部分去蛋白脱钙骨的细胞相容性研究

目的：探讨部分去蛋白脱钙骨的细胞相容性。方法：将猪肋骨用理化方法处理制得部分去蛋白脱钙骨(PDDB)，在对PDDB理化性能检测的基础上，将其与人胎骨膜成骨细胞体外复合培养，了解其细胞相容性。结果：PDDB的无机成份为羟基磷灰石。含有少量蛋白质，仍具有原骨组织骨盐支架的二三维多孔网状孔隙结构系统，对复合培养的人胎骨膜成骨细胞的形态特征、细胞周期、倍体水平尤有害影响。结论：PDDB具有原骨组织的网状孔隙结构系统，具有良好的细胞相容性，可望用于成骨细胞的支架材料。     

异种脱钙骨基质复合成骨细胞异位成骨的实验研究

目的:了解异种冻干脱钙骨基质(xenogeneic demineralized freeze-dried bone matrix XDBM)与骨膜成骨细胞复合移植的新骨形成能力.方法:将XDBM与成骨细胞复合后的组织工程骨和单纯XDBM分别植入24只新西兰兔双侧后腿肌袋内,术后2、4、6、8周取植人材料作组织学和骨矿物含量测定.结果:XDBM与成骨细胞复合体植入后2周有软骨和新生骨形成,4周时发育成编织骨并形成髓腔,术后6、8周,新生骨进一步成熟、骨量增多;移植物钙含量随时间推移逐渐增高.整个观察过程,单纯植入XDBM组肌袋内无新生骨或软骨形成,移植物被纤维组织包裹、浸润,钙含量持续处于较低水平.结论:XDBM单独移植无异位成骨能力;XDBM与成骨细胞复合后具有很好的异位成骨能力,XDBM是组织工程骨研究较理想的支架材料.     

同种异体脂肪干细胞复合脱钙骨材料修复兔尺骨缺损

目的：探讨同种异体脂肪干细胞（adipose—derivedstemcells,ADSCs）组织工程骨修复兔管状骨缺损的可行性。方法：获取新西兰大白兔的肩胛部脂肪,分离培养具有多向分化潜能的ADSCs;第三代兔ADSCs与脱钙骨复合后,体外成骨诱导培养（LG—DMEM）设为对照。制造兔两侧尺骨临界大小（长度15mm）的缺损,分别植入兔ADSCs一脱钙骨复合物（实验侧）和单纯脱钙骨材料（对照侧）;12周后取样本,三维CT和组织学检测观察成骨情况。结果：细胞一材料复合物植入12周后,三维CT显示实验侧有新生骨基质长成,对照侧未见骨组织生成;组织学检测显示实验侧缺损区被典型的骨组织取代,可见新生骨小梁附着于脱钙骨表面,而对照侧只有少量的骨组织和纤维组织充填。结论：兔ADSCs能在脱钙骨上很好的黏附和生长,兔ADSCs-脱钙骨材料复合物植人体内能成功修复临界大小的管状骨缺损。     

脱钙骨颗粒骨水泥骨形成蛋白复合材料配方优化研究

目的 探讨脱钙骨基质颗粒（DBM）、骨水泥（BC）、牛骨形成蛋白（bBMP)的最佳比例和最方便的复合方法。方法 提取bBMP,制备狗DBM,二者按1：25的质量比用直接掺合法和吸附法复合后,再用BC按不同的质量比复合,将复合后的材料行体外生物力学测定和扫描电镜观察,体内成骨诱导活性测定和植入实验。结果 bBMP与DBM直接掺合和吸附法复合后,所得材料的成骨诱导活性无差别。复合材料中DBM的质量比≤40%时,材料内部的大部分间隙＜100μm,空隙率＜20％,不利于新生血管长入和新骨形成。DBM的质量比≥80％时,DBM和BC不能复合在一起,从而失去塑形性,DBM的质量比在50％－75％的范围内,随DBM质量比的增加生物力学强度逐渐降低而成骨诱导和血运重建的质量越好。结论 bBMP与DBM复合以直接掺合法最方便而不影响复合材料的成骨诱导活性。DBM的质量比为50％－60％时,复合材料既具有相当的生物力学强度,又利于诱导新骨形成和血运重建,适宜于修复承重部位的骨缺损,比例为75％时可用于修复非承重部位的骨缺损。     

超低温冻存同种异体成骨细胞与异种脱钙骨复合异位组织工程化骨

目的：研究同种异体成骨细胞经超低温冻存后在体内的成骨能力及其免疫反应。方法：体外分离培养SD大鼠颅骨成骨细胞，提纯并传代至第3代时一部分作为对照组用；另一部分采用-196℃超低温冻存，24h后复苏。将该两种第3代细胞分别与脱细胞并去抗原性的猪脱钙型松质骨(decalcmed bone，DB)复合，将两种复合体和单纯DB分别植入SD大鼠背部肌袋内，各24只，4周后取标本，应用组织学、碱性磷酸酶测定、体视学及免疫学测定，观察成骨现象及免疫反应。结果：经超低温冻存的同种异体成骨细胞异体异位植入后，成骨量、成熟度明显优于未冻存成骨细胞；引起的免疫反应亦低于未冻存细胞。结论：同种异体成骨细胞经超低温冻存、复苏后，抗原性明显降低，未引起强烈的免疫排斥反应，仍具有成骨能力。     

应用hMSCs-脱钙骨复合物体内构建软骨组织的实验研究

目的 观察成软骨诱导后人骨髓间充质干细胞和脱钙骨复合物在裸鼠皮下组织形成情况。方法 从志愿者髂前上嵴处抽取骨髓,得到骨髓间充质干细胞,将第1代的骨髓间充质干细胞密度调整到1.5×107/mL,均匀接种于脱钙骨,培养4 h后以含有TGF-β3(10 ng/mL)DMEM培养液的培养作为实验组,加10％FBS的DMEM为对照组Ⅰ,空白材料为对照组Ⅱ,体外培养6 d,嘲植到裸鼠皮下。回植前及回植后2、4、6、8、10周取材,石蜡切片进行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的免疫组化、Masson’s、Alician Blue’s染色鉴定。结果 回植前及回植后各时间段,实验组免疫组化测到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的表达,对照组未见Ⅱ型胶原表达;实验组Masson、Alician染色可见材料内的胶原分泌非常旺盛,有硫酸化酸性粘多糖沉积,对照组则表达量极少。结论 诱导后人骨髓间充质干细胞一脱钙骨复合物在裸鼠皮下能表达特异性软骨基质。     

利用脱细胞骨软骨纤维支架形成可修复软骨缺损的软骨-骨复合组织

【立论依据】 目前,因自体软骨组织修复力极其有限,故对软骨缺损的治疗是临床上的一大难题。现在的治疗方式多为手术移植治疗,包括自体骨移植,单一软骨组织移植以及高分子材料支架移植,但存在损伤大,细胞存活率低和机体相容性差等不足。对此,体外构建一种克服传统治疗缺点的新的组织工程材料显得极其重要。 【设计思路】 因自体骨移植损伤大,故设计体外构建组织材料;因单一软骨组织移植机体相容性差,故设计构建软骨骨复合组织;因软骨细胞存活率低,故设计构造脱细胞骨软骨纤维支架种植细胞,提供骨、软骨细胞最佳生长微环境。所以,实验设计体外利用异体脱细胞骨软骨纤维支架构建软骨-骨复合组织,再移植到动物体内生长,从而提供一种治疗软骨缺损性疾病的新的组织工程材料。 【实验内容】 (1)分离、纯化与培养兔骨髓中的间充质干细胞。(2)体外脱细胞处理家兔髌骨股骨侧的骨软骨块构建骨软骨纤维支架,对支架进行力学测试、镜下观察、异体免疫性观测等。(3)将间充质干细胞移植到脱细胞支架上,利用支架双层存留细胞外基质的诱导作用在骨和软骨层分别诱导干细胞分化形成成骨细胞和软骨细胞。(4)将得到的复合组织移植到裸鼠背部皮下,跟踪观测组织直径大小变化、生长状况、组织构成等。(5)构建兔膝关节股骨关节面软骨缺损模型,进行移植手术,持续观测实验对象膝关节活动度及应力性、影像学表现,最后做缺损修补处切片镜下观察对比,分析评估实验构建组织工程材料是否优于传统移植材料。 【材料】 实验动物家兔、裸鼠;30 g/L戊巴比妥钠、胎牛血清、0.35 mmol/L苯甲基磺酰氟、1% TritonX-100等。 【可行性】 实验动物和相关试验方法为常规操作,且已有相关实验基础。 【创新性】 实验设计的骨软骨复合组织克服了传统移植所用单一软骨组织机体相容性低和细胞存活率低的缺点,可以实现从试验台到临床的转化医学概念,为软骨缺损性疾病的移植治疗提供思路,有重要的临床意义。     

应用hMSCs-脱钙骨复合物体内构建软骨组织的实验研究

目的观察成软骨诱导后人骨髓间充质干细胞和脱钙骨复合物在裸鼠皮下组织形成情况.方法从志愿者髂前上嵴处抽取骨髓,得到骨髓间充质干细胞,将第l代的骨髓间充质干细胞密度调整到1.5×107/mL,均匀接种于脱钙骨,培养4 h后以含有TGF-β3(10 ng/mL)DMEM培养液的培养作为实验组,加10%FBS的DMEM为对照组Ⅰ,空白材料为对照组Ⅱ,体外培养6 d,回植到裸鼠皮下.回植前及回植后2、4、6、8、10周取材,石蜡切片进行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的免疫组化、Masson's、Alician Blue's 染色鉴定.结果回植前及回植后各时间段,实验组免疫组化测到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的表达,对照组未见Ⅱ型胶原表达;实验组Masson、Alician染色可见材料内的胶原分泌非常旺盛,有硫酸化酸性粘多糖沉积,对照组则表达量极少.结论诱导后人骨髓间充质干细胞-脱钙骨复合物在裸鼠皮下能表达特异性软骨基质.     

脱钙骨免疫组化染色方法的构建

在对骨骼生理和病理的研究过程中，经常需要制备脱钙的骨免疫组化标本，然而由于骨骼组织的特殊性，制备好的骨组化标本也并不是一件容易的事。由于骨组织中60％以上为钙盐组成的羟基磷灰石结晶，脱钙是标本制备中至关重要的过程。一些强酸如盐酸，硝酸等虽能快速有效除去骨组织中钙盐，但对其中的抗原蛋白也产生了致命性破坏，使接下来的工作无法进行；我们仿照目前国外方法：EDTA低温脱钙^[1]，得到的结果比较满意，现总结如下。     

生物衍生骨与成骨细胞联合培养体内异位成骨实验研究

目的：探讨生物衍生骨作为组织工程骨支架复合成骨细胞体内植入的成骨作用，了解其用于骨组织工程支架材料的可行性。方法：将经过物理化学方法处理制得的冻干猪脱蛋白型松质骨与胎兔颅骨来源的成骨细胞体外培养10d后，在无菌条件下植入30只成年新西兰兔背部肌肉内（左侧），对照组为同体单纯植入猪脱蛋白型松质骨（右侧）。于8周后取材，行大体观察、X线摄片、脱钙后组织学染色（HE法）及荧光标记检测，观察新骨形成情况。结果：8周后，实验组：X线片有高密度的阴影；大体标本呈红色，质硬；脱钙组织切片示大量的类骨质骨形成并相互连接成骨小梁结构，骨细胞位于陷窝中；荧光标记后在荧光显微镜下，骨小梁呈现淡绿色，类骨质呈黄色。对照组：X线片仅见植入处低密度阻射阴影；组织学检查及荧光标记检测均无类骨形成，在支架的孔洞内有大量的纤维组织长入。结论：猪脱蛋白型松质骨可作为骨组织工程的支架材料，具有良好的应用前景。     

异体脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白修复兔桡骨缺损

目的 探讨骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein,BSP)在修复新西兰大白兔桡骨缺损中对骨形成和骨改建的作用,本实验拟评价骨唾液酸蛋白在兔体内的成骨活性,并为临床治疗骨缺损提供理论基础.方法 采选用合适龄新西兰大白兔36只,前肢中段外侧骨段(连同骨膜)15mm,建立兔桡骨缺损模型,随机分为脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组(A组),脱蛋白松质骨组(B组),自体骨移植组(C组),分别于骨缺损处植入蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白,脱蛋白松质骨,自体骨移植,并在术后第4、8、10、12周,ABC三组各组随机选择3只动物,处死后游离桡骨标本备检.分别观察各组动物桡骨愈合x线片正侧住片情况,肉眼观察标本愈合情况,组织学观察.结果 ①脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组肉眼观察,X线检查,HE染色均显示骨愈合均快于脱蛋白松质骨组,②脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组肉眼观察,X线检查,HE染色均显示骨愈合均稍慢于自体骨移植组.结论 脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组与脱蛋白松质骨组相比,成骨活性增加,具有一定程度成骨活性,但较自体骨仍有差异.     

骨关节炎软骨下骨的成骨细胞生物学表型研究

目的 培养骨关节炎患者软骨下骨成骨细胞,探讨硬化区和非硬化区软骨下骨成骨细胞的生物学特性.方法 收集本科2009年10月至2010年3月拟行全膝关节置换入院的骨关节炎患者7例,男性5例,女性2例,平均年龄68(55-79)岁,留取术后遗弃的胫骨平台骨组织.应用Ⅰ型胶原酶消化联合贴壁培养方法,培养软骨下骨的成骨细胞,光镜下观察细胞形态,免疫组化检测Ⅰ型胶原,NBT/BCIP染色法检测碱性磷酸酶,茜素红染色检测矿化结节,油红O染色检测脂质成分.应用实时定量RT-PCR技术检测并比较硬化区和非硬化区软骨下骨成骨细胞相关基因[碱性磷酸酶(ALP),骨钙蛋白(OCN),转化生长因子β1(TGF-β1),胰岛素样生长因子1(IGF-1),Ⅰ型胶原(COL1)A1/(COL1)A2,基质金属蛋白酶13(MMP-13),骨桥蛋白(OPN),肿瘤坏死因子(TNF-α),白介素(IL)-6和IL-8]的表达.应用茜素红染色比较两种细胞矿化能力.结果 光镜下观察到细胞渐从骨片中爬出的生长过程,免疫组化证实细胞表达Ⅰ型胶原,NBT/BCIP染色显示细胞表达碱性磷酸酶,茜素红染色显示细胞能形成矿化结节,油红O染色显示细胞内无脂质成分,证实Ⅰ型胶原酶消化联合贴壁培养方法能较好的培养出成骨细胞.茜素红染色显示软骨下骨硬化区成骨细胞矿化能力低于非硬化区[(0.92±0.06),(1.32±0.15),P＜0.01].RT-PCR显示,硬化区软骨下骨成骨细胞比非硬化区软骨下骨成骨细胞高表达基因OPN[(2.62±1.47)×10-2,(9.63±3.37)×10-4,P＜0.05]、OCN[(6.04 ±6.27)×10-6,(4.84±2.18)×10-6,P＜0.05]、ALP[(73.62±15.75)×10-4,(3.10±0.33)×10-4,P＜0.01]、IGF-1[(14.84±1.23)×10-4,(6.33±2.80)×10-4,P＜0.01]、IL-6[(8.24±1.05)×10-4,(2.64±0.37)×10-4,P＜0.01]、IL-8[(14.68 ±6.97)×10-6,(2.60±0.89)×10-6,P＜0.01]、MMP-13[(1.50±0.11)×10-3,(1.23±0.10)×10-3,P＜0.05]、TGF-β1[(4.41±0.42)×10-3,(2.96 ±0.36)×10-3,P＜0.01]、COL1A1[(55.44±21.61)×10-2,(9.17 ± 3.30)×10-2,P＜0.01];而TNF-α[(5.62±2.03)×10-6,(5.62±3.146)×10-6]和COL1A2[0.64±0.07,0.46±0.12]表达水平没有明显差异(P＞0.05).结论 硬化区软骨下骨成骨细胞的生物学表型变化是骨关节炎患者病变的重要特征之一.     

骨形成蛋白在小白鼠体内诱导成骨的测定方法

目的 探讨一种测定骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMP)成骨诱导活性的新方法。方法 将自行提取的牛BMP(bBMP)埋入小白鼠后腿肌袋内,分别于术后3、5、7、14、21、28d行B超、X射线照相和组织形态学观察。结果 B超3、5、7d与对照组织同,均为正常组织回声,14、21、28d有软骨和骨组织回声。X射线照相3、5、7、14d无骨组织影象,21、28d有明显的新生骨征象。组织形态学观察3、5、7d有大量间充质细胞在BMP植入部位聚集,14d有新生软骨和新生骨组织组成,21、28d可见大量的新生的成熟骨组织。结论 B超、X射线照相和组织形态学观察结果在时间上有很强的一致性,证明B超作为一种新的BMP成骨诱导活性的检测手段是切实可行的。     

异体脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白修复兔桡骨缺损

目的探讨骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein,BSP）在修复新西兰大白兔桡骨缺损中对骨形成和骨改建的作用,本实验拟评价骨唾液酸蛋白在兔体内的成骨活性,并为临床治疗骨缺损提供理论基础。方法采选用合适龄新西兰大白兔36只,前肢中段外侧骨段（连同骨膜）15mm,建立兔桡骨缺损模型,随机分为脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组（A组）,脱蛋白松质骨组（B组）,自体骨移植组（C组）,分别于骨缺损处植入蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白,脱蛋白松质骨,自体骨移植,并在术后第4、8、10、12周,ABC三组各组随机选择3只动物,处死后游离桡骨标本备检。分别观察各组动物桡骨愈合X线片正侧位片情况,肉眼观察标本愈合情况,组织学观察。结果①脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组肉眼观察,X线检查,HE染色均显示骨愈合均快于脱蛋白松质骨组,②脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组肉眼观察,X线检查,HE染色均显示骨愈合均稍慢于自体骨移植组。结论脱蛋白松质骨复合骨唾液酸蛋白组与脱蛋白松质骨组相比,成骨活性增加,具有一定程度成骨活性,但较自体骨仍有差异。     

骨和软骨肉瘤中骨形成蛋白的免疫组织化学定位

用抗牛骨形成蛋白单克隆抗体(bBMP-McAb)研究了骨形成蛋白(BMP)在骨肉瘤及软骨肉瘤中的细胞定位。ABC法染色阳性12/14(骨肉瘤);4/4(软骨肉瘤)结果显示,BMP主要分布于骨和软骨肉瘤的肿瘤细胞胞浆及部分肿瘤性骨组织中,从而证实骨、软骨肉瘤都含有丰富的BMP。用bBMP-McAb染色不仅可以将骨肉瘤与纤维肉瘤等非骨源性肿瘤加以鉴别,而且可以根据BMP在肿瘤中的分布和含量,结合患者的临床情况可望对骨肉瘤进一步分类,为临床治疗提供依据。此外,对于软骨肉瘤内含有丰富的BMP的首次发现,揭示BMP可能与其它的骨疾患有密切的关系。     

BIO-OSS骨与脱钙冻干骨引导牙周骨组织再生的临床研究

目的 探讨不同骨引导材料(Bio-oss骨、脱钙冻干骨)在牙周组织及骨组织引导再生术中应用的临床效果。方法 对27例31颗进行牙周引导再生术的患者分别应用不同材料(16例Bio-oss骨、11例脱钙冻干骨)观察临床效果。结果 不同骨引导材料对牙周骨组织引导再生均有明显作用。结论 应用不同骨引导材料在牙周组织引导再生技术中均有效果，两者治疗效果比较无明显差别。     

复合bBMP骨软骨生物修复材料的实验研究

目的:探索复合牛骨形态发生蛋白(bBMP)骨软骨生物修复材料的细胞相容性及其对于兔关节骨软骨缺损的修复效果.方法:将bBMP经处理制成复合bBMP骨软骨生物修复材料(A材料),并将.体外培养扩增兔骨髓基质干细胞(MSC)传至第三代后接种于A材料中,体外培养2周后扫描电镜(SEM)观察材料的细胞相容性.将A材料植入兔关节骨软骨缺损,12w后取材观察其修复效果.结果:A材料孔隙结构规则,孔径约100～200 μm,孔隙内部均匀附着bBMP,与兔MSC共培养显示了良好的细胞相容性.在兔关节骨软骨缺损修复中,A材料12周实现了对关节骨软骨较好的修复效果.结论:复合bBMP骨软骨生物修复材料在保持理想孔隙结构和细胞相容性的同时,其骨软骨缺损修复能力明显提高.     

脱细胞骨软骨支架的细胞相容性测定及与软骨细胞体外的复合

目的测定脱细胞和脱钙处理的脱细胞骨软骨支架的细胞相容性及该支架与软骨细胞体外复合培养的生物学特性和黏附关系,以探讨脱细胞骨软骨支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法采用自制脱细胞骨软骨支架与软骨细胞体外复合培养,用细胞增殖度法测定脱细胞骨软骨支架的细胞相容性,并行电镜观察其相互黏附关系。结果脱细胞骨软骨支架的细胞相容性良好;体外复合实验中,软骨细胞可贴附于材料上生长增殖,并分泌细胞外基质。结论细胞增殖实验显示脱细胞骨软骨支架的细胞相容性良好;体外复合实验显示脱细胞骨软骨支架可与软骨细胞良好复合,适于软骨细胞贴附生长。