EOLA1基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial overexpressedlipopolysaccharide associatedfactor1,EOLA1)基因5′侧翼区的调控序列。方法通过基因组步移克隆EOLA1基因5′侧翼区不同长度的片段,插入β半乳糖苷酶(βgal)报告基因载体,分析各片段在ECV304细胞中的βgal调节活性。结果含EOLA1基因5′侧翼区-1～-2659bp和-1～-1951bp序列的重组质粒在ECV304细胞中能明显表现βgal上调活性,而-1～-361bp序列的重组质粒活性无明显变化。结论EOLA1基因5′侧翼区-361～-1951bp内存在基因转录启动子元件。     

EOLA1基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

EOLAl基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

CCR5基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的 :研究CCR5基因 5′侧翼区的调控序列。方法 :分段构建CCR5基因 5′侧翼区的pCAT报告基因载体 ;分析各片段在Hela细胞中的CAT调节活性。结果 :CCR5基因 5′侧翼区基因 - 1～ - 4 86bp序列的pCAT重组质粒在Hela细胞中能明显表现CAT上调活性 ,其活性比pCATenhancervector的活性高 3倍。结论 :CCR5基因 5′侧翼区基因 - 1～ - 4 86bp序列中存在基因转录上调元件     

CCR5基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的：研究CCR5基因5′侧翼区的调控序列。方法：分段构建CCR5基因5′侧翼区的pCAT报告基因载体；分析各片段在Hela细胞中的CAT调节活性。结果：CCR5基因5′侧翼区基因－1～-486bp序列的pCAT重组质粒在Hela细胞中能明显表现CAT上调活性，其活性比pCAT enhancer vector的活性高3倍。结论：CCR5基因5′侧翼区基因－1～-486bp序列中存在基因转录上调元件。     

转化生长因子β1启动子质粒重组体的构建及活性研究

目的:探讨调控TGFβ1基因高水平转录的启动片段.方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增获得TGF-β1基因转录起始位点上游5'端-1328～ 812 bp的片段中不同长度的片段,以此作为启动子与含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的质粒pCAT3-enhancer重组成5个重组体,并将其转染至大鼠肝里状细胞株中,测定细胞的CAT的表达水平并比较各重组体的启动子活性.结果:-308～ 812 bp序列具有较强的启动活性,-611～ 812 bp次之,其他几个重组体的启动活性从高到低的排序依次为1328～ 812 bp、-867～ 812 bp、 227～ 812 bp.结论:TGF-β1基因启动子片段中,-308～ 812 bp、-611～ 812 bp、1328～ 812 bp重组体具有较强的启动活性,是进一步研究人TGF-β1基因转录调控的重要靶序列.     

人趋化因子受体5基因5''侧翼区功能分析

目的：分析人趋化因子受体5（CCR5）基因5’侧翼区的调控序列。方法：构建CCR5基因不同长度5’侧翼区的萤光素酶报告基因载体，分别转染人Jurkat细胞中，检测分析其萤光素酶活性。结果：CCR5基因5’侧翼区-1006bp至-1bp、-804bp至-1bp、-586bp至-1bp和-478bp至-1bp区段的pGL3重组质粒在Jurkat细胞中能表现出明显的萤光素酶活性。结论：CCR5基因5’侧翼区-478bp至-1bp序列中存在基因转录的主要上调元件。     

小干扰RNA表达载体介导的EOLA1基因表达抑制研究

目的设计和构建EOLA1基因特异性的小干扰RNA质粒,并初步验证其对靶基因的抑制作用.方法将靶点特异性的寡核苷酸连接到经ApaⅠ-EcoRⅠ酶切线性化的pBS/U6质粒,测序验证,阳性重组质粒转染ECV304细胞,半定量RT-PCR方法检测靶基因的表达,阳性重组质粒与pEGFP-EOLA1共转染,观察外源报告基因绿色荧光蛋白的表达.结果构建的阳性重组质粒转染能够抑制靶基因EOLA1 mRNA的表达,并能够显著抑制EOLA1-EGFP融合蛋白的表达.结论成功构建了针对EOLA1基因的siRNA质粒,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

人SMYD3基因启动子荧光素酶报告载体的构建与分析

目的:克隆5'长度不同的SMYD3基因启动子序列并进行活性鉴定.方法:采用PCR方法克隆出SMYD3基因转录起始位点上游不同长度的基因片段,构建T载体并利用酶切与测序进行鉴定;将该基因亚克隆至pGL3-Basic荧光报告基因载体上;瞬时转染Hep3B细胞后用双荧光报告检测系统检测不同片段的荧光活性.结果:T载体酶切与测序结果正确,成功构建了pGL3-Basic+370～1 400 bp荧光报告载体并利用双荧光素酶报告基因检测系统分析了重组质粒的荧光活性.结论:pGL3-Basic+370～1 400 bp重组质粒转染组与阳性对照组相比并未表现出显著的荧光活性,本研究认为SMYD3基因的启动子核心区域位于-1 334 bp的上游.     

食管癌细胞中fascin基因启动子区的克隆与初步鉴定

目的:对食管癌细胞中fascin基因启动子区进行克隆鉴定. 方法:应用PCR技术从食管癌细胞系EC109中扩增出fascin基因5′侧翼区5段不同长度的片段,并将其克隆至萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic(pGLB)中, 然后将这些质粒与对照质粒pGLB、内参照质粒pRL-TK共转染EC109细胞,48 h后用双荧光素酶检测系统分析这些重组子报告基因转染细胞的相对荧光强度,并结合生物信息学分析,以判断fascin基因启动子区所在位置. 结果:用DNA重组技术成功构建了5个系列缺失重组荧光素酶报告基因表达载体. 相对荧光素酶活性检测表明,与对照组相比,上述一系列重组质粒转染细胞均显示出较高的荧光素酶活性. 生物信息学分析发现,在启动子区(-436～ 1)有标志性调控元件TATA盒(-34～-29). 结论:在食管癌细胞中fascin基因的启动子区可能位于转录起始位点上游约436 bp的区段内.     

哺乳动物性别决定基因的研究进展

目的了解哺乳动物性别决定基因的作用与功能。方法查阅本领域国内外文献并进行综述。结果SRY、SOX9、WT1、SF1、AMH及DAX1等基因都参与哺乳动物性别决定。结论性别决定基因的研究对性分化与发育异常等临床疾病的诊断和治疗具有十分重要的意义。     

Ｌｉｍｓ Ｅ：一个新的ＬＩＭ同源域基因的克隆和初步分析

目的:克隆与分析小鼠不同剪切的Lims基因.方法:应用巢式RT-PCR,以小鼠cDNA为模板,扩增Lims基因不同剪切子,构入PinPointTM Xa-1T质粒,测序鉴定.结果:测序表明克隆了新的Lims基因变异剪切体Lims E,该变异剪切体编码区为1 164 bp.编码387个氨基酸.结论:比较基因组学分析显示,成功地克隆了一新的小鼠Liras基因剪切子Lims E,为进一步研究Lims基因在细胞发育中的功能打下了基础.     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

Rh(-)献血者128例基因分型

目的：探讨Rh(-)献血者RhD基因分型的临床意义。方法：采用PCR－－SSP技术检测郑州市128例Rh（－）献血者的RhD基因结构，用氯仿／三氯甲烷法放散检测D^u检测，结果：RhD基因多态性存在3种基本形式，其中外显子完整存在32例（25．00％），全部为D^u型，完全缺失85例（66．41％），部分缺失11例（8．59％），其中2例为D^u型。结论：RhD基因的丰富多态性对于确保输血安全具有指导意义。     

穿梭质粒pZH32的构建

以pS189、pSV_2gpt、pMCi5为材料,构建了以EB病毒为基础,以酪氨酸tRNA琥珀突变校正基因SupF为靶基因,以黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因Eco gpt为选择标记基因的穿梭质粒pZH32。pZH32长9.4kb,克服了以SV40为基础的穿梭质粒自发突变率高以及宿主范围局限的缺点。SupF基因遗传背景清楚,长度126bp,便于进行序列分析。gpt基因使转化克隆的筛选更加方便。有利于建立一种化学诱变剂的分子检测系统,研究基因突变的类型和突变机制。     

人B7-1/Sart3融合基因的克隆和表达

目的：构建人共刺激分子CD80(B7-1)、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(Sart3)融合基因真核表达载体，并分别在原核和人成纤维细胞中表达。方法：采用RT-PCR技术，从人胎盘组织抽提的总RNA中克隆Sart3基因的部分cDNA序列(第1～1281bp)．此段序列包括已报道的能诱导HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞的抗原表位。然后将不含终止密码子的B7-1 cDNA和Sart3 cDNA共克隆入真核表达载体pEGFP-N1，测定核苷酸序列确定重组成功后，分别转染大肠杆菌和人成纤维细胞，利用流式细胞仪和Western blot检测B7和Sart3的表达。结果：构建人B7、Sart3融合基因真核表达载体B7sart3／pEGFPN。测序结果与GenBank的B7、Sart3相应序列(NM_005191、NM_014706)一致．阅读框无改变。流式细胞仪测定发现在转染的人成纤维细胞表面有明显的荧光增强．免疫印迹发现融合蛋白可以与抗B7抗体反应，融合蛋白分子量与B7-Sart3-EGFP的预测分子量相当。结论：成功构建真核表达载体B7Sart3／pEGFPN，并在人成纤维细胞中表达。为下一步研究将SART3蛋白作为肿瘤疫苗应用于骨肉瘤的生物治疗打下基础。     

GFP-pl6融合基因表达载体的构建

本文报道了以ＧＦＰ（绿色荧光蛋白）基因为报告基因，ｐｌ６基因为目的基因，将ｐｌ６基因分别插入ＧＦＰ基因的上游和下游，构建成ＧＦＰ－ｐｌ６融合基因表达载体ｐＣｐｌ６Ｇ和ｐＣＧｐ１６，并通过酶切、电泳技术对重组体进行了鉴定。该表达载体的构建成功为开展ｐｌ６转基因动物模型的建立及其特性研究奠定了基础     

慢性胃炎胃粘膜上皮细胞中bax、fas、p16基因的表达

目的:探讨bax、fas和p16在胃粘膜病变发生发展过程中的作用及意义.方法:应用免疫组织化学方法,检测慢性浅表性胃炎(CSG)和轻、中、重度慢性萎缩性胃炎(CAG)患者胃粘膜上皮细胞中bax、fas(促凋亡基因)和p16(增殖负调控基因)基因蛋白的表达情况.结果:CSG和轻、中、重度CAG胃粘膜中bax的表达率分别为41.75%、72.41%和78.26%,fas的表达率分别为39.81%、65.52%和78.26%,p16的表达率分别为9.71%、24.14%和30.43%.轻、中、重度CAG与CSG比较,bax、fas、p16的表达差异有显著性意义P<0.05～0.01.轻、中、重度CAG间比较,差异无显著性意义.结论:bax、fas和p16的高表达,使得细胞增殖/凋亡的比例失衡,在胃粘膜病变的发生发展中可能有重要意义.     

子宫肌瘤基因芯片的研究

基因芯片是一种能快速检测大量基因表达的分子生物学研究工具。子宫肌瘤基因芯片的研究发现,肌瘤中与细胞生长、增殖、凋亡、代谢、细胞运动性、血管发生、细胞外基质形成、细胞分化和免疫相关的基因表达发生了改变。文章综述子宫肌瘤基因芯片的研究进展,从分子水平探讨子宫肌瘤的发病机制。     

可诱导型真核表达载体的构建及其表达效率的测定

目的：利用ＭＴ－Ⅱ启动子的Ｚｎ＾２＋诱导表达特性,构建含多克隆位点的可诱导型真核表达载体ｐＭＤＮＡ３－ｎｅｏ,并用荧光素酶报告基因（ｌｕｃ）检测其表达效率。方法：用分子克隆方法构建载体,并将ｌｕｃ基因克隆到其多克隆位点内,转染胃癌细胞ＳＧＣ７９０１,Ｇ４１８筛选出稳定克隆,分别在不同浓度ＺｎＳＯ４级不同诱导时间下进行诱导表达和测定,并检测不同单细胞株的表达效率。