川芎嗪对冻存内皮生长晕细胞的影响

目的:研究川芎嗪(TMP)对冻存复苏后内皮生长晕细胞(EOC)复苏率及其增殖、黏附、成血管能力的影响。方法:密度梯度离心法分离脐带血中单个核细胞,体外扩增培养EOC,免疫组化法、荧光染色法鉴定内皮细胞特性。采用不含TMP(对照组),和含10、25、50 ng/mL TMP的冻存液对EOC进行冻存,24 h后复苏并观察各组细胞在不同时间点的复苏率及增殖、黏附、成血管能力。结果:TMP 10 ng/mL组细胞与对照组细胞间复苏率、增殖、黏附及成血管能力差异无统计学意义,而25 ng/mL及50 ng/mL组的复苏率、增殖、黏附及成血管能力均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),与正常的未冻存组细胞接近。结论:TMP可以提高冻存后EOC的复苏率,并一定程度地保护复苏后细胞的增殖、黏附及成血管能力。     

普伐他汀对培养人内皮祖细胞药理作用的影响

目的观察普伐他汀对培养人内皮祖细胞（EPC）数量、增殖、迁移、黏附及一氧化氮（NO）合成能力的影响。方法采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,贴壁筛选法培养内皮祖细胞,培养7d后收集细胞并分别加入普伐他汀10μmol／L及100μmol／L,干预48h,免疫组化、荧光显微镜和流式细胞仪鉴定内皮祖细胞,分别观察内皮祖细胞的数量、增殖迁移黏附能力、细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、mRNA的表达以及培养液中NO的水平。结果普伐他汀组促进外周血内皮祖细胞扩增,并显著改善外周血内皮祖细胞的黏附、迁移、增殖以及eNOSmRNA表达和NO合成的能力。结论他汀类药物可增加培养人内皮祖细胞数量并改善其功能。     

胰岛素对人脐血内皮祖细胞生物活性的影响

目的探讨胰岛素对人脐血内皮祖细胞增殖、迁移与黏附功能的影响。方法采用Ficoll密度梯度离心法从人脐血中分离单个核细胞,加入EGM-2培养液,接种于包被人纤连蛋白的培养皿中贴壁培养,收集48 h后的悬浮细胞重新贴壁培养至第7天,利用免疫荧光和流式细胞术鉴定。细胞随机分为对照组和不同浓度(0.1、1和10nmol/L)胰岛素处理组干预24 h,分别采用MTT比色法、Transwell法和细胞黏附实验来观察胰岛素对内皮祖细胞增殖、迁移与黏附功能的影响。结果与对照组相比,0.1、1、10nmol/L的胰岛素干预内皮祖细胞24 h能明显增强其增殖、迁移和黏附能力(P<0.05或P<0.01);其中胰岛素浓度为1nmol/L时增殖功能达到峰值,胰岛素浓度为0.1nmol/L时迁移和黏附功能达到峰值。结论生理浓度与较低浓度胰岛素能增强内皮祖细胞的增殖、迁移与黏附能力。     

胰岛素对人脐血内皮祖细胞生物活性的影响

目的 探讨胰岛素对人脐血内皮祖细胞增殖、迁移与黏附功能的影响. 方法 采用Ficoll密度梯度离心法从人脐血中分离单个核细胞,加入EGM-2培养液,接种于包被人纤连蛋白的培养皿中贴壁培养,收集48 h后的悬浮细胞重新贴壁培养至第7天,利用免疫荧光和流式细胞术鉴定.细胞随机分为对照组和不同浓度(0.1、1和10 nmol/L)胰岛素处理组干预24 h,分别采用MTT比色法、Transwell法和细胞黏附实验来观察胰岛素对内皮祖细胞增殖、迁移与黏附功能的影响. 结果 与对照组相比,0.1、1、10 nmol/L的胰岛素干预内皮祖细胞24 h能明显增强其增殖、迁移和黏附能力(P<0.05或P<0.01);其中胰岛素浓度为1 nmol/L时增殖功能达到峰值,胰岛素浓度为0.1 nmol/L时迁移和黏附功能达到峰值. 结论 生理浓度与较低浓度胰岛素能增强内皮祖细胞的增殖、迁移与黏附能力.     

机采浓缩血小板-80℃长期冻存的动态的体外黏附、聚集功能和Ⅲ因子活性变化

目的 跟踪观察机采浓缩血小板(platelet apheresis concentrates,PCs)在5%DMSO条件下于-80℃冻存1～5年的体外功能变化.方法 玻璃珠柱检测血小板黏附功能,花生四烯酸诱导后检测血小板聚集功能,蝰蛇毒检测血小板Ⅲ因子活性.结果 对深低温保存的冻存血小板的动态观察发现:PCs冻存期为1～5年融化复苏后的黏附和聚集功能未发现有统计学意义(P＞0.05);冻存至第4年的血小板复苏时4/10样品发生凝集,第5年的有3/11发生凝集;冻存至第5年时,多数样品血小板Ⅲ因子失活.对22℃常温保存的液体血小板的观察发现:血小板的黏附功能和最大聚集能力随保存时间的延长逐渐下降,72 h有差异(P＜0.05),96 h有显著性差异(P＜0.01);5 d之内血小板Ⅲ因子活性无明显改变(P＞0.05).结论 22℃保存的液体血小板发生渐进的代谢损伤,而-80℃保存期在3年内的冻存血小板未见明显异常.     

冻存骨髓来源单个核细胞分化成内皮祖细胞的功能特性

目的:对新鲜和超低温保存的骨髓来源单个核细胞(MNC)体外扩增的内皮祖细胞(EPC)进行功能比较。方法:从猪髂骨抽取骨髓,对分离后的MNC进行培养或-80℃冻存3个月后再培养;冻存后培养的P1代细胞利用免疫组化及流式细胞技术进行EPC表面标志抗原鉴定。同时分别对新鲜和冻存培养的EPC获得率、细胞迁徙、黏附和增殖功能进行比较。结果:冻存组细胞免疫组化鉴定:CD133(+)、CD34(+)、CD31()、KDR(),流式细胞技术鉴定:CD133的阳性率(17.24±3.12)%,CD34的阳性率(37.21±10.85)%,CD31的阳性率(72.07±13.34)%,KDR的阳性率(89.09±16.40)%。新鲜和冻存的MNC经诱导培养后EPC获得率分别为(1.1±0.078)%、(1.03±0.061)%,P=0.054;细胞迁徙率分别为(15±0.71)%、(14.2±0.63)%,P=0.17;贴壁率分别为(42.7±2.1)%、(39.5±1.7)%,P=0.11;增殖功能分别为(25.06±2.82)×104、(21.64±2.34)×104,P=0.089。结论:超低温保存骨髓来源的MNC经诱导培...     

不同的冻存方法对脐血CD34~+细胞的影响

目的 :研究不同冻存方法对脐血CD34+ 细胞的影响 ,探讨脐血CD34+ 细胞先分离后冻存的可能性 ,以寻找脐血保存的更好方法。方法 :对 31份脐血采用全脐血直接冻存 ,分离为单个核细胞冻存 ,和分离为CD34+ 细胞冻存 ,3种不同的冻存方法 ;用造血祖细胞培养技术、活细胞染色技术、流式细胞技术等方法研究冻存前后脐血造血祖细胞活性的变化。结果 :冻存后细胞活度下降 ,集落形成率下降 ,以全脐血冻存组为甚 ;CD34+ CD38- 比例冻存后增高。结论 :先分离后冻存法可行 ,且具有减小冻存体积 ,对造血祖细胞损伤较小的特点 ;早期造血祖细胞可能更能耐受冻存处理     

冻存对血管内皮干细胞增殖和分化能力的影响

目的探讨冻存对人脐血来源血管内皮干细胞(EPCs)增殖、分化能力的影响。方法采用密度梯度离心法结合MACS分选法提取人脐血中CD133 细胞,进行流式细胞仪检测纯度;将EPCs冻存3,6,12,18个月后进行常规培养、诱导分化,利用细胞免疫组化进行鉴定,并比较不同冻存时间的EPCs的增殖能力。结果经流式细胞仪检测CD133 细胞平均占单核细胞的(1.13±0.10)%,磁珠分选所得CD133 细胞平均纯度为(91.45±1.04)%;CD133 细胞贴壁生长,可分化为梭形血管内皮细胞及形成集落,经免疫组化检测大部分表达CD34和Ⅷ因子;冻存3,6,12,18个月后,EPCs的增殖、分化能力有所下降。结论长时间的冻存可减弱EPCs的增殖、分化能力。     

脐血采集后分离时间对单个核细胞玻璃化冷冻效果的影响

目的 探索脐血采集后单个核细胞(MNC)最佳分离和冷冻的时间窗.方法 采集脐血6份,每份按采集后分离时间分为8h组、24h组、48h组和72h组.每组标本均在分离后进行MNC计数及台盼蓝染色检测细胞活率;各时间组细胞活率在50%以上的行体外CFU形成能力检测及玻璃化冷冻.冷冻10h后解冻进行细胞活率及体外CFU形成能力检测.结果 冷冻72h组细胞活率低于其他组(P<0.05);解冻后72h组MNC计数低于24h和48h组(P<0.05);48 h以后分离的MNC解冻后细胞活率降低(P<0.05).结论 脐血MNC采集后的48h内分离冷冻不影响细胞活率及冻存后集落形成能力.     

冻存对血管内皮干细胞增殖、分化能力的影响

目的 探讨冻存对人脐血来源血管内皮干细胞（EPCs）增殖、分化能力的影响。 方法 采用密度梯度离心法结合MACS分选法提取人脐血中CD133＋细胞，进行流式细胞仪检测纯度；将EPCs冻存3, 6, 12, 18个月后进行常规培养、诱导分化，利用细胞免疫组化进行鉴定，并比较不同冻存时间的EPCs的增殖能力。 结果 经流式细胞仪检测CD133＋细胞平均占单核细胞的（1.13±0.10）％，磁珠分选所得CD133＋细胞平均纯度为(91.45±1.04)％；CD133＋细胞贴壁生长，可分化为梭形血管内皮细胞及形成集落，经免疫组化检测大部分表达CD34和Ⅷ因子；冻存3, 6, 12, 18个月后，EPCs的增殖、分化能力有所下降。结论 长时间的冻存可减弱EPCs的增殖、分化能力。     

低氧促进人脐带血间充质干细胞向神经细胞分化

目的探讨低氧环境对脐带血间充质干细胞诱导分化成神经细胞的促进作用。方法收集4例志愿者脐带血,分离获得间充干细胞,体外扩增培养。研究分为常氧组、常氧诱导组、低氧组、低氧诱导组。研究低氧诱导培养的脐带血间充质干细胞组与对照组比较在细胞生物学特征、诱导分化能力等方面的差异。结果在5%含氧量条件下细胞的增生能力不同程度的提高;在诱导成神经细胞的过程中,低氧诱导的间充质干细胞向神经细胞的分化能力增强。神经细胞表面标记Nestin、NF-M表达阳性。与常氧诱导的脐带血间充质干细胞组比具有显著性差异（P〈0.05）。结论低氧条件可以提高脐带血间充质干细胞向神经细胞分化的产率。     

无血清培养基对深低温冻存复苏后的间充质干细胞免疫功能的研究

目的:探讨无血清培养基对冻存后的间充质干细胞（HUC-MSCs）免疫调节功能的影响,明确其成脂成骨生物学特性,为临床应用奠定基础。方法:（1）分离脐带中的HUC-MSCs,传代纯化后深低温冻存。（2）冻融后的HUC-MSCs分别以含10%胎牛血清的培养基（SCM）,无血清培养基两种培养条件培养。（3）观察两组细胞生长状态,革兰染色计数,计算细胞活率。（4）流式细胞术检测两组细胞的表面标志物。（5）成脂成骨诱导,茜红素染色和油红染色观察诱导情况。结果:（1）两组细胞均以漩涡状贴壁,无血清培养基培养的细胞体积略小。（2）在细胞总数及活性方面,两组细胞有些微差异,可忽略不计。（3）流式细胞术显示其对PE-CD34不表达,对PE-CD105、PE-CD90、PE-CD73、PE-CD44和PE-CD29高表达。（4）对无血清培养基（SFM）所培养得到的HUC-MSCs历经约21 d的成骨细胞和脂肪细胞专向分化诱导,发现其具有可媲美SCM培养的HUC-MSCs的分化能力。结论:无血清培养基同有血清培养基相比,对深低温冻存复苏后的间充质干细胞免疫调节功能无明显差异,可替代有血清培养基进行细胞培养。     

肺动脉高压大鼠骨髓内皮祖细胞功能的研究

目的检测实验性肺动脉高压大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）的功能,探讨肺动脉高压发病机制。方法利用野百合碱诱导大鼠发生肺动脉高压,分离骨髓单个核细胞进行体外诱导培养以获得EPC集落,并对其骨髓内皮祖细胞的集落形成能力、增殖、黏附、迁移能力进行检测。结果骨髓单个核细胞在体外培养下能够获得EPC集落,与对照组比较,肺动脉高压实验组诱导生成的EPC数量少（P〈0.05）,CD34和FLK-1阴性比例下降（分别为19.33%±3.27%vs 31.17%±4.40%和33.67%±3.50%vs 44.50%±3.78%,P均〈0.01）,细胞增殖能力下降（0.43±0.08 vs 0.64±0.07,P〈0.01）,贴壁细胞减少（6.835个±1.605个vs 10.175个±1.945个,P〈0.01）,细胞迁移能力下降（7.83个±1.94个vs 11.83个±2.48个,P〈0.05）。结论肺动脉高压的发生与骨髓内皮祖细胞功能的异常存在明显的相关性。     

脐血造血细胞的冷冻保存方法的比较

目的 :比较程控降温和 - 70℃冰箱直接保存脐血造血细胞对细胞活性的影响及免疫磁珠分离法对细胞生物学活性的影响。方法 :用密度梯度离心法分离出脐血中单个核细胞后 ,采用联合冷冻保护剂经程控降温后存放于液氮和直接存放于 - 70℃冰箱两种方法冷冻保存一个月 ,从细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率等方面比较这两种冷冻方法的优劣。另外 ,用免疫磁珠分离法正性分选脐带血中CD34+细胞 ,流式细胞仪计数分选前后的CD34+细胞的纯度及回收率 ,并分别进行分选前后的细胞培养。结果 :细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率在冷冻的两组间差异不显著。用免疫磁珠分选后CD34+细胞纯度达 88.3% ,回收率为 4 6 .2 % ,分选后的CD34+细胞比分选后CD34 细胞的细胞活力及集落形成能力明显要高。结论 :两种方法均可对脐血造血细胞进行保存。免疫磁珠分选法能够提供高纯度的造血干细胞 ,其分选过程不会影响细胞的活力及集落形成能力 ,为CD34+细胞分选和移植的临床应用提供实验依据     

脐血造血细胞的冷冻保存方法的比较

目的：比较程控降温和－70℃冰箱直接保存脐血造血细胞对细胞活性的影响及免疫磁珠分离法对细胞生物学活性的影响。方法：用密度梯度离心法分离出脐血中单个核细胞后，采用联合冷冻保护剂经程控降温后存放于液氮和直接存放于－70℃冰箱两种方法冷冻保存一个月，从细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率等方面比较这两种冷冻方法的优劣。另外，用免疫磁珠分离法正性分选脐带血中CD34＋细胞，流式细胞仪计数分选前后的CD34细胞的纯度及回收率，并分别进行分选前后的细胞培养。结果：细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率在冷冻的两组间差异不显著。用免疫磁珠分选后CD34＋细胞纯度达88.3%，回收率为46.2%，分选后的CD34＋细胞比分选后CD34－细胞的细胞活力及集落形成能力明显要高。结论：两种方法均可对脐血造血细胞进行保存。免疫磁珠分选法能够提供高纯度的造血干细胞，其分选过程不会影响细胞的活力及集落形成能力，为CD34＋细胞分选和移植的临床应用提供实验依据。     

大鼠嗅鞘细胞的纯化及活性检测

目的采用改良差速贴壁联合胰酶限时消化法纯化大鼠嗅鞘细胞,并检测嗅鞘细胞的生物活性。方法分离新生7d的SD大鼠嗅球嗅鞘细胞,分组后采用改良的6h和18h两次差速贴壁法联合不同时段（1、3和5min）胰酶消化法纯化培养,观察不同时段纯化的嗅鞘细胞的形态特点及生长情况;应用FITC标记的神经生长因子受体p75抗体（兔抗鼠NGFRp75抗体）检测嗅鞘细胞并评估细胞纯度;应用CCK-8法和酶联免疫吸附法分别检测嗅鞘细胞在纯化后3～15d的增殖活性和分泌脑源性神经营养因子的含量。结果随着细胞的生长,梭形的嗅鞘细胞逐渐增多;改良差速贴壁联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞纯度分别为（57.52±2.13）%、（78.95±2.60）%、（49.01±0.74）%,3min组最明显,组间两两比较差异有统计学意义（P〈0.05）;改良差速贴壁法联合胰酶限时消化1min、3min、5min法所得嗅鞘细胞在纯化后7、9、11d时增殖的细胞数目和脑源性神经营养因子分泌量显示3min组最优,组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论改良差速贴壁（6h＋18h）联合胰酶限时消化3min的纯化方法能获得较高纯度的嗅鞘细胞。     

联合低温保护剂对脐血造血干细胞长期低温保存的作用

目的 观察联合低温保护剂对脐血造血干细胞长期低温保存的作用。方法 60份由联合低温保护剂（5％DMSO＋6％HES＋5％人体白蛋白）保存在岭南脐血库的脐血,按时间分为1,2,3,4年等4组,复温后观察其细胞活力、总有核细胞数（TNC）、CD34^ ,CD34^ CD38^-,CFU-GMey BFU-E的回收率。结果 60例脐血冻存后的细胞活力为96．39％,TNC,CD34^ ,CD34^ CD38^-,CFU-GM及BFU－E的回收率分别是95．89％,94．45％,88．88％,87．77%及83．18％,不同时间组的上述指标之间差异无显著性（P＞0．05）。结论 联合低温保护剂具有效果可靠、操作简单等优点,适用于脐血造血干细胞的长期低温保存。     

造血干细胞低温保存与临床应用

目的观察低温保存造血于细胞（hematopoietic stem cell,HSC）的效率及冻存HSC的临床应用情况。方法25例骨髓造血干细胞（bone marrow stem cell,BMSC）以10％二甲基亚砜加10％自体血浆为冷冻保护剂,采用程控降温液氮保存。21例外周血于细胞（peripheral blood stem cell,PBSC）采用CP1（cryopreservativesl）加4％人血白蛋白为冷冻保护剂,非程控降温后液氮保存或低温冰箱保存。检测复温后单个核细胞（MNC）回收率、粒-单细胞集落形成单位（CFU—GM）回收率、台盼蓝拒染率（TBR）,并行细菌学培养,移植后观察输注反应及植入情况。结果BMSC冻存时间为1～3个月,中位时间1个月。复温后MNC回收率为（97．74±0．85）％,TBR为（96．74±0．91）％,CFU—GM回收率为（72．04±1．87）％。PBSC冻存时间为1～20个月,中位时间2个月。复温后MNC回收率为（97．75±1．34）％,TBR为（96．28±2．16）％。复温后46份标本细菌学培养均为阴性。实施自体骨髓造血干细胞移植（ABMSCT）25例,中性粒细胞绝对值（ANC）〉0．5×10^9／L的时间为（10．79±0．93）d,血小板计数（PLT）〉20×10^9／L的时间为（12．88±0．95）d。实施自体外周血造血干细胞移植（APBSCT）21例,ANC〉0．5×10^9／L的时间为（10±1．14）d,PLT〉20×10^9／L的时间为（12．04±2．13）d。两组间MNC回收率和TBR比较均无显著性差异,移植后APBSCT组ANC〉0．5×10^9／L的时间早于ABMSCT组,有显著性差异（P〈0．05）,但PLT〉20×10^9／L的时间两组无显著差异。出院前所有患者复查骨髓均示增生活跃或明显活跃。BMSC输注出现的不良反应明显多于PBSC输注。结论采用联合冷冻保护剂、非程控降温后液氮保存或低温冰箱保存来冻存HSC是切实可靠的,这种方法操作简便、价格低廉、安全有效;建议今后冻存BMSC前应去除红细胞。     

高增殖潜能内皮祖细胞促进脐血造血祖细胞体外扩增

目的：研究脐血来源高增殖潜能内皮祖细胞支持脐血造血干／祖细胞体外扩增的能力。方法：利用第3代的HPP—EPC联合细胞因子培养脐血造血干／祖细胞,分因子组、非接触培养组和接触培养组。体外培养脐血CD34＋细胞10d后,从细胞总数,CD34＋细胞数,各系造血集落形成细胞数等比较各组的扩增效率。结果：接触组细胞总数扩增倍数（44．6±8．7）倍和非接触组（39．5±7．3）倍均高于因子组（24．8±5．6）倍,P〈0．01。接触组CD34＋细胞数扩增倍数（8．8±2．1）倍高于因子组（2．9±0．6）倍和非接触培养组（3．3±0．6）倍,P〈0．01。接触组集落扩增倍数和非接触组均分别高于因子组,P〈0．05,且接触组各造血集落扩增数均分别高于非接触组,各P〈0．05。接触组扩增后CD34＋CD38＋细胞（10．8％±2．7％）明显高于因子组（4．1％±0．9％）和非接触培养组（3．8％±0．8％）,P〈0．01。结论：脐血来源高增殖潜能内皮祖细胞能支持脐血CD34＋细胞体外扩增。