人IL-26的基因克隆及其真核表达载体的构建

基因，构建其真核表达载体并探讨在真核细胞中的表达。方法：提取人外周血单个核细胞总RNA，逆转录 聚合酶链反应（RT PCR）扩增hIL 26基因；目的片段与pMD18 T载体连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α,菌落PCR、酶切分析和DNA序列分析鉴定重组克隆。用SalⅠ和EcoRⅠ将目的片段切下，插入pIRES2 EGFP的相应位点，构建表达载体pIRES2 EGFP/hIL 26并进行酶切鉴定。将重组质粒用非脂质体试剂Fugene 6转染至COS7细胞中。结果：重组克隆载体pMD18 T/hIL 26内插入片段序列与GenBank上报道的hIL 26基因序列完全一致；pIRES2 EGFP/hIL 26经酶切鉴定与预期结果一致；荧光显微镜观察可见转染后的细胞有荧光出现，Western blotting 鉴定证明hIL 26基因得到了有效表达。结论：成功构建了hIL 26基因的真核表达载体并在真核细胞中获得了有效表达。     

诱导细胞死亡的DFF45样效应因子-B在宫颈癌组织中的表达及意义

目的 检测诱导细胞死亡的DFF45样效应因子-B(the cell-death-inducing DNA-fragmentation-factor-like effector-B,CIDE-B)在人宫颈癌组织中的表达,探讨其与宫颈癌发生发展的关系.方法 采用免疫组化技术检测45例宫颈癌、33例癌前病变和10例正常宫颈组织中CIDE-B的表达.结果 CIDE-B蛋白在宫颈癌组织中的表达高于癌前病变及正常宫颈组织(P<0.05),CIDE-B蛋白在癌前病变组织中的表达与正常宫颈组织相比差异有统计学意义(P<0.05).CIDE-B在宫颈癌组织中的表达与临床分期、病理类型、年龄、组织类型和有无淋巴结转移均无关(P>0.05).结论 CIDE-B蛋白高表达可能与宫颈癌的发生发展有关.     

CDH22基因克隆及其真核表达载体的构建与表达

目的克隆人CDH22基因并构建其真核表达载体。方法设计CDH22特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人CDH22cDNA,经T-A克隆,通过双酶切及测序鉴定,将CDH22克隆至pCDNA3/HA,构建人CDH22基因的真核表达载体pCDNA3/HA-CDH22,转染HEK293A细胞,用WesternBlot及免疫荧光细胞化学技术检测目的蛋白的表达。结果成功扩增出人CDH22全长cDNA,双酶切鉴定证实成功构建pCDNA3/HA-CDH22真核表达载体,测序结果表明CDH22全长cDNA与GeneBank中CDH22序列完全一致,转染HEK293A细胞后,可检测出Mr约为86KD的目的蛋白,而免疫荧光细胞化学技术也检测到蛋白表达。结论获得人CDH22基因全长cDNA并成功构建了CDH22真核表达载体,证实pCDNA3/HA-CDH22转染HEK293A细胞后可表达HA-CDH22蛋白,为深入研究CDH22基因在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。     

人真核翻译起始因子3C基因的克隆及表达

【摘要】 目的 构建人真核翻译起始因子3C（Eukaryotic Translation Initiation Factor 3 Subunit C, EIF3C）编码区全长的真核表达载体,转染FaDu人下咽鳞癌细胞系,为探讨EIF3C的生物学功能奠定基础。方法 从人下咽鳞癌细胞系中提取总RNA,反转录成cDNA后用特异性引物PCR扩增EIF3C基因编码区全长（NM_0010378082）,双酶切后将EIF3C基因编码区全长克隆到载体pCMV Blank上,构建真核表达载体pCMV EIF3C。转染FaDu细胞系,real timePCR和Western blot检测EIF3C表达水平。将未加质粒转染FaDu细胞作为未加质粒转染组,加质粒pCMV Blank作为pCMV Blank转染组,以及加质粒pCMV EIF3C作为pCMV EIF3C转染组。分别将pCMV EIF3C转染组EIF3C的mRNA和蛋白表达水平与未加质粒转染组、pCMV Blank转染组进行比较,以及比较未加质粒转染组和pCMV-Blank转染组。通过生物信息学网站和软件分析人EIF3C氨基酸序列的理化性质、磷酸化位点、二级结构和三维结构。结果 测序结果表明构建的真核表达载体pCMV EIF3C中人EIF3C序列正确。转染实验表明载体pCMV EIF3C转染组EIF3C的mRNA水平相比载体pCMV Blank转染组升高708倍,未加质粒转染组升高802倍（P＜0.001）,且载体pCMV EIF3C转染组蛋白表达水平相比于载体pCMV Blank转染组和未加质粒转染组也显著升高（P＜0.05）。EIF3C蛋白质由913 个氨基酸组成,预测含有27个磷酸化位点,其二级结构以α 螺旋和无规则卷曲为主。结论 成功构建真核表达载体pCMV EIF3C,并使EIF3C在下咽鳞癌细胞系中过表达。     

神经营养素3基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠神经营养素-3(NT-3)基因的表达序列,构建大鼠NT-3基因真核表达载体.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-N3,用限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为822 bp的特异片段,重组质粒酶切后产生822 bp和5.2 kb片段,DNA测序证实822 bp片段的碱基序列与大鼠NT-3 cDNA序列完全一致.结论 成功克隆大鼠NT-3基因表达序列并构建了NT-3基因真核表达载体pcDNA3-N3.     

人LIF基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆白血病抑制因子(LIF)基因,测定其序列,构建带LIF基因的真核表达载体.方法:通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从正常妊娠的子宫蜕膜组织中克隆LIF基因,与T载体连接,再酶切T-LIF载体,获得LIF基因,然后将其与质粒PCDNA3.1( )连接,构建PCDNA3.1( )-LIF真核表达载体.结果:经酶切和DNA测序证明LIF基因序列正确,载体构建成功.结论:成功克隆了LIF基因,构建了PCDNA3.1( )-LIF真核表达载体,为LIF在相应真核细胞内表达及LIF蛋白的分离纯化奠定了基础.     

hOP-1全长基因克隆及真核表达载体的构建

目的证实人牙乳头细胞中OP-1的表达,获得hOP-1全长基因及其高效真核表达载体.方法提取人牙乳头细胞总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增hOP-1全长基因并克隆入T载体,筛选阳性克隆进行序列测定后.构建高效真核表达载体pCI/OP-1并筛选鉴定.结果 PCR扩增得到一特异性的约1 300 bp的片段,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致.构建的pCI/OP-1质粒,用于基因转染纯度较好.结论人牙乳头细胞中首次克隆到hOP-1全长基因,并构建获得该基因高效真核表达载体.     

人谷氧还蛋白1基因克隆及真核表达载体的构建

目的 从ECV304细胞中克隆谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)的cDNA序列并构建真核表达载体pcD-NA3.1( )-Grxl.方法 利用Trizol一步法从ECV304细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术从中获得Grx1的cD-NA,将质粒pcDNA3.1( )进行双酶切、CIP处理并回收纯化,与纯化后的Grx1cDNA连接构成重组表达载体pcD-NA3.1( )-Grx1,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆鉴定并进行测序分析.结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人Grx1cDNA.结论 从ECV304细胞中获得Grx1的cDNA,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1( )-Grx1,对Grx1在体外表达、进一步研究其在氧化应激中的作用及其作用机制具有重要意义.     

人KiSS-1基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆转移抑制基因KiSS-1的不含信号肽的表达序列,构建人KiSS-1基因的真核表达载体.方法:从人正常胰腺组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达质粒pcDNA3/KiSS-1.结果:经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组入载体pcDNA3的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pcDNA3/KiSS-1的成功构建,为该基因相应蛋白质的表达和其抗体的制备研究提供基础.     

人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建

目的：克隆人转化生长因子-β1（TGF-β1）基因编码区cDNA序列，构建并鉴定TGF-β1真核表达载体。方法：设计含有EcoRI和Xhol Ⅰ酶切位点的TGF-β1 cDNA引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法，以人白细胞mRNA为模版，扩增TGF-β1基因，纯化PCR产物，TA克隆，双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接，转化感受态大肠杆菌JM109，酶切鉴定阳性董组子，并进行序列测定。结果：琼脂糖凝胶电泳显示，用双酶切后形成分子量1．2kb的条带，符合物理图谱，表明表达载体构建成功，序列测定结果与预测结果完全一致。结论：成功克隆了TGF-β1基因，并成功地构建了真核表达载体pcDNA3-TGF-β1.     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及表达

目的构建含有FLAG标签的人DC—SIGN真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得含有FLAG标签的人DC—SIGN分子基因,将其插入到真核表达载体pIRES—neo中。构建的重组质粒pIRES—neO—FLAG—DC—SIGN转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及WesternBlot检测其表达情况。结果含FLAG标签的人DC—SIGN基因测序正确,PCR和酶切鉴定证明FLAG—DC—SIGN基因已成功连入真核表达载体pIRES—neo中;检测结果显示重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN,且在293T细胞中能有效表达,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。     

人IL-37b基因真核表达载体的构建与表达

目的：构建pEGFP-N1/IL-37b真核表达载体,并检测其在THP-1细胞中的表达情况。方法：从人PBMCs中提取总RNA,利用RT-qPCR技术扩增出IL-37b基因编码区序列,克隆至pEGFP-N1真核表达载体,将构建的重组质粒pEGFP-N1/IL-37b转染到THP-1细胞中,通过RT-qPCR和Western blot检测IL-37的表达。结果：双酶切及基因测序结果显示 IL-37b基因正确插入真核表达载体pEGFP-N1中;RT-qPCR和Western blot结果显示转染THP-1细胞后,IL-37表达水平明显升高（P＜0.01）。结论：成功构建了新型抗炎因子IL-37真核表达载体pEGFP-N1/IL-37b,为进一步研究IL-37功能及与相关疾病的关系奠定基础。     

构建人补体衰变加速因子真核载体并转染NIH/3T3成纤维细胞

目的：构建人补体衰变加速因子（DAF）真核表达载体pSecTag2／HygroB-DAF，并利用壳聚糖组装成纳米微粒复合体，转染小鼠NH／3T3成纤维细胞。方法：应用PCR方法，从DAF—pGEM—T Easy Vector克隆相关的DNA序列，插入具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2／HygroB中，构建pSecTag2／HygroB—DAF真核表达质粒，并进行酶切鉴定及序列测定；利用壳聚糖包裹质粒，转染小鼠NIH／3T3细胞，并对转染细胞用抗DAF进行免疫组化染色。结果：DAF基因大小为1049bp，与基因序列数据库中记载的人DAF cDNA序列结果完全一致；利用壳聚糖-DAF纳米微粒转染NIH／3T3细胞24h后，免疫组化染色显示细胞质弥漫染色阳性。结论：成功构建了人DAF真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NH／3T3细胞。     

人源性AC133-1基因在293T细胞中的真核表达

目的构建人源性肿瘤干细胞标记物AC133-1基因的真核表达载体pcDNA4/TO-AC133-1,并进行真核细胞的表达。方法通过RT-PCR从人急性髓性白血病（AML）骨髓样品中获得编码AC133-1基因的cDNA,定向克隆到真核表达载体pcDNA4/TO载体中,进行酶切鉴定并测序来验证目的基因的正确性。然后在293T细胞中进行转染48h后,采用细胞免疫荧光法和蛋白印迹法来检测AC133-1的表达。结果成功克隆AC133-1全长基因并构建pcDNA4/TO-AC133-1真核表达载体。结论人源性AC133-1的真核表达载体的克隆和构建的成功,为进一步制备其相关抗原、抗体及其生物学功能研究打下基础。     

人EGFR基因真核表达质粒的构建及其在293细胞中的表达

目的:构建人表皮生长因子(EGFR)基因真核表达系统,拟为EGFR靶向腺病毒准备包装细胞.方法:用RT-PCR法,从人A431细胞中逆转录出EGFR基因cDNA,插入到pcDNA3.1(+)质粒中,拟构建EGFR真核表达载体,经测序证实.用脂质体将重组质粒转染293细胞,经G418筛选获得稳定表达EGFR重组克隆,用Western blot鉴定转染细胞中EGFR基因的表达.结果:经限制性内切酶酶切及测序结果分析证实EGFR基因已插入重组质粒.Western blot方法证实转基因293细胞中存在人EGFR基因的表达.结论:成功构建的人EGFR/pcDNA3.1(+)真核表达系统能够在293细胞稳定表达.     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。     

sTRAIL真核表达载体的构建及其对裸鼠胶质瘤的治疗作用

目的构建重组基因表达载体PcDNA-sTRAIL并观察其对裸鼠种植性胶质瘤生长的抑制作用。方法通过PCR扩增和定向克隆技术构建重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL。以阳离子脂质体介导转染裸鼠种植性胶质瘤细胞，同时设立未转染、空质粒转染及Lipofectin转染组，检测转染阳性率，并观察该基因载体对种植瘤生长的抑制作用。结果经过测序鉴定和蛋白表达检测证实，重组真核表达载体PcDNA-sTRAIL构建成功。阳离子脂质体介导质粒转染种植瘤瘤细胞阳性率达50％。脂质体PcDNA-sTRAIL转染种植瘤细胞后，相比未转染、空质粒转染及Lipofectin转染组，种植瘤体积、重量增长明显受抑制（均P〈0.05），表现出一定的肿瘤细胞增殖抑制作用。结论本研究成功构建了sTRAIL基因的真核表达载体，并从体外实验中初步证实了其对裸鼠种植性胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用。