实时定量PCR在血流感染病原体快速检测中的应用

目的探讨实时定量PCR在血流感染病原体检测中的临床应用价值。方法选取收治的80例患者共92份血液标本进行实时定量PCR检测,同时进行血液培养,比较两种方法的特异度和敏感度。结果在92份标本当中,两种方法共同阴性标本66份(71.7%),两种方法共检测出病原体10种。实时定量PCR和血培养共同检出阳性标本7例,两种方法的一致性为79.3%。实时定量PCR的阴性预测值是0.94,敏感度是0.64,特异度是0.82。其中15份标本实时定量PCR阳性而血培养阴性,4份标本血培养阳性而实时定量PCR阴性。其中2份标本所培养出的病原体不在实时定量PCR的检测范围内,且实时定量PCR也不能检测光滑念珠菌。结论实时定量PCR是快速检测血液感染标本的有价值方法,但不能完全替代血培养。     

实时荧光定量RT—PCR定量分析mRNA表达水平原理及应用

实时荧光定量RT—PCR技术是一种新近发展起来定量检测mRNA表达水平的灵敏方法。本介绍了目前应用的四种荧光定量RT—PCR反应系统：即水解探针、杂交探针、DNA—染料结合和分子灯标RT—PCR反应系统，并对实时荣光定量RT—PCR反应系统的实验设计原则及所需仪器进行了介绍。     

终点法荧光定量PCR检测HBV-DNA的临床应用

目的运用终点法荧光定量PCR检测HBV-DNA,探讨其临床应用价值。方法运用本研究组制备的引物和荧光探针分别将HBV-DNA质粒及临床标本进行普通PCR和实时荧光定量PCR反应,再将普通PCR产物在荧光测定仪上测定荧光强度,与实时荧光定量PCR结果相比较,观察其符合程度。另外,运用相同方法比对本研究制备的PCR体系与市售荧光定量PCR试剂检测HBV-DNA的符合程度。结果终点法荧光定量PCR与实时荧光定量PCR检测HBV-DNA质粒及临床标本结果一致(P>0.05),与市售荧光定量PCR试剂比较,其符合程度较高(P>0.05)。结论终点法荧光定量PCR检测临床HBV-DNA标本稳定可靠,可作为荧光定量PCR的应用方法之一在基层医院推广应用。     

实时定量PCR应用中的问题及优化方案

实时定量PCR是利用PCR反应过程中所产生的荧光强度进行实时检测的定量PCR反应。目前 ,该方法已在生命科学领域得到了广泛的应用 ,本文对其应用过程中存在的主要问题加以分析 ,探讨优化实验方法。     

实时荧光定量PCR与PCR-ELISA在乙型肝炎病毒DNA定量检测中的应用比较

目的评价应用国产试剂的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA中的临床应用。方法基于TaqMan探针技术的实时荧光定量PCR应用Roche公司LightCycler仪器和国产达安试剂,PCR酶联免疫吸附试验(ELISA)应用Roche公司COBASAmplicor全自动内标法系统,用2种方法检测乙型肝炎患者血清中的HBVDNA,评价其灵敏度、精密度及相关性。结果实时荧光定量PCR方法的灵敏度略低于PCR ELISA全自动内标法,两者变异系数(CV)均较低,用2种方法检测临床标本,相关系数为0.890。结论应用国产试剂配合LightCycler仪器的实时荧光定量PCR具有较高的灵敏度和较好的重复性,并与PCR ELISA全自动内标法有良好的相关性。     

应用实时荧光定量PCR技术检测外周血白细胞分子标志物评估胰岛素敏感性的研究

[目的]通过建立实时荧光定量PCR技术检测外周白细胞中mRNA基因表达差异的方法来评定或预测胰岛素抵抗的发生，以期了解其在2型糖尿病发生中所发挥的作用。[方法]应用实时荧光定量PCR技术检测中国北方居民，年龄、性别相匹配的胰岛素抵抗者和胰岛素敏感者外周血白细胞mRNA基因表达水平，根据候选基因（未知序列）的mRNA表达浓度差异。了解胰岛素抵抗的发生情况。[结果]（1）建立由外周血提取RNA，并逆转录为cDNA的方法；（2）应用实时荧光定量PCR技术检测候选基因；（3）初步了解两组人群外周白细胞mRNA特异性表达的差异。[结论]应用β-actin作为管家基因建立较稳定的实时定量PCR方法能够应用于分子流行病学分析。候选基因在不同人群的表达差异表明可能做为早期预测胰岛素抵抗的一种基因。     

p53基因第8外显子实时荧光PCR方法的建立

[目的]建立实时荧光定黾PCR检测053基因第8外显子的检测方法。[方法]用酚-氯仿抽提法提取我院的常规体检病人的DNA，应用SYBR Green Ⅰ作荧光染料，通过检测PCR产物中荧光讯号的强度来定量p53基因，重复测定该标本20次，以此建立检测p53基因的实时荧光定量PCR方法。[结果]熔解曲线分析表明方法特异可靠。[结论]本研究建立了p53基因实时荧光定量PCR检测方法，该方法简便、特异、莺复性好、可信度高，为p53基因第八外显子的定蚤研究提供了理想的检测方法。     

人肠道乳酸杆菌的荧光定量PCR定量检测方法的研究

目的应用实时荧光定量PCR技术对健康人粪便内乳酸杆菌进行定量分析,建立乳酸杆菌的实时荧光定量PCR检测方法。方法依据乳酸杆菌16S rDNA序列设计属特异性引物,应用荧光定量PCR技术检测乳酸杆菌的16SrDNA,对粪便中的乳酸杆菌进行定量检测和分析,并和用传统方法所获得的结果进行比较。结果结果显示荧光定量PCR检测乳酸杆菌和传统方法检测乳酸杆菌之间无统计学差异（P〉0.05）。结论荧光定量PCR技术比传统方法特异性高、敏感性强,临床上可用此方法对患者肠道乳酸杆菌进行定量分析。     

DD3基因实时荧光定量RT—PCR检测前列腺癌特异性方法的建立

目的 建立DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法,为前列腺癌的快速诊断提供分子诊断依据.方法 根据Genebank中的 DD3 mRNA全序列,设计DD3基因的特异引物和探针,采用基因重组技术构建用于DD3基因检测的定量标准品;建立DD3基因的实时荧光定量方法.结果 成功构建了用于DD3基因荧光定量PCR检测的标准重组质粒和DD3基因实时荧光定量PCR方法;经稳定性、特异度、重复性和敏感度实验方法学评价,DD3基因实时荧光定量PCR方法的最低检测限为1.64 copy/ml,线性范围为1.64～1.64×1012copy/ml.结论 DD3基因实时荧光定量PCR检测前列腺癌特异性方法的建立,将为前列腺癌特异性诊断及其临床应用奠定方法学基础.     

实时荧光定量聚合酶链反应检测沙门菌（A～F群）方法的建立和应用

目的 建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测沙门菌,评价其优越性.方法 根据沙门菌保守的HilA基因序列合成引物和探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量PCR.结果 所建立的实时荧光定量PCR具有简便、快速、敏感性高、特异性强、抗干扰性好和可重复性强等特点,与实际应用检测结果相符.结论 建立的实时荧光定量PCR可用于口岸食品和公共场所从业人员的沙门菌检测.     

实时荧光定量聚合酶链反应检测沙门菌(A～F群)方法的建立和应用

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测沙门菌,评价其优越性。方法根据沙门菌保守的H ilA基因序列合成引物和探针,建立快速检测沙门菌的实时荧光定量PCR。结果所建立的实时荧光定量PCR具有简便、快速、敏感性高、特异性强、抗干扰性好和可重复性强等特点,与实际应用检测结果相符。结论建立的实时荧光定量PCR可用于口岸食品和公共场所从业人员的沙门菌检测。     

实时荧光定量PCR与PCR-ELISA在乙型肝炎病毒DNA定量检测中的应用比较

目的 评价应用国产试剂的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在检测乙型肝炎病毒(HBV)DNA中的临床应用。方法 基于TaqMan探针技术的实时荧光定量PCR应用Roche公司Light Cycler仪器和国产达安试剂,PCR-酶联免疫吸附试验(ELISA)应用Roche公司COBAS Amplicor全自动内标法系统,用2种方法检测乙型肝炎患者血清中的HBV DNA,评价其灵敏度、精密度及相关性。结果 实时荧光定量PCR方法的灵敏度略低于PCR-ELISA全自动内标法,两者变异系数(CV)均较低,用2种方法检测临床标本,相关系数为0．890。结论 应用国产试剂配合Light Cycler仪器的实时荧光定量PCR具有较高的灵敏度和较好的重复性,并与PCR-ELISA全自动内标法有良好的相关性。     

实时荧光定量PCR在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用评估

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中的应用。方法采用头孢西丁纸片扩散法和mecA基因PCR检测法,将85株临床分离的金黄色葡萄球菌区分为MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA),并采用实时荧光定量PCR对这些菌株进行检测,评价MRSA检测中实时荧光定量PCR与目前常规检测方法的一致性。结果根据头孢西丁纸片扩散法和mecA基因扩增结果进行分组,85株金黄色葡萄球菌中MRSA组菌株45株,MSSA组菌株40株;实时荧光定量PCR检测结果与上述结果完全一致,符合率为100%。结论实时荧光定量PCR检测MRSA的结果与常规方法一致性好,且具有操作简便、耗时短等特点。作为一种快速检测方法,实时荧光定量PCR能将金黄色葡萄球菌的鉴定和MRSA的筛选结合起来,对于指导临床用药及MRSA医院感染控制具有重要意义。     

实时荧光定量PCR技术的理论研究及其医学应用

背景:实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.目的:对实时荧光定量PCR的理论进行研究并探讨其在医学方面的应用和进展.方法:以real.time fluorescence quota PCR,theorem,application为检索词,检索PubMed数据库(2000-01/2008-12).以实时荧光定量PCR,原理,应用为检索词,检索万方数据库(2000-0112008-12),清华同方中文系列数据库(2000-01/2008-12).文献检索语种限制为英文和中文.以细胞因子和肿瘤耐药基因的表达为评价指标.纳入实时荧光定量PCR技术的方法学研究和实时荧光定量PCR技术的医学应用研究.排除重复性研究和Meta分析.结果与结论:实时荧光定量PCR技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点,成为分子生物学研究中的重要工具.实时荧光定量PCR的应用范围非常广泛,包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定等,已广泛应用于医学临床,它能对结核分枝杆菌、乙型、丙型肝炎、爱滋病病毒、淋球菌、沙眼衣原体等病原体进行准确的定量检测.其定量范围极宽,无需做梯度稀释,特异性更强,克服了假阳性.由于传统的PCR技术不能准确定量,使其在实际应用方面受到很大限制.因此,对PCR产物进行准确定量,尤其是病毒性病原的动态监控,成为迫切需要.     

PCR在诊断结核性胸膜炎中的应用

本文对聚合酶链反应在结核胸腔积液诊断方面的应用作一简介，分析了该技术应用时可能出现的假阳性和假阴性的原因，并对定量PCR，实时定量PCR等新技术作简要概述。     

荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌方法的建立

目的建立沙门氏菌实时荧光定量PCR的快速检测方法 ,探讨该方法的可行性和应用价值。方法根据沙门氏菌fimY基因序列设计引物和探针,采用基因重组技术构建用于沙门氏菌检测的定量标准品,建立实时荧光定量PCR检测沙门氏菌的方法。结果成功构建了沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏菌实时荧光定量PCR方法 ;通过特异性、敏感性、稳定性和重复性验证,结果表明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和重复性;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论沙门氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立,为食源性沙门氏菌污染的快速检测提供依据,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等。     

GeneXpert实时荧光定量PCR快速检测艰难梭菌的临床评估

目的对GeneXpert实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在快速检测临床粪便标本中艰难梭菌的应用进行评估。方法采用双拭子蘸取临床未成形粪便标本,一支拭子用于GeneXpert实时荧光定量PCR检测艰难梭菌毒素基因tcdB,另一支用于常规厌氧菌培养检测;对GeneXpert实时荧光定量PCR检测结果与常规厌氧菌培养结果的一致性进行统计学分析,并计算GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值等参数。结果临床收集到141例未成形粪便标本,GeneXpert实时荧光定量PCR检出艰难梭菌毒素基因tcdB阳性42例,其中常规厌氧菌培养阳性34例,两者一致性较好(Kappa=0.775 0,P0.01),GeneXpert实时荧光定量PCR的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为87.2%、92.2%、81.0%和94.9%。结论 GeneXpert实时荧光定量PCR直接检测粪便标本中的艰难梭菌具有检测快速、操作简便等优点,有重要的临床应用价值。     

血液中检测人巨细胞病毒的荧光定量PCR方法建立及评估

目的建立2种实时荧光定量PCR方法,用于在血液样本中检测有可能威胁血液安全的人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)。方法根据Gen Bank中HCMV的MIE基因保守序列的分析结果,分别建立基于SYBR Green和Taq Man探针的2种实时定量PCR检测方法,同时用这2种方法对来自血液制品厂的血浆进行检测。结果基于SYBR Green的实时定量PCR检测方法,得到的熔解曲线峰单一,建立的2种实时定量PCR方法对于HCMV的DNA具有高度特异性和灵敏度,检测下限均为50 copies/m L,并且具有较好的批间和批内重复性。结论应用本研究建立的实时荧光定量PCR方法对献浆人群血浆样品进行HCMV检测,2种方法检测结果一致,证明该方法可用于在血液样本中检测HCMV。     

荧光实时定量PCR在检测CML患者BCR-ABL融合基因中的应用

目的:探讨荧光实时定量PCR检测慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)患者BCR-ABL融合基因的可行性.方法:取10例CML患者(CML组)及3名正常体检者(对照组)的外周血,应用荧光实时定量PCR检测BCR-ABL融合基因,并与巢式PCR结果比较.结果:CML组10例巢式PCR均为( ),其中3例为( )、7例为( )/(-),对照组3名均为(--).CML组荧光实时定量PCR呈阳性6例.巢式PCR( )、( )/(-)和(--)的3组中用荧光实时定量PCR测定的BCR-ABL融合基因量依次减少.结论:荧光实时定量PCR可简便地检测BCR-ABL融合基因,结果可靠,且较巢式PCR更直观,具有较高临床应用价值.     

p53基因第8外显子实时荧光PCR方法的建立

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测p53基因第8外显子的方法。方法用酚-氯仿抽提法提取云南省中医院的常规体检患者的DNA,应用SYBR GreenⅠ作荧光染料,通过检测PCR产物中荧光讯号的强度来定量p53基因,重复测定该标本18次,以此建立检测p53基因的实时荧光定量PCR方法。结果融解曲线分析表明该方法特异可靠。结论该研究建立了p53基因实时荧光定量PCR检测方法,该方法简便、特异、重复性好、可信度高,为p53基因第8外显子的定量研究提供了理想的检测方法。