hIL-10修饰骨髓间充质干细胞对大鼠原位异种肝移植急性排斥反应的影响

目的 研究hIL-10基因修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠原位异种肝移植排斥反应的影响及机制.方法 采用豚鼠对Wistar大鼠的非协调性异种原位肝脏移植模型,实验动物随机分为3组:空白对照组,MSCs组,hIL-10-MSCs组.观察受体存活时间、受体鼠肝功能变化.术后第24小时取移植肝脏,用RT-PCR、ELISA法观察E-Selectin、LFA-1、VCAM-1及NF-κB的表达情况.结果 与空白对照组相比,hIL-10-MSCs组大鼠生存时间延长、肝功能好转,黏附分子E-Selec-tin、LFA-1、VCAM-1和NF-κB表达明显降低(P＜0.05).结论 hIL-10-MSCs对移植肝脏保护作用可能与其抑制NF-κB、E-Selectin、LFA-1、VCAM-1的表达有关.     

hIL-10基因修饰骨髓间充质干细胞对肝移植大鼠排斥反应的影响

目的研究hIL-10基因修饰的骨髓间充质干细胞（mesenehymal stem cell,MSC）对大鼠原位异种肝移植排斥反应的影响及机制。方法利用两套管吻合技术行豚鼠对Wistar大鼠的非协调性异种原位肝移植构建模型,按照构建模型过程中处理方式的不同（生理盐水＋地塞米松、MSC＋地塞米松、hIL-10-MSC＋地塞米松）分为空白对照组、MSC组、hIL-10-MSC组。观察受鼠存活时间、肝功能、术后24h移植肝组织IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18及TNF-α的含量及其mRNA表达。结果与空白对照组、MSC组相比,hIL-10-MSC组大鼠生存时间延长、肝功能好转,细胞因子IL-2、IL-12、IL-15、IL—18、TNF-α表达明显降低,IL-4、IL-10表达显著升高（P〈0．05）。结论hIL-10-MSC对移植肝保护作用可能与其抑制IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、TNF—α细胞因子的表达,促进细胞因子IL-4的表达有关。     

hIL-10基因修饰骨髓间充质干细胞对异种T淋巴细胞增殖的影响及机制研究

目的 研究hIL-10基因修饰的MSCs(骨髓间充质干细胞)对异种混合T淋巴细胞增殖的影响及机制.方法 RT-PCR克隆hIL-10基因并将构建慢病毒hIL-10/pLOX-cwGFPs,然后将慢病毒转导hIL-10入豚鼠MSCs;ELISA测定hIL-10-MSCs培养上清hIL-10含量;CCK-8法检测hIL-10基因修饰的骨髓间充质干细胞对体外混合淋巴细胞培养的影响;ELISA测定其培养上清对外周血单个核细胞分泌IFN-γ的影响.结果 成功构建慢病毒hIL-10/pLOX-cwGFP,hIL-10-MSCs培养上清的IL-10水平明显高于未转染(P<0.05);hIL-10-MSCs能抑制异种T淋巴细胞混合培养的增殖反应(P<0.05);加入IL-2能逆转MSCs的抑制作用(P<0.05);hIL-10-MSCs培养上清组能抑制PHA刺激的PBMC分泌IFN-γ(P<0.05).结论 hIL-10-MSCs对混合异种淋巴细胞培养有显著的抑制作用,能抑制PHA刺激的PBMC分泌IFN-γ.     

输注转染人白细胞介素10基因的骨髓间充质干细胞对移植肝的保护作用

目的研究输注转染人IL-10基因的骨髓间充质干细胞（hIL-10-MSC）对大鼠原位异种肝移植后移植肝的保护作用及机制。方法建立豚鼠对Wistar大鼠的非协调性异种原位肝移植模型,受体分为3组：空白对照组、骨髓间充质干细胞（MSC）对照组、hIL-10-MSC组。术后12h取移植肝,HE染色观察移植肝组织形态学变化,用RT-PCR、蛋白质印迹法观察移植肝组织IL-10、穿孔素、颗粒酶B的表达情况。结果与空白对照组、MSC对照组相比,hIL-10-MSC组大鼠移植肝排斥反应最轻,穿孔素、颗粒酶B的表达明显降低,而IL-10的表达显著升高（均P〈0.05）。结论 hIL-10-MSC对移植肝的保护作用可能与其减少穿孔素/颗粒酶B的表达有关。     

输注转染人IL-10基因的骨髓间充质干细胞减轻大鼠异种移植肝脏的细胞凋亡

目的 探讨转染人白细胞介素10(Hil-10)基因的骨髓间充质干细胞(MSC)对大鼠异种移植肝脏细胞凋亡的影响.方法 以携带Hil-10基因的慢病毒Hil-10/LOX-cwGFP转染豚鼠的MSC.以豚鼠为供者,Wistar大鼠为受者,利用两套管法行原位肝移植.空白对照组的受者分别于术前24 h和术后24 h经股静脉注射生理盐水2 ml+地塞米松0.5 ml(2 mg/ml)各1次;MSC组的受者分别于上述时间点自股静脉注射2.0×106/ml的MSC单细胞悬液2 ml+地塞米松0.5 ml(2mg/ml)各1次;Hil-10-MSC组的受者分别于上述时间点自股静脉注射2.0×106/ml的Hil-10-MSC单细胞悬液2 ml+地塞米松0.5 ml(2 mg/ml)各1次.术后12 h切取移植肝脏,观察移植肝组织学变化,测定肝组织中Hil-10、凋亡蛋白酶-3(Caspase-3)、Fas和FasL的表达,观察肝细胞的凋亡情况.结果 与空白对照组、MSC组相比,Hil-10-MSC组的病理改变最轻,IL-110表达明显增加,FasL明显减少.Hil-10-MSC组的Fas和Caspase-3的阳性区域面积分别为11.5%和25.1%,明显低于空白对照组的35.3%和70.8%(P＜0.05).Hil-10-MSC组的凋亡指数为32.5%,明显低于空白对照组的74.1%和MSC组的50.3%(P＜0.05).结论 Hil-10-MSC可明显减轻大鼠异种移植肝脏的细胞凋亡,其机制可能与其抑制Fas/FasL的表达有关.     

Th1/Th2细胞因子变化在大鼠肝移植免疫耐受中的作用

目的:研究大鼠肝移植术后移植肝和外周血中细胞因子的表达,并分析其在急性排异反应和耐受诱导中的作用。方法:Kamada法建立大鼠肝移植模型,并随机分为4组,每组8只。A组:同品系组;B组:免疫排异组;C组:B组+免疫抑制剂;D组:C组+骨髓输注。RT-PCR和ELISA技术分别检测移植肝和外周血中细胞因子IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10、TGF-β1的表达,并观察受体存活率。结果:在B组中Th1型细胞因子(IL-2、INF-γ)表达高于A、C和D组(P<0.05);而Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)和TGF-β1表达低于C和D组(P<0.05);细胞因子在C组与D组大鼠中的表达无统计学差异。A、C、D组大鼠术后近、远期存活率明显优于B组。结论:Th1型细胞因子(IL-2、INF-γ)参与肝移植急性排异反应的发生,Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)和TGF-β1可能参与移植物免疫耐受的诱导,延长移植物存活。     

大鼠肝移植排斥反应时γ干扰素及白细胞介素10的表达及意义

目的 探讨大鼠肝移植排斥反应时γ干扰素(IFN-γ)及白细胞介素10(IL-10)的表达及意义.方法 采用改良的Kamada"二袖套法"制备大鼠原位肝移植模型,同系移植组供、受者均为SD大鼠;同种异体移植组的供者为Wistar大鼠,受者为SD大鼠;另设假手术组.术后7 d处死动物,观察移植肝脏的组织学变化,检测血清IFN-γ和IL-10的含量,以及移植肝脏内IFN-γ和IL-10 mRNA的表达.结果 同种异体移植组移植肝脏有较多坏死肝细胞,汇管区及中央静脉周围可见以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润,胆管上皮细胞可见胞浆空泡变性、核固缩或碎裂,整个肝小叶结构紊乱.同系移植组肝脏组织结构仅有轻度缺血再灌注损伤表现,汇管区有较少炎症细胞浸润,胆管上皮细胞结构和肝小叶结构基本正常.同种异体移植组血清IFN-γ为(386.7±14.4)Pg/ml,明显高于同系移植组的(159.8±16.5)pg/ml(P<0.05);同种异体移植组血清IL-10为(126.3±13.1)pg/ml,明显低于同系移植组的(288.3±17.1)pg/ml(P<0.05).同种异体移植组移植肝组织内IF-γ mRNA表达水平明显高于同系移植组(P<0.05),而IL-10 rnRNA表达水平明显低于同系移植组(P<0.05).结论 大鼠肝移植排斥反应时IFN-γ表达明显升高,IL-10表达明显降低;T_H1/T_H2型细胞因子的动态平衡可能在大鼠肝移植排斥反应中起着重要作用.     

供体骨髓间充质干细胞抑制肝移植大鼠免疫排斥的研究

目的 探讨供体骨髓间充质干细胞(MSCs)抑制肝移植大鼠免疫排斥的作用.方法 实验按照随机数字表法分为3组,每组14对雌性大鼠,建立Wistar-SD大鼠原位肝移植模型.A组:肝移植术中输注生理盐水;B组:肝移植术后隔天一次给予他克莫司(0.25 mg/kg)灌胃2周;C组:肝移植术中输注与A组同剂量的雄性Wistar大鼠的MSCs.观察术后第10天肝功能的变化、病理改变、TGF-β1与IL-10的表达、Y染色体定位及受体存活时间.采用完全随机化设计多组比较方差分析AST、ALT值,LSD法分析组间差异;病理分级采用ridit法分析;Kaplan-Meier法计算存活率,Log-rank检验进行生存分析.结果 肝移植术后第10天A、B、C组ALT分别为(756±104)、(197±49)、(103±31)U/L,AST分别为(635±134)、(331±78)、(150±38)U/L,3组ALT和AST比较差异均有统计学意义(F=158,265,P<0.05);两两比较发现,B组及C组均优于A组,且C组优于B组.A组ridit均值为0.8333,为重度排斥,B、C两组ridit均值分别为0.4583、0.2083,排斥反应较A组显著减轻,且C组较B组级别更低.A、B、C组TGF-β1阳性表达率分别为18%±5%、69%±20%及85%±24%,3组比较差异有统计学意义(F=191,P<0.01).A、B、C组IL-10阳性表达率分别为21%±5%、75%±14%及91%±21%,3组比较差异有统计学意义(F=672,P<0.01);B、C两组TGF-β1和IL-10呈强阳性表达且C组比B组更明显,而A组则为弱阳性表达.原位杂交检测发现,C组含有带Y染色体的雄性MSCs,主要在汇管区聚集.A、B、C组大鼠50 d存活率分别为0、10%、90%,3组大鼠存活率比较差异有统计学意义(χ~2=36,P<0.01),C组中位存活时间为63 d,较A组11 d延长,且C组长于B组.结论 肝移植同时向供体输注MSCs能够抑制受体对移植肝的免疫排斥.     

外源性白细胞介素-10对梗阻性黄疸大鼠肝再生的作用

目的 探讨外源性白细胞介素-10(IL-10)对梗阻性黄疸大鼠肝再生的作用.方法 雄性Wistar大鼠随机分为假手术(SO)组、梗阻性黄疸(CJ)组和IL-10组.OJ组和IL-10组结扎切断胆总管建立梗阻性黄疽模型,SO组仅游离胆总管.IL-10组术后第1天开始每天腹腔内注射IL-10(4 μg/kg).实时荧光定量PCR法检测肝组织转化生长因子β1(TGF-β1) mRNA表达,免疫组织化学法检测肝组织增殖细胞核抗原(PCNA)标记指数,并检测血清总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)含量.结果 胆总管结扎术后3d,与SO组相比,OJ组大鼠肝组织TGF-β1 mRNA表达、PCNA标记指数及血清转氨酶均明显升高(P＜0.05).胆总管结扎术后7d,与SO组相比,OJ组大鼠上述各项实验指标均进一步升高(P＜0.05).应用IL-10治疗后,与OJ组相比,IL-10组大鼠肝组织TGF-β1 mRNA表达及血清转氨酶均明显降低,而肝组织PCNA标记指数明显升高(P＜0.05).结论 外源性IL-10可通过抑制肝组织TGF-β1的表达而促进梗阻性黄疽大鼠肝再生并改善受损肝功能.     

Celsior液中HGF对大鼠肝移植后INF-γ、IL-4与IL-10水平的影响

目的 探讨Celsior(CS)液中添加重组人肝细胞生长因子(recombinant human hepato-cyte growth factor,rhHGF)对大鼠肝移植后INF-γ、IL-4与IL-10水平的影响.方法 利用无心跳供肝(non-heart beating donor,NHBD)大鼠肝移植模型,ELISA法检测实验组(CS添加rhHGF)和对照组(CS添加生理盐水)门静脉再通1h血清INF-γ、IL-4与IL-10水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定肝组织INF-γ、IL-4与IL-10 mRNA水平,并观察肝组织病理及大鼠牛存率.结果 与对照组相比,试验组NHBD供肝移植后在门静脉再通1 h后血清INF-γ水平及肝组织INF-γ mRNA水平明显低于对照组(P<0.05),血清IL-4与IL-10水平及相应肝组织IL-4与IL-10 mRNA水平明显高于对照组(P<0.05),实验组大鼠生存率明显高于对照组(P＜0.05),病理组织学提示实验组肝细胞水肿变性减轻,无明显肝细胞坏死、肝窦淤血及门静脉充血.结论 CS灌注保存液中添加外源性rhHGF可改善其对NHBD供肝的保存效果,提高术后生存率,这可能与其下调INF-γ,上调IL-4与IL-10的产生有关.     

慢性移植物肾病患者外周血淋巴细胞细胞因子表达的研究

目的探讨慢性移植物肾病（chronic allograft nephropathy,CAN）患者外周的血淋巴细胞细胞因子的表达情况。方法选取2004年7月至2005年8月在中国人民解放军第309医院器官移植研究所就诊的15例CAN和22例移植’肾功能正常的肾移植受者,分别列为CAN组和非CAN组。所有患者均签署知情同意书,符合医学伦理学规定。两组患者分别抽取空腹外周血4ml,分离外周血淋巴细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应比较两组患者外周血淋巴细胞细胞因子白介素（IL）-2、IL-10、干扰素（IFN）-1及转化生长因子（TGF）-β1的信使核糖核酸（messengerRNA,mRNA）表达的差异。结果与非CAN组比较,CAN组的IL-2和IL-10mRNA表达差异无统计学意义（均为P〉0．05）,IFN-γ、TGF-β1mRNA表达明显较高,差异有统计学意义（分别为P〈0．05、P〈0．01）。结论IFN-γ、TGF—β1mRNA的高表达可能与CAN的发生、进展有关。     

体内注射白细胞介素10和转化生长因子质粒延长小鼠移植皮肤存活时间

目的 探讨体内注射白细胞介素10(IL-10)和转化生长因子β1(TGF-β1)质粒对小鼠移植皮肤存活时间的影响.方法 构建含IL-10和TGF-β1基因的质粒,以Balb/c小鼠为受者、Balb/c小鼠与C57BL/6小鼠杂交的F1代小鼠为供者,行皮片移植.移植当天,经尾静脉分别给受者快速注射不含基因的空白质粒(空白组)、含IL-10基因质粒(IL-10组)、含TGF-β1基因质粒(TGF-β1组)以及含IL-10和TGF-β1双基因的质粒(联合组),以后每2天注射1次,20 μg/次,共注射6次,观察移植皮肤存活时间.另取Balb/c小鼠,在输注C57BL/6小鼠脾细胞后,按前述分组及方法接受质粒快速注射,注射5次后,分离其脾细胞,以流式细胞仪检测脾细胞中CD4+ CD25+ T淋巴细胞含量.结果 移植皮片存活时间,空白组为(13.50±1.04)d,IL-10组为(13.83±1.16)d,TGF-β1组为(15.33±1.50)d,联合组为(21.33±3.20)d,联合组移植皮片存活时间明显长于其他3组(P<0.01).脾细胞中CD4+ CD25+ T淋巴细胞的含量,空白组为(6.58±1.86)%,IL-10组为(10.52±1.13)%,TGF-β1组为(14.44±0.42)%,联合组为(14.25±1.24)%,TGF-β1组和联合组的CD4+ CD25+ T淋巴细胞含量明显高于空白组和IL-10组(P<0.01).结论 体内注射IL-10和TGF-β1质粒可延长小鼠移植皮肤存活时间,并能提高CD4+ CD25+ T淋巴细胞含量.     

第三方骨髓间充质干细胞诱导同种异体移植受体免疫耐受机制的研究

目的 初步研究第三方骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导同种异体移植受体免疫耐受的作用机制.方法 40只雌性C57BL/6小鼠作为供体,40只雄性BALB/C小鼠作为受体,建立稳定的同种异体皮肤移植模型,BMSCs取自SD大鼠骨髓.将40只BALB/C小鼠随机分为4组,每组10只.①空白对照组:只进行皮肤移植,未给予其他治疗;②环磷酰胺组(CP组):大剂量环磷酰胺(cyclophosphamide,CP)腹腔注射,200 mg/kg,连用2 d(q.d.);③单纯给予SD-BMSCs移植组(SD-BMSCs组):移植当天自受体小鼠尾静脉输注2×106个SD-BMSCs;④细胞药物联合应用组(CP+SD-BMSCs组):大剂量CP腹腔注射,200 mg/kg,连用2 d(q.d.),并于移植当天自受体小鼠尾静脉输注2×106个SD-BMSCs.检测指标包括:移植皮片存活情况;SD大鼠BMSCs表面抗原CD29、CD34、CD45和CD90鉴定;流式细胞仪检测受体脾脏调节性T细胞(CD4+、CD25+、Foxp3+、Treg细胞)的比例;ELISA检测受体外周血TGF-β、IL-10、IFN-γ的含量;异基因T淋巴细胞与经60Co照射的不同来源BMSCs共培养后,MTT法测定异基因T淋巴细胞增殖的情况.结果 CP+SD-BMSCs组皮肤移植物存活时间为(15.7 ±1.4)d,空白对照组为(6.1±1.1)d,CP组为(12.3±1.5)d,SD-BMSCs组为(12.6±1.8)d,CP+SD-BMSCs组皮肤移植物存活时间明显比后3组延长(P＜0.05).全骨髓贴壁培养的BMSCs表面抗原鉴定:CD29+、CD44+分别为99.7%和96.7%,CD34-、CD45-分别为1.6%和1.3%.流式细胞仪检测Treg含量SD-BMSCs组和CP+SD-BMSCs组明显高于空白对照组和CP组(P＜0.05);ELISA检测受体外局血SD-BMSCs组和CP组TGF-β和IL-10明显高于空白对照组,SD-BMSCs和CP组IFN-γ则明显低于空白对照组(P＜0.05);共培养结果显示:来源于C57小鼠和SD大鼠的BMSCs可以明显抑制T淋巴细胞的增殖反应(P＜0.05),而上述两组组间比较差异则无统计学意义(P＞0.05).结论 第三方BMSCs诱导同种异体移植免疫耐受作用可能与诱导受体Treg细胞增殖和促进免疫耐受因子的表达,抑制免疫排斥因子的表达有关.

Abstract：

Objective To study the immuno-tolerance mechanism of the third-party bone marrowderived mesenchymal stem cells ( BMSCs) in the allogeneic transplantation. Methods Forty female C57BL/ 6 mice and forty male BALB/C mice were respectively used as donors and recipients in skin allogenic graft model. Forty male BALB/C mice were divided randomly into 4 groups: blank control group, CP group, BMSCs group , CP + BMSCs group , with 10 mice in each group. Before skin graft, high-dose abdominal injection of cyclophosphamide ( 200 mg/kg,2 d,q. d. ) was performed in recipient mice in CP and CP + BMSCs groups. On the transplantation day, a bonus of 2 x 106 BMSCs from the SD rat (SD-BMSCs) were injected through the tail vein in the BMSCs and CP + BMSCs groups. The observation and HE staining of skin grafts were used. The expressions of CD29, CD34, CD45 and CD90 of cells were analyzed by using flow cytometry in order to identify BMSCs. The CD4+ , CD25+ , Foxp3+ and Treg cells of spleen were detected by flow cytometry. Cytokine in peripheral blood of recipient mice were measured by ELISA,including TGF-β, IL-10 and IFN-γ. T cells were co-cultured with 60 Co-irradiated bone marrow MSCs from different individuals. The proliferative activity of T cells were evaluated with MTT assay. Results The skin graft survival time was significantly prolonged in the CP + BMSCs group, as compared with that in the blank control group, the CP group, the BMSCs group, respectively. Cells cultured by whole bone marrow adherent cultivation showed CD29+ (99.7% ) ,CD44+ (96.7% ) ,CD34 (1.6% ) ,CD45( 1. 3% ). Compared with the control group and CP group, the ratio of the CD4+ ,CD25+ ,Foxp3+ and Treg cells significantly increased in the SD-BMSCs group and CP + BMSCs group (P ＜ 0. 05). Analysis of peripheral blood by ELISA showed significant high level of TGF-β, IL-10 and low level of IFN-γ in BMSCs group and CP group, compared with that in control group. When co-cultured with BMSCs from different individuals, T- lymphocytes proliferation decreased apparently in SD-BMSCs group and C57-BMSCs group (P ＜ 0. 05) , but there was no significant difference between SD-BMSCs group and C57-BMSCs group ( P ＞ 0. 05 ). Conclusions The immunotolerance mechanism of the third-party bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the allogeneic transplantation might be associated with its effect on the proliferation of Treg cells and increasing expression of TGF-β and IL-10, decreasing expression of IFN-γ.