牙本质基质蛋白1基因转染猪体细胞的实验研究

目的构建牙本质基质蛋白1(DMP1)绿色荧光融合蛋白pEGFP-DMP1,确定该重组质粒转染猪口腔粘膜成纤维细胞(POMFs)及骨髓间质干细胞(MSCs)的最佳条件,评价DMP1转基因修饰对细胞生物学特性及DMP1基因表达的影响。方法构建pEGFP-DMP1真核表达载体,使用不同参数评价脂质体介导基因修饰POMFs及MSCs的转染效率,检测转染后细胞的DMP1基因表达及蛋白表达情况。结果成功构建DMP1真核表达载体pEGFP-DMP1,酶切后得到4.7kb和1.5kb的片段,当脂质体用量为5μl、质粒2μg、转染细胞密度为30%时,DMP1基因的表达比例最高,POMFs及MSCs的最佳转染时间分别为3h和45min。转基因48h后的细胞可见有DMP1基因表达,免疫组化染色显示DMP1阳性。结论选择合适的转染条件可使pEGFP-DMP1绿色荧光融合蛋白重组质粒高效转染POMFs及MSCs,并可检测到DMP1基因及DMP1蛋白表达。     

永生化成牙本质细胞表达牙本质基质蛋白的实验研究

目的　探讨永生化人成牙本质细胞样细胞系hTERT-hOd-l表达牙本质基质蛋白的情况。方法　矿化液培养hTERT-hOd-l细胞5周,检测骨钙素(OC)分泌量和碱性磷酸酶(ALP)活性。采用免疫组织化学、RT-PCR和原位杂交方法检测Ⅰ型胶原、骨涎蛋白(BSP)、牙本质基质蛋白1 (DMP1)以及成牙本质细胞标志物牙本质涎磷蛋白(DSPP) 和牙本质涎蛋白(DSP)在细胞中的表达。结果　在矿化液诱导下,hTERT-hOd-l细胞ALP活性和OC分泌量升高。 hTERT-hOd-l细胞在mRNA水平上表达BSP、DMP1和DSPP,在蛋白质水平上表达DSP和Ⅰ型胶原。结论　hTERT- hOd-l细胞在体外表达牙本质基质蛋白,具有矿化的潜能。     

牙本质基质蛋白-1与生物矿化

牙本质基质蛋白(DMP)-1是骨、软骨、釉质、牙骨质和牙本质生物矿化所必需的一种酸性非胶原蛋白.蛋白质化学研究显示,DMP-1全基因序列是生物矿化的启动因子,由C末端和N末端组成.体内实验证实DMP-1具有多方面功能,不仅是生物矿化的信号分子,同时也是调节因子,对成骨细胞和成牙本质细胞的成熟至关重要.本文就DMP-1在基因调节、组织细胞中的表达以及成骨、成牙本质中的生物矿化作用作一.     

牙本质基质蛋白1基因反义核酸对MDPC-23细胞内、外钙离子浓度的影响

目的观察牙本质基质蛋白1(DMP1)基因反义寡核苷酸作用下成牙本质细胞系MDPC-23细胞内、外钙离子浓度的动态变化,揭示牙本质矿化机制。方法以稳定表达DMP1的MDPC-23细胞为靶细胞,10μmol/L反义DMP1(AS-ODN)为阻断剂,用Western blot法检测不同时间细胞DMP1的表达情况,并观察不同作用时间内MDPC-23细胞内游离钙离子[(Ca2+)if]、总钙离子[(Ca2+)it]和细胞外钙离子[(Ca2+)e]的动态变化。结果Western blot法检测DMP1蛋白在MDPC-23细胞的表达在AS-ODN加入后12 h时减弱,24 h后完全阻断。与正常组和正义核酸组(S-ODN)相比较(平均荧光值为87.46±39.60),AS-ODN组(Ca2+)if先升高(平均荧光值12 h处为104.10±27.06;24 h处为98.46±19.92),AS-ODN作用24 h后,(Ca2+)if又降低(平均荧光值36 h处为77.54±14.95;48 h处为68.43±22.11);(Ca2+)it明显降低,于24 h处至最低值(0.142±0.233)mmol/L(P<0.01);(Ca2+)e呈上升趋势,且与对照组差异无显著性(P>0.05)。结论反义DMP1能够影响MDPC-23细胞内(Ca2+)if和(Ca2+)it浓度,提示DMP1参与调节成牙本质细胞的钙离子代谢和转运过程,可能在牙本质矿化过程中发挥作用。     

人牙本质基质蛋白1 cDNA序列的克隆

目的：克隆人牙本质基质蛋白１（ＤＭＰ１）成熟肽编码区基因片段。方法：用异硫氰酸胍一步法从引产胎儿牙乳头组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙乳头ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出人ＤＭＰ１成熟区的基因片段（约１．８ｋｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到人ＤＭＰ１成熟肽编码区基因片段。     

人转化生长因子β1基因转染人牙龈成纤维细胞及其稳定表达

目的 :探讨人转化生长因子 - β1(hTGF - β1)基因转染人牙龈成纤维细胞 (GF)的表达能力。 方法 :体外培养人GF ,传代培养后以阳离子脂质体 (Lipofectamine) :pcDNA3-hTGF - β1为 3μL∶1μg的比例转染。通过免疫组织化学染色的方法及图像分析检测hTGF - β1表达水平 ;利用水貂肺上皮细胞生长抑制法检测TGF - β1的生物学活性。结果 :转染后的GF呈强阳性表达 ,并持续 4周以上。图像分析显示转染细胞hTGF - β1表达显著增强 ,与对照组比较差异显著 (P <0 .0 1)。转染后细胞上清可有效的抑制水貂肺上皮细胞的生长。结论 :hTGF - β1基因转染可使牙龈成纤维细胞有效而稳定的表达活性hTGF - β1而产生生物效应     

牙本质基质蛋白1在组织中的表达及其对牙本质形成调控作用的研究进展

牙本质基质蛋白1(DMPI)是非胶原蛋白中的重要一员,属于SIBLINGs家族,在硬组织形成和发育中具有重要作用.该文就近几年对DMP 1基因、蛋白结构、分布以及在牙本质形成调控方面的研究作一综述.     

牙本质基质蛋白-1的研究进展

牙本质基质蛋白-1是牙发育过程中一种非常重要的非胶原性基质蛋白,对牙本质的形成和矿化起着重要的作用,但其具体的作用机制有待于进一步的研究.下面就牙本质基质蛋白-1的表达定位、基因结构、生物学功能以及表达调控因素作一综述.     

牙本质基质蛋白-1的研究近况

牙本质基质蛋白-1（dentin matrix protein-1,DMP-1）是牙釉质、牙本质、牙骨质、骨和软骨组织矿化中一种重要的酸性非胶原性基质蛋白,其组成介于牙本质磷蛋白和骨酸性蛋白之间,广泛分布于多种组织中,对硬组织的矿化具有重要意义。现就近些年对牙本质基质蛋白-1基因结构与调控、蛋白结构与代谢以及在细胞、牙本质、骨组织中的分布、表达及生物矿化的研究现状作一综述。     

人转化生长因子β1基因转染牙龈成纤维细胞促进牙周组织再生的动物实验

目的 评价人转化生长因子β1(human transform growth factor-β1,hTGF-β1)基因转染犬自体牙龈成纤维细胞(gingival fibroblast,GF)在治疗人工Ⅱ度根分叉骨缺损中作为组织工程种子细胞所发挥的作用.方法 将hTGF-β1基因转染后的犬自体GF作为组织工程种子细胞,与海螵蛸骨天然纳米羟基磷灰石(cuttlebone-transformed nanometer hydroxyapatite,CBHA)体外复合,制备犬下颌前磨牙区的Ⅱ度根分叉人工骨缺损模型,应用随机化完全区组设计方法将36颗犬前磨牙分为以下4组:①阴性对照组:不作任何处理直接缝合;②阳性对照组:置入牙周韧带细胞(periodontal ligament cell,PDLC)-CBHA复合物;③转染GF组:置入hTGF-β1基因转染犬GF-CBHA复合物;④未转染GF组:置入犬GF-CBHA复合物.每组9颗牙.对各组进行组织学观察和测量,并作示踪实验.结果 与阴性对照组比较,转染GF组、阳性对照组均可显著促进根分叉区牙周组织的再生(P＜0.01),两组的新生牙骨质高度(NC)、新生牙槽骨高度(NB)及新生结缔组织高度(NCT)分别为:(2.97±0.50)、(4.29±0.26)及(4.73±0.06)mm;(3.09±0.26)、(4.46±0.25)及(4.69±0.10)mm,且两组之间差异无统计学意义(P＞0.05).未转染GF组虽可促进牙槽骨再生[NB=(3.46±0.32)mm],但牙根有一定程度的吸收;示踪实验显示:转染后的GF在新生牙槽骨及牙周膜组织中均可发现.结论 hTGF-β1基因转染后的犬自体GF作为组织工程种子细胞,与CBHA体外复合后在人工Ⅱ度根分叉骨缺损的治疗中有显著的促牙周组织再牛的作用,参与了新牛牙槽骨及牙周膜的形成.     

绿色荧光蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的　体外研究绿色荧光蛋白 (GFP)基因转染骨髓间充质干细胞 (MSCs)的方法,并检测基因转染后细胞的生物学特性及分化潜能。方法　体外分离培养大鼠MSCs,用重组GFP的腺病毒载体Ad GFP及脂质体介导质粒pEGFP C1两种方法转染GFP,流式细胞术观察比较基因转染和表达结果;将腺病毒介导的基因转染细胞经成骨定向诱导后,检测碱性磷酸酶表达和钙结节形成情况。结果　重组Ad GFP对细胞的感染率达(41 3±1 4)%,感染 6周后仍有表达;脂质体组转染效率最高为 12 5%。病毒感染组阳性细胞与未感染组细胞经成骨诱导分化后碱性磷酸酶表达均逐渐增高;诱导 3周后茜素红钙盐染色均为阳性。结论　重组GFP的腺病毒载体Ad GFP可高效感染MSCs,基因转染后细胞的增殖分化能力与未转染细胞差异无统计学意义(P>0 05),可以作为一种高效的大鼠MSCs的标记方法。     

兔舌肌基因转染及其安全性分析

目的：分析分子外科缝线法基因转染的安全性。方法：将1cm长外科缝线浸泡于含pBLacZ粒的PBS中过夜,然后将其移植在兔舌肌内。针对转入体内的外源性基因DNA有可能整合到宿主细胞染色体上引起细胞生长行为改变的潜在危险性,采用流式细胞仪技术对实验组和对照组的细胞增殖动力学进行了检测。针对基因免疫有可能引起抗质粒双链DNA抗体产生的潜在危险性,采用间接免疫荧光法对基因转染前后兔血清中的抗dsDNA抗体进行了检测。结果：转染前后无抗-dsDNA抗体产生,实验组对对照组FCM检测无改变。结论：分子外科缝线术转染外源基因的方法不会引起细胞生长行为的改变和诱发抗双链DNA抗体的产生,是一种安全的基因转染方法。     

牙本质基质蛋白1在人不同龋坏牙齿中的免疫定位

目的 :观察牙本质基质蛋白 1(dentalmatrixprotein ,DMP1)在不同龋坏人牙齿中的表达 ,探讨DMP1在牙髓损伤修复中的作用。方法 :采用免疫组化SABC方法观察DMP1在不同龋坏人恒牙中的表达 ,并用图像分析系统进行半定量分析。结果 :DMP1在正常人恒牙组表达阴性 ,浅龋组部分成牙本质细胞和前期牙本质中弱阳性表达 ;中龋组成牙本质细胞数目增多 ,在胞浆和胞突以中阳性表达 ;深龋组成牙本质细胞层排列紊乱 ,出现空泡变性 ,成牙本质细胞样细胞形态细长、扁平 ,两种细胞胞浆和胞突中DMP1表达阳性 ,在修复性牙本质层强阳性表达。与对照组相比 ,成牙本质胞浆中DMP1含量在中龋组和深龋组明显增加 ,浅龋组无显著意义。结论 :DMP1参与成牙本质细胞样细胞分化分泌 ,并在修复性牙本质和反应性牙本质形成过程中起重要作用     

牙本质基质蛋白-1仿生多肽的设计与评价

[摘要] 目的 设计一种牙本质基质蛋白-1（DMP-1）的仿生多肽,仿生DMP-1与胶原纤维结合,并启动矿化功能。方法 依据DMP-1与胶原纤维结合的功能序列以及釉原蛋白介导羟磷灰石成核的功能序列,采用固相合成法合成DMP-1仿生多肽,其氨基酸序列为DSESSEEDRTKREEVD。利用免疫荧光法评价该多肽与胶原蛋白的结合能力;将其依次浸入氯化钙溶液和磷酸氢二钠溶液中,采用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）以及选区电子衍射环（SAD）分析其诱导羟磷灰石晶体成核生长的矿化能力。结果 免疫荧光结果表明：本研究设计的DMP-1仿生多肽可以与牙本质胶原纤维结合;SEM、TEM观察结果显示：该多肽可以从溶液中摄取钙磷离子,诱导羟磷灰石晶体成核矿化。结论 多肽DSESSEEDRTKREEVD可以模拟DMP-1与胶原蛋白结合及启动矿化的能力,可以作为研究牙本质仿生矿化的一种分子工具。     

Effect of resin matrix composition on the translucency of experimental dental composite resins

ObjectivesThe purpose of this study was to investigate the effect of the resin matrix composition on the translucency of experimental dental composite resins.MethodsThree types of unfilled resin matrices (TEGDMA-, UDMA- and BisGMA-based) were formulated and light cured. In addition, six different experimental dental composite resins with constant filler loading but varying in the type of monomer and the content of BisGMA were fabricated. Discs of each test material with 15.5 mm diameter and 1.0 mm thickness were prepared (N = 3) and light cured. Total and diffuse transmittance values for each sample were measured using a UV/VIS spectrophotometer with the range of readings from 380 to 700 nm. Difference in color was measured using the CIE Lab system.ResultsStatistical analysis by one-way ANOVA followed by Tukey's test showed that there was no statistically significant difference in transmittance values between the three unfilled resins. However, with the addition of filler, BisGMA-containing composite resins showed significantly higher transmittance values than the UDMA- and TEGDMA-based composite resins. Regression analysis revealed that there was a linear correlation between the percentage of BisGMA in the resin matrix and the total and diffuse translucency.SignificanceThe amount of BisGMA used in the resin matrix has a significant effect on the translucency of silica filler-containing dental composite resins.     

Maxillary sinus floor augmentation and dental implant placement using dentin matrix protein-1 gene-modified bone marrow stromal cells mixed with deproteinized boving bone: A comparative study in beagles

ObjectiveThe aim of the study was to evaluate the effects of the combined use of dentin matrix protein-1 (DMP1) gene-modified bone marrow stromal cells (BMSCs) and Bio-Oss^® for maxillary sinus floor augmentation (MSFA) implant placement in dogs.Materials and methodsBMSCs were derived from bone marrow of six beagles and cultured. The cells were transduced with a lentiviral vector overexpressing the DMP1 gene and enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene (Lenti-DMP1/EGFP) in test group, and with a lentiviral vector encoding EGFP gene (Lenti-EGFP) in control group. Six dogs received sinus augmentations using the bilateral approach with a simultaneous implant placement at each site respectively. At the same concentration, 2 × 10⁷ cells/ml, one sinus was grafted using a mixture of autologous DMP1/EGFP gene-modified BMSCs and Bio-Oss^® (DMP1 group), and the contralateral sinus was grafted with autologous EGFP gene-modified bMSCs and Bio-Oss^® (EGFP group). After a 3 month healing period, bone regeneration and osseointegration were evaluated using histologic and histomorphometric methods.ResultsThe bone-implant contact (BIC) and the bone area fraction in the DMP1 group (BIC: 34.67% ± 8.23%, bone area fraction: 35.16% ± 3.32%) were significantly greater compared with the EGFP group (BIC: 26.06% ± 5.16%, bone area fraction: 20.74% ± 1.63%) (P < 0.05). No significant difference between the residual bone substitute material volume (BSMV) in the DMP1 group (35.86 ± 7.35) and the EGFP group (32.16 ± 9.16) was found in our study (P > 0.05).ConclusionBMSCs modified with the DMP1 gene can be used as an adjunct to Bio-Oss^® to enhance new bone formation and the osseointegration of dental implants in MSFA of dogs.