指状青霉诱发大鼠细胞DNA突变效应研究

目的 :研究指状青霉 (Penicilliumdigitatum)的致突变效应。方法 :采用E .coliND 16 0菌株 ,大鼠肺及肝原代细胞非程序DNA合成 (UDS)试验和E .coliK12infA基因突变试验及infA基因序列测定和分析。结果 :指状青霉提取物 :①可明显地诱发E .coliND 16 0菌株回复突变 ;②可明显诱导大鼠肝原代细胞UDS((P <0 .0 5 ) ,极显著诱导肺原代细胞UDS(P <0 .0 1) ;③可诱导E .coliK12infA基因DNA序列中 5个碱基位点突变 ,且其中 1个位点的突变还可导致编码相应氨基酸的变异。结论 :指状青霉对原核细胞和真核细胞DNA均有明显的致突变性     

指状青霉致突变性研究

目的：研究指状青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）提取物的致突变性。方法：采用了细菌回复突变试验,小鼠骨髓 ＰＣＥ微核试验,大鼠肺及肝原代细胞程序外ＤＮＡ合成试验（ＵＤＳ）和大肠杆菌 Ｋ１２ ｉｎｆａ基因突变试验及 ｉｎｆＡ基因 序列测定和分析。结果：指状青霉提取物：①可明显地诱发大肠杆菌ＮＤ－１６０菌株回复突变;②可使小鼠骨髓 ＰＣＥ微核率极显著增高（Ｐ＜０．０１）;③可显著诱导大鼠肝原代细胞ＵＤＳ（Ｐ＜０．０５）及极显著诱导肺原代细胞ＵＤＳ （Ｐ＜０．０１）;④可诱发大肠杆菌Ｋ１２ ｉｎｆＡ基因ＤＮＡ序列中５个碱基位点突变,且其中１个位点的突变还可导致翻 译相应氨基酸的变异。结论：指状青霉对原核细胞和真核细胞,无论在体内或体外均有致突变活性。     

冬凌草甲素对大鼠肺及肝原代细胞非程序DNA合成的影响

目的 :探讨冬凌草甲素的抗突变作用。方法 :用大鼠肺及肝原代细胞非程序DNA合成 (UnscheduledDNASynthesis,UDS)实验检测冬凌草甲素对UDS的影响。结果 :冬凌草甲素可明显地抑制诱变剂诱导的UDS水平 ,尤其是对盐酸氮芥 (NH2 ·HCl)诱导肝原代细胞UDS的抑制作用更为明显 (P <0 .0 1) ,其抑制率达 73 8%。结论 :冬凌草甲素具有明显的抗DNA突变作用     

圆弧青霉提取物的回复突变性

从河南省林县食管癌高发区采集的500份陈粮中,分离鉴定出19株圆弧青霉,以Raulin—Thom氏液体培养基培养成膜状物和菌液,分别提取两种培养物,对所得各提取物进行细菌回复突变试验。结果2株提取物使TA98、TA100检试菌株呈现诱变阳性,16株提取物使E.coli ND—160产生回复突变阳性(84.21%)。表明圆弧青霉产毒菌株广泛存在,其提取物能使检试菌遗传基因DNA产生碱基对置换和移码突变。     

指状青霉提取物对大肠杆菌infA基因的致突变研究

为了研究分离获得的引发桔子霉烂的优势真菌指状青霉提取物的致突变作用。方法：将Ｅ．ｃｏｌｉ ｋ１２菌株作为诱变对象，利用ＰＣＲ扩增得到ｉｎｆＡ基因片段，通过Ｔ载体克隆并作序列分析。结果：ｉｎｆＡ基因片段中 有５个点突变存在；推导氨基酸序列有一个氨基酸变异（Ｌｙｓ→Ｖａｌ）。结论：指状青霉提取物可引起 Ｅ．ｃｏｌｉ ｋ１２菌株 基因突变。     

霉烂水果优势真菌提取物致突变性研究

用细菌回复突变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞（ＰＣＥ）微核试验，研究了经分离获得的引发梨霉烂的优势真菌互隔交链孢霉（Ａ．ａｌｔｅｒｎａｔａ）及引发桔子霉烂的优势真菌指状青霉（Ｐ．ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）提取物的致突变性。结果表明：所测试的３株互隔交链孢霉（Ａ_１、Ａ_２、Ａ_３）提取物及４株指状青霉（Ｐ_１、Ｐ_２、Ｐ_３、Ｐ_４）提取物均可不同程度地诱发Ｅ．ｃｏｌｉＮＤ－１６０菌株回复突变。且其中Ａ_１、Ａ_２和Ｐ_２、Ｐ_４株提取物还可诱发小鼠骨髓ＰＣＥ微核率明显升高（Ｐ＜０．０１）。结果提示分别引发梨及桔子霉烂的互隔交链孢霉及指状青霉其代谢产物均具致突变性。     

一种适合于筛选化学物质DNA-损伤作用的改良UDS检测法

哺乳类细胞非程序性DNA合成(UDS)的检测是一种很成功的化学物质致突变性/致癌性筛选试验。有一些在细菌诱变试验中呈低活性或无活性的诱变剂/致癌剂,在本试验中为阳性。最近证明可诱发小鼠皮肤癌、血管肉瘤、肺、肾、肝和肠腺癌的农药杀虫脒,在一组短期试验中,只有UDS试验获得阳性。因此,UDS试验     

指状青霉提取物对大肠杆菌inFA基因的致突变研究

目的：为了研究分离获得的引发桔子霉烂的优势真菌指状青霉提取物的致突变作用。方法：将Ｅ．ｃｏｌｉ ｋ１２菌株作为诱变对象，利用ＰＣＲ扩增得到ｉｎｆＡ基因片段，通过Ｔ载体克隆并作序列分析。结果：ｉｎｆＡ基因片段中有５个点突变存在，推导氨基酸列有一个氨基酸变异。     

四种香烟烟雾冷凝物对大鼠肺细胞程序外DNA合成的影响

用程序外DNA合成试验(Unscheduled DNA Synthesis,UDS)研究了四种市售香烟的烟雾冷凝物(Cigarette Smoke Condeinsate,CSC)对新鲜分离的大鼠肺细胞的DNA损伤作用。结果表明:四种CSC在一定浓度范围内均可诱发大鼠肺细胞的DNA损伤,与溶剂对照相比差异有极显著意义,并存在一定的剂量效应关系;而且进口555牌带普通醋酸纤维滤嘴香烟的CSC的损伤作用显著大于国产带普通醋酸纤维滤嘴和不带滤嘴香烟的CSC的作用。提示:CSC可诱发肺细胞的突变,吸烟与肺癌的发生可能有直接关系。     

大肠杆菌感染对人巨噬细胞系U937凋亡的影响

目的：探讨大肠杆菌（E.coli）感染与人巨噬细胞系U937细胞凋亡的关系.方法：以Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测及Hoechst 33258荧光染色,Giemsa染色等细胞形态学观察为指标,研究E.coli感染对U937细胞凋亡的诱导作用.结果：Giemsa染色：E.coli感染10,20 min（U937：E.coli=1：20）后偶见细胞凋亡,感染30,60及90min时可见许多细胞有典型的凋亡形态学改变,并可见凋亡小体;Annexin V FITC/PI双染可见U937细胞凋亡百分率随E.coli感染时间的延长而增高.感染30,60及90min时,细胞凋亡率与对照组相比明显增高,有显著性差异（P＜0.001）.Hoechst 33258荧光染色结果表明当细胞与细菌浓度比较低时（1：10）即可引起部分U937细胞发生凋亡,U937细胞凋亡百分率随E.coli感染剂量的增加而增加,且Hoechst 33258荧光染色及流式细胞仪二种方法所得结果一致.结论：E.coli以时间和剂量依赖方式诱导U937细胞凋亡.     

SAGS红细胞保存液的毒性研究

本文报道了SAGS红细胞保存液的毒性实验结果，表明SAGS对大鼠体重增长无影响；对动物心、肝、脾、肺、肾重量未见不良影响及病理损害；对红细胞、白细胞、血红蛋白、骨髓细胞的生成亦未见不良反应；对中国仓鼠肺成纤维细胞（V_(79)）无毒性反应。致突变试验显示：SAGS对Ames标准菌株无诱发基因点突变；无诱发小鼠骨髓细胞PCE微核增加；亦不诱发人外周血淋巴细胞姐妹染色单体互换（SCE）频率增加；即该剂无致突变作用。     

牙龈卟啉单胞菌FtsZ降解试验模型-clpP基因缺失株的构建

目的 建立牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZ （FtsZPg）体内降解试验模型,即构建蛋白酶编码基因clpP缺失的E.coli MG1655.方法 将一段两端含靶基因同源臂的PCR产物电转入L-阿拉伯糖诱导后表达λ噬菌体重组蛋白、具有较强重组能力、含质粒pKD46的菌株E.coli MG1655感受态细胞,以PCR产物中的氯霉素抗性基因替代靶基因.结果 利用氯霉素抗性平板筛选阳性重组体,得到E.coli MG1655的ClpP蛋白酶基因敲除突变株.通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序最终鉴定阳性clpP基因缺失株.结论 本试验成功构建了E.coli MG1655 clpP敲除株;该敲除株有望在探讨重要牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌分裂关键蛋白FtsZPg与蛋白酶clpP的关系中发挥一定作用.     

污染水果的霉菌提取物诱发微核实验

应用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验，分别对从市售污染水果梨和桔子中分离出的优势真菌互隔交链孢霉和指状青霉提取物进行诱变实验。结果：菌株Ａ６和菌株Ｐ３提取物分别在达到２００ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ时，其微核出现率分别为１６．８±０．３９‰、１８．２±０．３８‰，与溶剂对照组（ＤＭＳＯ）３．６０±０．４６‰相比有显著性差异（Ｐ＜０．０１），并呈明显的剂效关系。说明互隔交链孢霉和指状青霉两种提取物含有使染色体损伤的物质。     

蝉拟青霉减轻环磷酰胺所致免疫抑制效应的实验研究

目的：探讨蝉拟青霉对正常及免疫抑制大鼠的免疫调节作用。方法：各组大鼠连续皮下注射相应药物26d后，测定脾脏和胸腺的重量及其系数；用生化方法测定血清，肝，脾，肾胸腺组织细胞中酸性磷酸酶（ACP）和乳酸脱氢酶（LDH）的活力；在电子显微镜下观察脾脏巨噬细胞（Mφ）的形态结构。结果：蝉拟青霉使正常大鼠脾重（脾系数）显增加（P＜0．001或P＜0．01），抑制环磷酰胺所致免疫抑制大鼠的免疫器官（脾脏，胸腺）萎缩（P＜0．05或P＜0．01）；使正常大鼠肾组织中ACP活力，胸腺组织内LDH活力明显升高（P＜0．05），并能阻遏环磷胺的致免疫抑制大鼠肝，脾，肾，胸腺细胞内ACP，LDH活力的降低（P＜0．05）或P＜0．01或P＜0．001）；电镜观察发现，单以便肝霉使正常大鼠脾Mφ体积增大，胞质内溶酶体增多，细胞表面可见粗而短的突起。结论：蝉拟青霉对机体具有免疫激活活性，并能拮抗环磷酰胺的免疫抑制作用。     

RhoA 在PDGF-BB 诱导的大鼠肝星状细胞迁移机制中的作用

【摘要】 背景 肝星状细胞的迁移在肝纤维化反应中发挥着重要的作用,但其机制尚未阐明。本文旨在探讨Rho GTP酶在血小板源性衍化生长因子-BB（PDGF-BB）诱导大鼠肝星状细胞（HSCs）迁移机制中的作用。 方法 运用Transwell Boyden小室检测原代大鼠HSCs迁移情况并应用FITC标记的鬼笔环肽以及抗Vinculin免疫荧光染色观察细胞骨架变化。Real-time PCR及、Western blot检测原代大鼠HSCs内RhoA、Rac1及Cdc42 mRNA及总蛋白表达并应用GST pull-down检测蛋白活性的改变。将含活化突变型及显性负突变型RhoA的质粒转染大鼠HSC-T6,进一步观察PDGF-BB刺激前后各突变组细胞迁移及细胞骨架的变化。所有数据用SPSS 16统计软件统计分析,组间分析采用t检验,多组样本均数间差异比较用单因素方差分析（ANOVA）。 结果 PDGF-BB直接和趋化刺激均可引起原代大鼠HSCs迁移明显增加,并诱导出现以应力纤维为主的细胞骨架重排。不同浓度的PDGF-BB并不影响大鼠HSCs内RhoA、Rac1及Cdc42 mRNA的表达,但可显著促进RhoA总蛋白表达及蛋白活性的增加。PDGF-BB诱导活化突变型RhoA转染的HSC-T6出现显著的应力纤维形成及细胞周围粘着斑增加,而显性负突变型RhoA转染的细胞即使给予PDGF-BB刺激后也仅有伪足形成。无论有无PDGF-BB刺激,与对照组相比,持续活化突变型及显性负突变型RhoA转染的HSC-T6迁移均有减少。 结论 PDGF-BB可诱导大鼠HSCs细胞骨架重排并促进细胞迁移,而RhoA表达上调及其活化是PDGF-BB诱导大鼠HSCs迁移的信号传导途径之一。     

肝星状细胞具有向肝细胞样细胞分化的干细胞潜能

目的 探讨肝星状细胞是否能体外诱导分化为肝细胞样细胞以及在这过程中某些干细胞标记物的表达和变化.方法 采用标准胶原酶灌注联合percoll密度梯度离心法提取并纯化原代大鼠肝星状细胞,免疫荧光鉴定细胞表型;将原代肝星状细胞分为对照组和实验组进行体外培养,对照组肝星状细胞不加任何细胞因子培养24 h,实验组肝星状细胞加入bFGF 20 μg/L、FGF420 μg/L、HGF 20μg/L、IL-6 1μg/L细胞因子诱导7d;倒置相差显微镜下观察诱导细胞形态的变化,Real-time PCR和细胞免疫荧光技术检测肝星状细胞诱导前后肝细胞ALB、AFP mRNA和蛋白的表达情况,以及诱导前后干细胞标记物mRNA和蛋白水平的表达及变化.结果 ①通过胶原酶灌注联合percoll密度梯度离心法获得的大鼠肝星状细胞,其特异性蛋白Desmin和GFAP表达阳性率≥95％.②实验组大鼠肝星状细胞经过bFGF、FGF4、HGF、IL-6等细胞因子诱导7d后,与对照组细胞相比细胞形态由星形变为类圆形或多角形,转录水平出现肝细胞特异性标记物ALB的表达(P＜0.01)和AFP的表达(P＜0.05),同时实验组ALB和AFP蛋白表达呈阳性,而对照组则呈阴性.③实验组大鼠肝星状细胞经过bFGF、FGF4、HGF、IL-6等细胞因子诱导7d后,与对照组相比干细胞标记物P75NTR转录水平表达下降(P＜0.05),CD90、c-kit、sox-2、oct-4等转录水平表达显著下降(P＜0.01),并伴有干细胞标记物蛋白水平的表达下调或无表达.结论 初步证明肝星状细胞可能具有潜在的干细胞特性,在体外可诱导分化形成肝细胞样细胞,在诱导过程中肝星状细胞的干细胞标记物明显下调.     

总状绿绒蒿醇提物对人白血病K562细胞DNA损伤及细胞周期的影响

目的：探讨传统藏药总状绿绒蒿体外对人慢性髓系白血病细胞株K562细胞增殖活性的影响,并阐明其相关作用机制。方法：不同浓度（30、60、90、120和150 mg•L^-1）总状绿绒蒿醇提物作用于体外培养的白血病K562细胞,同时设置空白对照组, MTT法检测各组细胞增殖抑制率,倒置显微镜观察细胞形态学改变,单细胞凝胶电泳检测细胞DNA损伤,流式细胞术检测细胞周期时相变化。结果：作用于K562细胞24、48和72 h后,不同浓度总状绿绒蒿醇提物组K562细胞生长受到明显抑制,与空白对照组比较,其增殖抑制率明显增加(P＜0.05),并呈浓度和时间依赖性。倒置显微镜下观察,随着总状绿绒蒿醇提物浓度增加,K562细胞数量减少,细胞形态不规则,轮廓模糊,细胞碎片增多。单细胞凝胶电泳（SCGE）检测,与空白对照组比较,60、90和120 mg•L^-1总状绿绒蒿醇提物组K562细核内DNA片段化、TailDNA%升高,差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。细胞周期检测,60、90和120 mg•L^-1总状绿绒蒿醇提物作用于K562细胞24 h后,G0/G1期、S期细胞所占比例逐渐下降,G2/M期细胞所占比例逐渐升高,分别为（1.88±0.30）%、（5.46±0.57）%和（19.80±1.03）%,各浓度组与空白对照组［(1.10±0.12) %］比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,总状绿绒蒿醇提物组K562细胞周期发生了G2/M期阻滞。结论：总状绿绒蒿醇提物对K562细胞有显著
的增殖抑制作用,其机制可能与诱导DNA损伤引发G2/M期阻滞有关联。
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错配PCR致突变的实验条件研究

目的：对目前常用的致突菌株和PCR随机突变方法进行评价。方法：用单链抗体表达质粒转化致突菌株XL1-Red，转种传代7d，选取克隆测定DNA序列。用错配PCR在相同基因中引入突变，比较不同Mg^2 浓度、不同dNTP的浓度、不同dITP等条件下所致突变率。结果：在XL1－Red菌株中转种7d（约50代）后，测定突变率＜0.1%。在错配PCR中，增加Mg^2 浓度可提高突变率，增加dTTP和dCTP浓度的致突变效果优于增加dATP和dGTP的效果。在dITP配以低浓度的dATP或dGTP时突变率较低，使用5mmol/L MgCl2、0.5mmol/L MnCl2、1mmol/L dTTP和dCTP的条件下，经2轮PCR（共60个循环）突变率可＞2％。其突变类型有明显偏向性，以A／T的突变为主，转移多于颠换。结论：用致突菌株引入的突变率过低，不适用于抗体亲和力成熟，错配PCR在合适条件下可达到2％以上突变率，适用于随机突变抗体库的构建，但其突变类型有偏向性，应予以考虑。     

保护素对原代肺成纤维细胞炎症及纤维化增殖的影响

目的：探讨保护素（PDX）对脂多糖（LPS）诱导的原代肺成纤维细胞环氧合酶-2（COX-2）表达的影响及对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导其纤维化增殖转化的影响。方法：分离、纯化、鉴定得到小鼠肺成纤维细胞,用LPS诱导建立成纤维细胞体外炎症模型,用TGF-β1诱导建立体外纤维化增殖模型。PDX分别作用于经过LPS或TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞。采用细胞浓度试剂盒测定细胞增殖,采用实时定量PCR测定基因表达,采用ELISA法检测细胞上清液前列腺素E2（PGE2）水平,应用Western blot检测COX-2蛋白的表达。结果：采用10 ng/mL TGF-β1刺激诱导体外培养的原代肺成纤维细胞48 h能建立较为合理的体外纤维化增殖模型。PDX抑制LPS诱导的原代肺成纤维细胞COX-2蛋白的表达及上清液PGE2水平,同时可能通过剂量依赖方式抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞的增殖。PDX抑制TGF-β1诱导的原代肺成纤维细胞collagen 1α1、collagen 1α2的合成以及α-SMA、纤连蛋白的基因表达。结论：PDX能抑制LPS诱导的小鼠原代肺成纤维细胞COX-2表达及PGE2水平,同时能抑制TGF-β1诱导的小鼠原代肺成纤维细胞纤维化增殖、胶原蛋白合成及向肌成纤维细胞转化。     

氟对大鼠肝组织细胞凋亡与DNA损伤的影响?

目的 研究大鼠染氟后肝组织细胞凋亡及DNA损伤情况。 方法 SD大鼠随机分为对照组、低氟组、中氟组、高氟组，每组12只，分别饮用含氟化钠为0、50、100、200 mg/L的去离子水，均饲标准营养大鼠饲料，染氟120天。肉眼观察牙齿的变化，采用氟离子选择电极法测定大鼠尿氟，HE染色观察组织病理学变化，彗星实验检测细胞DNA损伤，流式细胞术检测肝脏组织细胞凋亡率。 结果 低氟组、中氟组、高氟组大鼠尿氟分别为23.52?.91、30.16?.78、61.23?.98 mg/L，均显著高于对照组0.07?.02 mg/L，差异有统计学意义（p＜0.01）。不同剂量染氟大鼠肝组织细胞呈现不同程度肿胀，肝组织内出现多种灶状病变。各染氟组大鼠肝细胞拖尾率及拖尾长度与相应的对照组相比，差异均有统计学意义，并且肝细胞拖尾率及拖尾长度随染氟剂量的加大而增大。不同剂量染氟组细胞凋亡率与对照组相比，均明显增高，而且高、中氟组肝细胞凋亡率显著高于低氟组（p＜0.01）。结论 氟化物可导致大鼠肝细胞DNA损伤，诱导细胞凋亡，一定浓度的氟化物诱导大鼠肝细胞凋亡与DNA损伤之间存在着相关性。