炎症因子通过核因子κB通路促进口腔鳞状细胞癌转移的体外研究

目的 探讨炎症因子与核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号转导通路在口腔鳞状细胞癌转移中的意义.方法 应用口腔鳞状细胞癌低转移细胞系Tca8113和高转移细胞系Tb为研究对象,通过蛋白质印迹法和荧光素酶报告基因法检测口腔鳞状细胞癌细胞系中NF-κB通路活性.用NF-κB抑制因子α(inhibitor of kappa B alpha,IκBa)抑制质粒第32、36位丝氨酸磷酸化位点被丙氨酸替代的质粒(pBabe-SR-IκBa)和NF-κB通路抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrolidinedithiecar bamate,PDTC)抑制信号转导通路活性,并用侵袭小室实验(TransweH)检测口腔鳞状细胞癌高转移系Tb细胞侵袭能力的变化.此外,通过酶联免疫吸附法检测pBabe-SR-IκBα和PDTC抑制信号转导通路后,肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素(IL)-1a、IL-6、IL-8和粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)等炎症因子的分泌.结果 蛋白质印迹法检测显示:高转移Tb细胞中磷酸化IκBα和磷酸化p65的表达量明显高于低转移细胞系Tea8113,分别为Tea8113细胞的3.19倍和6.81倍.荧光素酶(luciferase)报告基因结果显示,Tb细胞NF-κB的启动子活性为Tca8113的2.12倍(P<0.01),并对TNF-α更为敏感.转染pBabe-SR-IκBα和应用PDTC抑制NF-κB通路后,对Tb细胞的体外侵袭能力抑制率分别为21.9%和69.3%.此外,酶联免疫吸附试验法显示通路抑制后,TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8和GM-CSF等炎症因子的分泌也明显降低.结论 TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8和GM-CSF等炎症因子可能通过NF-κB通路促进口腔鳞状细胞癌细胞转移.     

PPARγ在脂多糖刺激牙周膜细胞中调控NF-κB信号通路的作用研究

目的:探讨PPARγ在牙周炎中调控作用机制。方法:组织块法培养健康人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs)并鉴定。细胞处理分为以下4组,A组:对照组;B组:脂多糖(lipopolysaccharide,LPS )刺激组;C组:罗格列酮对照组,即二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)处理组;D组:罗格列酮处理组。免疫印迹法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)和核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB) p65胞核、胞浆及总蛋白含量,细胞免疫荧光检测NF-κB p65表达部位。实时定量PCR和酶联免疫法检测白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)RNA和蛋白表达。结果:LPS刺激下,胞核PPARγ表达降低NF-κB p65表达升高,相应的IL-1β和TNF-α RNA及蛋白表达量均升高。同时加入罗格列酮后,胞核PPARγ表达升高NF-κB p65表达降低,且IL-1β和TNF-α RNA及蛋白表达量均降低。差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:PPARγ通过下调NF-κB信号通路抑制脂多糖刺激下牙周膜细胞炎症因子RNA表达和蛋白分泌,进而调节牙周炎症反应。     

核因子-κB与肿瘤坏死因子α、白介素1β在口腔扁平苔藓中的表达及意义

目的检测核因子-kappaB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素1β(Interleukin1β,IL-1β)在口腔扁平苔癣组织中的表达并探讨3种因子在口腔扁平苔癣发病中的作用。方法采用SP免疫组化方法检测35例口腔扁平苔癣及10例正常口腔黏膜组织中NF-κB及TNF-α、IL-1β的表达情况,并进一步分析三者的相关性及各自与口腔扁平苔癣临床特征的关系。结果 NF-κB阳性染色主要定位于细胞的胞核和胞质,主要表达于棘层和基底层的角化细胞以及固有层淋巴细胞浸润带中。而TNF-α和IL-1β阳性染色定位于细胞质中,主要表达于口腔扁平苔癣中棘层和基底层角化细胞及固有层淋巴细胞浸润带中。三种因子的表达与临床分型有关,但与病损部位、性别、年龄关系不密切。结论口腔扁平苔癣中NF-κB和TNF-α、IL-1β高表达,且NF-κB与两者互为正相关关系,提示在OLP发病中TNF-α及IL-1β的高表达与NF-κB通路的活化密切相关。     

N-乙酰半胱氨酸对脂多糖诱导的血管内皮细胞炎症损伤的影响

目的:探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)是否对脂多糖(LPS)刺激的血管内皮细胞具有保护作用,为NAC用于治疗种植体周围炎、牙周炎等提供理论基础。方法:通过细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测不同浓度的LPS或NAC对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖的影响,以获得刺激HUVECs的最适药物浓度。添加最佳药物浓度的LPS和(或)NAC处理HUVECs 24 h,实时半定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测炎症因子白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和细胞粘附分子-1(ICAM-1)的mRNA表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TNF-α和IL-8的蛋白表达;Western blot法检测ICAM-1和NF-κB信号通路的表达情况。结果:LPS刺激HUVECs过量表达炎症因子TNF-α、IL-8和ICAM-1。此外,LPS增加NF-κB通路的磷酸化P65(pP65)表达。然而,NAC预处理HUVECs后,显著抑制了LPS引起的TNF-α、IL-8和ICAM-1表达的增加及降低了pP65的分泌水平。结论:本结果表明NAC保护血管内皮细胞免受LPS介导的炎症损伤,从而减轻炎症反应,其潜在的机制可能与NF-κB信号通路有关。     

白藜芦醇减轻LPS诱导的牙周膜细胞损伤并抑制TLR4/NF-κB活化

目的:探究白藜芦醇(RES)对脂多糖(LPS)诱导的人牙周膜细胞(hPDLCs)损伤的保护作用.方法:体外培养并鉴定hPDLCs,将培养的hPDLCs随机分为5组:对照组、LPS(10 μg/ml)+RES(0、30、60、90tμmol/L)组,MTT法检测各组细胞增殖能力,ELISA检测各组细胞分泌TNF-α/IL-6水平,PCR和Western blot检测各组细胞TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表达.结果:分离培养的hPDLCs抗波丝蛋白表达阳性,抗角蛋白表达阴性.与对照组比,LPS处理后细胞增殖能力明显降低,细胞分泌TNF-α/IL-6水平和TLR4/NF-κB mRNA和蛋白表达明显增加;30～90 μmol/L白藜芦醇预处理后,细胞增殖能力增加(P＜0.05),细胞分泌TNF-α/IL-6水平、TLR4/NF-κB mRNA以及蛋白表达则下调(P＜0.05),均呈现一定的浓度依赖性.结论:白藜芦醇可抑制TLR4/NF-κB活化并减轻LPS诱导的牙周膜细胞损伤.     

核因子κB受体活化因子配体和肿瘤坏死因子α经炎性牙周膜干细胞外泌体促进破骨细胞分化

目的　慢性牙周炎表现的病理性骨吸收非常常见,牙周膜干细胞（PDLSCs）的外泌体（Exo）对骨吸收的作用和影响尚不明确,本研究分析了该Exo蛋白组分对破骨细胞分化的影响。方法　分别从正畸前拔牙患者和慢性牙周炎患者的牙周膜组织中提取PDLSCs,通过流式细胞术检测表面标记物;通过差速离心分别提取2种细胞的Exo,即Exo-WT和Exo-CP,并通过Western blot、透射电子显微镜（TEM）、蛋白浓度检测、纳米粒径追踪检测Exo特征;通过蛋白质谱检测2种Exo的蛋白组分;通过酶联免疫吸附（ELISA）验证了差异表达蛋白肿瘤坏死因子α（TNF-α）、核因子κB受体活化因子配体（RANKL）、白细胞介素（IL）-1α、转化生长因子β（TGF-β）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）表达水平;将10、100、1 000 μg·mL^-1的Exo-CP或Exo-WT加入RAW264.7培养基中并于5 d时通过实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、Western blot、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测破骨分化相关指标表达情况;采用SPSS 24.0软件对实验数据进行统计学分析。结果　Exo-CP富集的差异表达蛋白主要与破骨细胞分化的TNF信号通路、核转录因子κB（NF-κB）信号通路相关;ELISA实验证实了Exo-CP中高表达TNF-α、RANKL、IL-1α,低表达TGF-β1、BMP-2（P<0.05）;Exo-CP作用于RAW264.7,显著提高了细胞的破骨分化相关基因及蛋白的表达水平,TRAP染色可见分化的破骨细胞,且呈现浓度依赖性,100、1 000 μg·mL^-1浓度Exo-CP对破骨细胞分化的促进作用显著高于10 μg·mL^-1浓度组（P<0.05）。结论　慢性牙周炎的病理性骨吸收可能由炎性PDLSCs所分泌的Exo通过促进破骨细胞分化引起,Exo中主要的作用蛋白可能为RANKL和TNF-α,本研究为慢性牙周炎骨吸收的发病机制提供了新视角。     

TNF-α及LPS刺激下牙周膜干细胞IκB磷酸化及其下游基因的表达

目的:研究TNF-α及LPS刺激下牙周膜干细胞IκB磷酸化及其下游基因的表达.方法:体外分离、培养人牙周膜干细胞,分别在10 ng/mL TNF-α和500 ng/mL Ecoli.LPS刺激下进行培养,并于刺激培养即时(0 h)、5、30 min和1、2h,采用Western Blot法检测IκBα总蛋白和磷酸化IκBα蛋白的表达变化;Real-time PCR检测IL-6、IL-8 mRNA的表达水平.结果:牙周膜干细胞在10 ng/mL TNFα或500 ng/mL Ecoli.LPS刺激下培养0～2h不同时间后,IκBα总蛋白随刺激时间逐渐降低,1h时最低;磷酸化IκBα随刺激时间逐渐升高,2h时最高;NFκB的下游基因IL-6及IL-8mRNA表达水平均随刺激时间逐渐升高,2h时升高最明显(P＜0.05).结论:炎症细胞因子TNF-α或LPS均可促进牙周膜干细胞中IκBα蛋白的磷酸化,并上调IL-6、IL-8 mRNA的表达;提示NFκB信号通路的活化可能是导致炎症状态下牙周膜干细胞功能损害的重要因素.     

MTA对牙周膜干细胞RANKL/OPG表达水平的影响

目的 探讨MTA对人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-κB ligand,RANKL）、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）表达的影响。方法 通过酶消化法分离培养PDLSCs,依据碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性筛选最佳MTA刺激浓度,将PDLSCs分别于对照组（普通培养基）和2 mg/mL MTA条件培养液培养3 d和7 d后,蛋白免疫印迹法分别检测RANKL、OPG蛋白表达。结果 MTA刺激3 d和7 d组,OPG蛋白表达较对照组升高,RANKL蛋白表达较对照组降低。结论 MTA可通过调节RANKL/OPG系统,参与调节PDLSCs成牙/骨及破牙/骨活性。     

TNF-α和PGE2联合在人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG mRNA表达中的作用

目的:探讨不同浓度组合的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和前列腺素E2(PGE2)在人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)及其饵受体骨保护素(OPG)mRNA表达中的作用。方法:将体外培养的人牙周膜成纤维细胞用不同浓度组合的TNF-α和PGE2处理24h,通过荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)来观察人牙周膜成纤维细胞RANKL、OPG mRNA表达水平。结果:不同浓度组合对人牙周膜成纤维细胞RANKL/OPG mRNA表达有促进作用,尤以10ng/mL TNF-α 10-7mol/L PGE2组合对RANKL mRNA表达的促进作用及RANKL/OPG比值的增强作用最为明显。结论:10ng/mL TNF-α和10-7mol/L PGE2联合具有协同作用,通过促进人牙周膜成纤维细胞RNAKL/OPG表达量,可能在调节牙周炎引起的牙槽骨吸收中起到重要的作用。     

miR-100调节IGF1R/mTOR信号通路对牙周炎牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

目的:探究MicroRNA-100(miR-100)对牙周炎牙周膜干细胞(PDLSCs)增殖和成骨分化的影响及潜在机制。方法:丝线结扎法构建牙周炎大鼠模型，建模后分为模型组、NC-agomir组、miR-100 agomir组、NC-antagomir组和miR-100 antagomir组(n=10),另取10只大鼠为对照组。体外培养PDLSCs,分为对照组、TNF-α组、miR-100-NC+TNF-α组、miR-100 mimics+TNF-α组、miR-100 inhibitor+TNF-α组、miR-100 mimics+TNF-α+Oe-NC组、miR-100 mimics+TNF-α+Oe-IGF1R组。细胞经相应处理后检测有关因子表达。结果:上调miR-100可显著降低牙周炎大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平和牙周组织IGF1R和mTOR的mRNA水平(P<0.05),减轻牙周组织病变，而下调miR-100表现出相反作用。在PDLSCs中，miR-100过表达可显著抑制IGF1R和mTOR表达，上调Cyclin E1、Cyclin D1及分化相关蛋白八聚...     

核因子κB对维持口腔癌相关巨噬细胞炎症细胞募集表型的作用

目的:探讨NFκB在维持口腔癌相关巨噬细胞炎症细胞募集表型中的作用.方法:使用Cal27条件培养基刺激诱导小鼠原代巨噬细胞,形成口腔癌相关巨噬细胞,利用NFκB小分子抑制剂Bay11-7082抑制NFκB信号通路.利用RT-PCR、ELISA检测募集炎症细胞相关趋化因子的表达及分泌变化.采用GraphPadPrism5对数据进行统计学分析.结果:Bay11-7082处理的巨噬细胞能够抑制Cal27条件培养基诱导原代巨噬细胞形成肿瘤相关巨噬细胞的梭状外形;同时,在mRNA水平抑制炎症细胞募集相关趋化因子MCP-1、GM-CSF、MCP-5以及CCL-5的表达上调(P＜0.05).在蛋白质水平,对NFκB的抑制能够显著减少Cal27条件培养基导致的巨噬细胞MCP-1、GM-CSF分泌增加(P＜0.001).结论:NFκB信号通路可能参与口腔癌相关巨噬细胞募集炎症细胞表型的维持.     

TNF-α在慢性根尖周炎骨破坏中的机制探讨

目的:探讨牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis,P.e)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是否诱导成骨细胞产生肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及TNF-α是否通过核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路上调巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)的产生.方法:以不同浓度P.e-LPS (0～50 mg/L)刺激MC3T3-E1细胞和以10 mg/L P.e-LPS作用细胞不同时间(0～24 h)后,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测TNF-α mRNA的表达;以不同浓度TNF-α(0～ 10 ng/L)刺激MC3T3-E1细胞后,采用RT-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测M-CSF mRNA和蛋白的表达;再以ELISA方法检测BAY 11-7082对TNF-α刺激MC3T3-E1细胞后M-CSF蛋白表达的影响.采用SPSS 13.0软件包对结果进行单因素方差分析和Dunnett t检验.结果:不同质量浓度的P.e-LPS (0～50 mg/L)刺激MC3T3-E1细胞后,TNF-α mRNA的表达具有剂量依赖性;10 mg/L P.e-LPS作用MC3T3-E1细胞6h时,TNF-α mRNA的表达量最大.随着作用时间的延长,TNF-α mRNA的表达量逐渐下降;不同质量浓度TNF-α(0～10 ng/L)刺激MC3T3-E1细胞后,M-CSF mRNA和蛋白的表达具有剂量依赖性,蛋白表达量从(37±2) ng/L(空白对照组)增加到(301±8) ng/L(10 ng/L组);10 mol/L BAY 11-7082预处理1h可以降低TNF-α诱导成骨细胞M-CSF蛋白的表达水平,蛋白表达量从(253±14) ng/L(TNF-α组)下降到(154±2)ng/L(BAY+TNF-α组),而单独使用BAY 11-7082组与空白对照组相比差异无显著性.结论:P.e-LPS诱导成骨细胞产生TNF-α,而TNF-α上调M-CSF可能通过NF-κB信号通路,这意味着TNF-α可能在P.e-LPS致慢性根尖周炎骨破坏中对成骨细胞发挥自分泌作用.     

金地鼠颊囊癌变过程中IκBα蛋白表达的研究

目的 :探讨核转录因子的抑制蛋白IκBα在金地鼠颊囊鳞癌发生过程中的表达及意义。方法 :建立金地鼠颊囊癌变的动物模型。采用SABC免疫组织化学方法 ,检测在地鼠颊囊黏膜正常上皮 (n =2 2 ) ,上皮单纯增生 (n =2 0 ) ,上皮异常增生 (n =35 ) ,鳞状细胞癌 (n =2 3)中IκBα的表达变化。结果 :各阶段均有IκBα的表达 ,但表达强度不同 ,呈现一种动态变化过程。在正常颊囊黏膜组织和上皮单纯增生组织中IκBα局限表达于基底层和棘层底部细胞的胞浆中。随着上皮异常增生的出现及异常增生程度的加重 ,IκBα表达显著下降 ,较正常组和单纯增生组有显著性差异 (P <0 .0 5 )。一旦鳞癌生成后 ,IκBα表达上调 ,明显高于上皮异常增生组 (P <0 .0 1) ,甚至超过癌变前正常水平 (P <0 .0 1)。结论 :IκBα在金地鼠颊囊癌变过程中的表达异常 ,尤其是在上皮异常增生阶段的表达水平下调 ,可能是口腔黏膜上皮癌变过程中的一个早期事件 ,且可将其作为口腔癌变监测的生物学指标之一     

内皮素-1对牙周膜干细胞肿瘤坏死因子表达的影响

目的:探讨内皮素-1(endothelin-1,ET-1)对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)表达的影响。方法:体外培养鉴定牙周膜干细胞,加入不同浓度(1,10,100 nmol/L)的ET-1培养12、24、72 h,以未作任何处理的牙周膜干细胞为对照,采用ELISA及Western blot检测ET-1作用下牙周膜干细胞TNF-α分泌及蛋白表达的改变。结果:与对照组相比,ET-1对牙周膜干细胞TNF-α分泌及蛋白表达具有显著促进作用,且促进作用具有剂量依赖性及时间依赖性。结论:内皮素-1可以诱导牙周膜干细胞分泌TNF-α,而且这种促进作用呈浓度依赖性及时间依赖性。     

AMPK/NF-κB参与牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导的人牙周韧带细胞的炎症反应

目的:探索牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide, PgLPS)刺激对人牙周韧带细胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs)引起炎症反应的机制的影响。方法:体外培养hPDLCs,以PgLPS梯度浓度进行干预，CCK-8法检测细胞活性，qRT-PCR法检测细胞IL-6、IL-8、AMPK、NF-κB mRNA的表达水平，ELISA法检测上清IL-6、IL-8的浓度，Western Blot法检测细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)、核转录因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、核转录因子抑制蛋白α(inhibitor of NF-κBα,IκBα)的蛋白活性。结果:与对照组相比，PgLPS刺激能提高细胞IL-6、IL-8分泌，降低细胞p-AMPK表达，增强p-IκBα、p-NF-κB表达，且均呈现浓度依赖性(P<0.05);AMPK、NF-κB、IL-6和IL-8的核酸表达水平(mR...     

核转录因子-κB在金地鼠颊囊癌变过程中的表达研究

目的　探讨核转录因子-κB家族成员的重要亚基p65及其抑制蛋白IκBα在金地鼠颊囊鳞癌发生过程中的 表达及意义。方法　建立金地鼠颊囊癌变的动物模型,采用Western blot法检测金地鼠正常颊黏膜、上皮单纯增生 黏膜、上皮异常增生黏膜和鳞癌组织所提取的核蛋白中p65的表达差异;采用SABC免疫组织化学法检测在金地鼠 颊黏膜正常上皮、上皮单纯增生、上皮异常增生、鳞状细胞癌中IκBα的表达变化。结果　正常黏膜和上皮单纯增生 黏膜中,p65表达很弱,但普遍存在IκBα的表达,该表达多局限于黏膜基底层和棘层底部细胞的胞浆中。随着上皮 异常增生的出现,p65表达增强,与正常黏膜和单纯增生黏膜相比有统计学意义(P<0.01),而IκBα表达则显著下 降(P<0.05)。鳞癌组织中p65的表达显著高于正常黏膜和异常增生黏膜(P<0.01),IκBα的表达显著升高,明显 高于上皮异常增生黏膜(P<0.01),甚至超过正常水平(P<0.01)。结论　p65在金地鼠颊囊鳞癌发生、发展过程中 被激活。p65和IκBα在金地鼠颊囊癌变过程中的表达异常,上皮异常增生阶段p65的表达上调而IκBα的表达下调, 可能是口腔黏膜上皮癌变过程中的早期事件,可作为口腔早期癌变监测的生物学指标。     

核因子-κBp65与IκBα在口腔白斑及鳞癌中的表达

目的：探讨核因子-κB（nuclear factorκB,NF-κB）p65及其抑制蛋白IκBα在口腔白斑（OLK）及口腔鳞癌（OSCC）中的表达及其关系。方法：应用免疫组织化学技术检测正常口腔黏膜上皮（n=10）、OLK（n=46）及OSCC（n=36）中的NF-κBp65、IκBα表达。结果：NF-κBp65在正常口腔黏膜、单纯增生型OLK、异常增生型OLK及OSCC的表达率分别为：0%、9.09%、42.86%、72.22%,4组之间差异具有统计学意义（P〈0.05）;IκBα在4组中呈动态表达,分别为：10%、81.82%、48.57%、86.11%,4组之间差异具有统计学意义（P〈0.05）。NF-κBp65与IκBα的表达在OLK癌变过程中呈负相关（P〈0.05）,在癌组织中呈正相关（P〈0.05）。结论：二者可能是检测OLK的恶变潜能及OSCC早期诊断的敏感指标。