IRES-EGFP-lacZalpha载体质粒上,Pmel线性化重组质粒pDC316-hIL-10-IRES-EGFP,与腺病毒包装系统AdMax转染293包装细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒,经反复感染293细胞扩增病毒后,进行离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数、滴度.结果 经PCR鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hIL-10-IRES-EGFP和重组腺病毒质粒Ad-hIL-10-IRES-EGFP.扩增纯化后.测得重组腺病毒颗粒数为3.2×1011VP/ml,OD260/OD280值约为2.0,滴度为1.1×1010TCID50/ml.结论 成功构建了重组腺病毒质粒Ad-hIL-10-IRES-EGFP,为进一步研究hIL-10基因奠定实验基础.     

重组腺病毒载体Ad5-CCL20的构建及其表达

目的:构建表达趋化因子CCL20的重组腺病毒载体Ad5-CCL20,检测体外转染小鼠结肠癌细胞CT-26后的产物表达。方法:通过EcoR I/Sal I双酶切CCL20质粒和pDC316质粒,将获取编码CCL20的基因片段连接到pDC316重组穿梭质粒。将测序正确的穿梭质粒pDC316-CCL20与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共同转染293T细胞,构建重组腺病毒载体Ad5-CCL20。予Ad5-CCL20体外转染结肠癌细胞CT-26,Western blotting和Elisa检测转染后不同时间段CCL20的表达情况,并以含CCL20的上清分别对mDC、iDC进行趋化实验。结果:成功构建表达趋化因子CCL20的重组腺病毒载体Ad5-CCL20;Western blotting和Elisa均检测到CCL20表达,且CCL20表达量随病毒转染CT-26细胞的时间延长而逐渐增加;趋化实验表明,趋化因子CCL20对iDC、mDC都有趋化作用,但对iDC的趋化作用更加明显(P0.05)。结论:重组腺病毒载体Ad5-CCL20的构建及获取为后续开展肿瘤的免疫治疗提供实验基础。     

重组35型腺病毒介导人骨形成蛋白基因对脂肪源性干细胞的诱导分化

目的在体外运用人骨形成蛋白7（human bone morphogenetic protein 7，hBMP-7）基因重组35型腺病毒（recombinant adenovirus’s containing fibers derived from B—group serotype 35，rAd5／F35）诱导大鼠脂肪源性干细胞（adipose—derived adult stem cell，ADASC）向成骨细胞定向分化，为骨组织工程探索新的细胞来源。方法以pcDNA1．1／氨苄青霉素-hBMP-7质粒为模板扩增hBMP7基因，将回收的PCR产物片段克隆入pDC316载体，获得重组质粒pDC316-hBMP7。骨架质粒pBHG—fiber5／35和穿梭质粒pDC316-hBMP-7共转染293细胞，同源重组产生rAd5／F35-hBMP-7。同样的方法构建rAd5／F35-增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）。在体外分别转染大鼠ADASC并留置空白对照。观察细胞形态和生长情况，ELISA检测转染基因的转录和表达，检测钙结节和骨钙素等成骨细胞表型。结果PCR、酶切鉴定表明rAd5／F35-hBMP-7质粒构建正确。rAd5／F35-EGFP对大鼠ADAsc中转染效率可达90％以上，hBMP7基因存在于转染后的ADASC中并表达相应的蛋白，诱导组钙结节形成，电镜见胞质中有钙质成分，碱性磷酸酶阳性，骨钙素表达增强。结论rAd5／F35介导hBMP7基因可促进ADASC向成骨细胞定向分化。     

大鼠VEGF腺病毒基因转染系统的构建及鉴定

目的:探讨构建携带大鼠血管内皮细胞生长因子(VEGF)的重组腺病毒载体方法，为后续的基因转染研究作准备。方法:采用RT-PCR扩增的方法获取鼠源性的VEGF,并克隆入穿梭质粒pDC316。构建的质粒pDC316-VEGF经酶切及测序鉴定正确后，通过lipofectamine2000的介导与腺病毒包装质粒pBHGE3共转染至人胚肾细胞HEK293，经同源重组后获得携带鼠VEGF的重组腺病毒VDC316-VEGF。应用PCR鉴定重组腺病毒，空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒。以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度。结果:PCR鉴定证实重组腺病毒含有鼠VEGF,病毒滴度为3×109pfu/mL。结论:成功构建的携带大鼠VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,可作为后续基因治疗研究工作中可靠的基因转染工具。     

靶向大鼠诱导型一氧化氮合酶基因的shRNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)标志针对大鼠诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的shRNA重组腺病毒载体并在人胚肾-293细胞中扩增制备重组病毒.方法 利用AdMax包装系统,用先期构建的带有EGFP标记基因的穿梭质粒pDC316-iNOS-shRNA-EGFP,与骨架质粒pBHGlox_El,3Cre共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-inosshRNA-EGFP,反复感染293细胞扩增病毒后,离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数及滴度.结果 经聚合酶链反应(PCR)检测和EGFP表达证明已成功构建了携带iNOS-shRNA-EGFP的重组腺病毒载体;扩增纯化后,测得重组腺病毒颗粒数为3.6×1011 VP/ml,A260/A280值约为1.25,病毒活性为7.94×109IU/ml.结论 已成功构建重组腺病毒载体Ad5-inos-shRNA-EGFP,为利用基因激活技术治疗勃起功能障碍的研究奠定实验基础.

Abstract：

Objective To construct an adenovirus vector expressing short hairpin RNA (shRNA)of rat inducible oxide synthase (iNOS) carrying enhanced green fluorescent protein (EGFP) and amplify the adenovirus vector in HEK-293 cells. Methods The shuttle plasmid pDC316-inos-shRNA-EGFP that was constructed at an earlier date, was cotransfected with the adenovirus skeleton plasmid pBHGlox_E1,3Cre into 293 cells to obtain the produced replication defective recombinant adenovirus vector Ad5-inosshRNA-EGFP. The recombinant adenovirus was propagated by repeat infection of 293 cells and purified by ion exchange method, then the virus particles were counted and the purity and titer were determined.Results Recombinant adenoviral vector Ad-ACE-shRNA was constructed successfully, which was confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and GFP expression. After amplification and purification, the virus particle count, A260/A280 and titer of recombinant adenovirus were 3.6 × 1011 VP/ml, 1.25 and 7.94 ×109 IU/ml,respectively. Conclusion Recombinant adenovirus vector Ad5-inos-shRNA-EGFP is successfully constructed, which laid a foundation for gene activation in erectile dysfunction treatment.     

Lck反义RNA重组腺病毒载体的构建及其对肾小管上皮细胞Lck表达的影响

目的:观察淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)在肾小管上皮细胞中的表达及Lck反义RNA对其表达的影响.方法:采用RT-PCR方法从肾小管上皮细胞中获得Lck目的基因片段,将目的基因片段反向插入pDC 316质粒中,构建Lck反义RNA穿梭质粒(pDC 316-antisenseLck),经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将此穿梭质粒与辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre 共转染HEK 293细胞,重组产生Lck基因反义RNA腺病毒载体(Ad-antisenseLck).用此重组腺病毒感染体外培养的肾小管上皮细胞,Western blotting方法观测此重组腺病毒载体对IL-2诱导的Lck蛋白表达的影响.结果:构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此重组腺病毒载体感染培养的肾小管上皮细胞后可明显抑制IL-2诱导的Lck蛋白表达(P<0.05),抑制率可达47%.结论:成功构建出Lck反义RNA重组腺病毒载体,此载体可在肾小管上皮细胞内发挥生物学作用,显著阻抑肾小管上皮细胞的Lck蛋白表达.     

Discitis in Childhood: 12-35-year Follow-up of 35 Patients

We report a follow-up of 35 children, on average 17 years after they had intervertebral discitis. 15 patients still complained of backache. Flexion of the low back was normal in 32 patients, while extension was markedly restricted in 30. 26 patients had a block vertebra, and 28 patients had narrowing of the vertebral canal. Mode of treatment did not appear to affect the outcome.     

Arthroscopy Journal at 35

As we commence our 35th year, we acknowledge our team and launch 2 new initiatives: Infographics and Arthroscopy Journal Podcasts.     

35. Wiederherstellung bei Brandverletzungen

Zusammenfassung Drittgradige Brandverletzungen erfordern aus vitaler, funktioneller oder ästhetischer Indikation eine plastisch-chirurgische Therapie. Um das Infektionsrisiko möglichst gering zu halten, sollte mit der Nekrektomie so früh als möglich begonnen werden. Ausdehnung und Tiefe der Gewebsschädigung, der Infektionsgrad der Wunde sowie der Allgemeinzustand des Verletzten entscheiden darüber, ob eine temporäre Defektdeckung notwendig ist oder die autologe Spalthauttransplantation sofort angeschlossen werden kann. Hierzu haben sich neben den Streifentransplantaten Mesh-graft-Transplantate in unterschiedlicher Vergrößerung sehr bewährt.     

病历摘要(35)(英文)

Case Report(35)A 12-year-old boy is referred to the orthopaedic department ac-companied by his parents.They report a fall on his right shoulderduring ice skating one week earlier.The boy complains about pain