转染PDGF-B反义核酸和tPA基因预防狗冠脉搭桥术吻合口再狭窄

目的： 探讨联合应用组织型纤溶酶原激活物（tPA）基因质粒和血小板源性生长因子（PDGF-B）反义核酸预防冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。方法： 建立狗冠状动脉搭桥术吻合口再狭窄模型，构建tPA基因质粒并设计合成（PDGF-B）反义寡核苷酸，在冠状动脉搭桥术同时以超声波辅助转染心肌细胞和吻合口血管平滑肌细胞，采用常规病理、免疫组织化学、原位杂交以及形态测量方法观察对吻合口局部血栓形成、血管内膜细胞增殖细胞核抗原（PCNA）和PDGF-B mRNA表达以及内膜增生的影响。结果： 成功转染tPA基因和（PDGF-B）反义核酸；2种基因联合应用显著抑制血管内膜细胞表达PCNA和PDGF-B mRNA，抑制率分别为65.01%和81.75%；显著减少局部血管内膜厚度、内膜面积和吻合口血栓形成，使吻合口狭窄率显著减少62.63%。结论： 联合转染tPA表达质粒和PDGF-B的反义寡核苷酸在一定程度上抑制猪实验性冠状动脉搭桥术后吻合口再狭窄。     

超声微泡介导转染FK12.6结合蛋白基因对心力衰竭犬心功能的影响

目的： 探讨白蛋白微泡介导的外源性pcDNA3.1-FKBP12.6质粒转染对心衰犬的治疗作用。方法: 以白蛋白微泡为载体，在超声破坏下将人工合成的pcDNA3.1-FKBP12.6质粒转染入快速起搏心衰犬心肌中。分别在转染后第4、14 d，通过超声和有创血流动力学检查测定左室内径和心功能，同时检测血浆心钠肽（ANP）、脑钠肽（BNP），评价FK12.6结合蛋白（FKBP12.6）基因对心衰的治疗效果。应用RT-PCR检测各组FKBP12.6基因的表达情况。结果: 超声微泡介导的转染可以提高心肌FKBP12.6 mRNA的表达。射血分数（EF）、缩短分数（FS）、血流动力学指标及血浆ANP、BNP在第4 d可见明显好转，并在14 d时保持稳定，但EF、FS和心输出量（CO）一直低于正常水平。在第4 d时LVEDD无变化，而左室舒张末期容积（LVEDV）下降（P<0.05），在14 d时2指标与对照组比较均缩小（P<0.05，P<0.01）。结论: 通过超声微泡介导转染FKBP12.6基因可以改善心脏功能，是心衰基因治疗的新手段。     

纤维蛋白胶外支架转染PCNA基因反义寡核苷酸预防移植静脉再狭窄

背景：前期研究成果,纤维蛋白胶不仅是一种良好的非限制性、生物可降解血管外支架,能够预防移植静脉内膜和中膜增生,而且是一种良好的药物缓释系统,能够提高血管外膜基因转染效率。 目的：验证应用纤维蛋白胶外支架转染PCNA基因反义寡核苷酸预防移植静脉再狭窄的作用。 方法：建立兔颈外静脉颈总动脉旁路移植模型,随机分为模型组、纤维蛋白胶支架组、纤维蛋白胶联合反义PNCA组。后两组分别给予纤维蛋白胶和纤维蛋白胶与携带PCNA反义寡核苷酸腺病毒的混合物于静脉桥外周均匀喷洒。 结果与结论：移植后第28天模型组静脉移植物内膜和中膜增生明显,纤维蛋白胶外支架组静脉移植血管内膜和中膜增生程度明显减少(P  < 0.01),纤维蛋白胶联合反义PNCA组内膜和中膜增生程度明显少于纤维蛋白胶外支架组(P  < 0.05)。纤维蛋白胶联合反义PNCA组PCNA基因mRNA及蛋白表达明显减少纤维蛋白胶外支架组(P < 0.05),纤维蛋白胶外支架组表达明显弱于模型组(P  < 0.05)。提示血管外膜反义PCNA转染可进一步抑制移植静脉管壁PCNA表达,纤维蛋白胶外支架联合反义PCNA对移植静脉内膜和中膜增生有协同抑制作用。     

t-PA基因新型真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)基因的新型真核表达载体,为血栓性疾病的基因治疗奠定基础。方法将tPA基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1MycHisB()中,进行酶切鉴定及DNA测序分析,并将携带有tPA基因的该真核表达载体,通过脂质体介导,转染鼠血管平滑肌细胞,底物发色法测定转基因血管平滑肌细胞tPA活性。结果经双酶切鉴定和测序证实已将tPA基因DNA片段正确插入到真核表达载体中,并能在真核细胞中表达、分泌有活性的tPA。结论成功构建pcDNA3.1MycHisB()/tPA基因新型真核表达载体。     

经心包腔途径转染提高大鼠体内心肌细胞转染的效率*

背景：如何获得安全、有效、广泛心肌组织的转染一直是国内外学者研究的热点。 目的：探讨能够改善动物水平心肌组织非病毒载体的转染效率、增强基因导入靶向性的方法。 方法：以β半乳糖苷酶质粒PLacZ作为报告基因,将Wistar大鼠随机分为5组：①空白组。②心包腔内组：心包腔注射质粒+微泡+酶混悬液,超声导入。③心包腔内阴性对照组：以生理盐水代替质粒干预。④舌下静脉组：舌下静脉注射质粒+微泡混悬液,超声导入。⑤舌下静脉阴性对照组：以生理盐水代替质粒干预。注射6 d后处死,进行心、肺、肝、肾组织的X-gal染色。 结果与结论：转染6 d后,仅有心包腔内组大鼠的部分心肌细胞在心尖、心室及心房水平可见明显的蓝染,其他各组大鼠心肌X-gal染色为阴性;各组大鼠肺、肝、肾组织X-gal染色均为阴性。提示采用心包腔内途径转染、再辅以超声微泡导入以及酶类的使用,可明显改善质粒对在体心肌细胞的转染效率,且不伴有心外组织目的基因的表达,具有较好的靶向性。关键词：心包;心肌细胞;siRNA;RNAi;转染;基因 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.15.027     

超声波辅助转染PDGF-B mRNA的反义寡肽核酸抑制兔动脉再狭窄

目的：探讨反义寡肽核酸在体内对血管平滑肌细胞增殖和再狭窄的影响。方法：建立兔髂动脉再狭窄模型，用合成的反义寡PNA作为药物以超声波辅助转导局部血管壁细胞，分别用原位分子杂交和LSAB免疫组织化学法检测PDGF-B mRNA和PCNA表达；用形态测量法检测血管内膜厚度和面积。结果： PNA显著抑制损伤后1周内膜VSMCs表达PCNA和PDGF-B mRNA，与对照组相比抑制率分别为84.19%和63.95%；显著减少血管内膜厚度和面积。 结论：反义寡PNA可阻止兔VSMCs增殖及内膜增生。     

联合转染p21基因和反义c-fos核酸对兔自体移植静脉内膜增生的影响

目的：探讨联合转染p21基因和反义c-fos核酸对兔自体移植静脉内膜增生的影响，探索一种理想的血管再狭窄的疗法。方法：选择20只新西兰家兔，实验组、对照组各10只，均行自体颈外静脉、颈总动脉移植手术，实验组行腺病毒介导的p21 cDNA溶液浸泡和反义c-fos寡聚核苷酸凝胶涂布；对照组仅行空载腺病毒溶液浸泡和凝胶涂布。术后2周取出移植血管，分别行病理学、免疫组织化学检测移植血管内膜厚度（IT）、内膜平滑肌细胞（VSMC）数及PCNA阳性表达情况。结果：实验组移植血管IT、管腔狭窄度及VSMC数均较对照组减少，增殖细胞核抗原（PCNA）阳性表达情况亦较对照组明显减少。结论：联合转染p21基因和反义c-fos核酸可有效地抑制移植静脉内膜的增生。     

白蛋白微泡促进报告基因在细胞表达的实验研究

目的: 探讨白蛋白微泡作为非病毒载体在基因传输中的作用。方法:6孔板培养脐静脉内皮细胞(EC)和血管平滑肌细胞(VSMC),每孔加pcDNA3.1/His/LacZ质粒20 μg,加不同浓度微泡或不加微泡,超声条件为连续波,频率2MHz,机械指数1.8,照射时间1 min,48 h后计算蓝染细胞百分率和β-半乳糖苷酶活性。另以不同浓度微泡及超声照射时间处理细胞,测定细胞增殖情况。结果:与单纯超声质粒组相比,含微泡组蓝染细胞率增加约10-15倍(其中内皮细胞组11.6倍,平滑肌细胞组15.2倍),报告基因表达定量增加近8倍。微泡浓度为10％时细胞转染效率最高。超声照射对细胞增殖无影响,微泡浓度为50％时有明显的细胞毒作用。结论:白蛋白微泡在超声作用下能明显增加基因的传输效率,有可能成为一种安全有效的基因治疗的载体。     

纳米粒子介导Egr-1 DNA酶转染抑制移植静脉内膜增生**☆

背景：应用基因防治移植血管狭窄、闭塞现已被普遍公认,但如何增加其转染效率现已成为焦点及热点问题。 目的：观察以纳米粒子为载体的外源性Egr-1 DNA酶局部转染对移植静脉内膜增生的影响。 方法：构建Egr-1 DNA酶,应用聚乳酸聚乙醇酸共聚物和聚乙烯醇包载Egr-1 DNA酶,制备纳米级粒子混合物。建立自体静脉移植模型210只,随机分成3组,转基因组转染以纳米粒子为载体的Egr-1 DNA酶,空载体组单纯转染纳米粒子包载的空载体,对照组不予特殊处理。 结果与结论：转基因组内膜中Egr-1基因的mRNA及蛋白产物表达较其他两组明显减少(P < 0.05);在术后7,14,28 d,转基因组内膜增生厚度较其他两组明显减少(P < 0.01);转基因组血管平滑肌细胞凋亡百分比较其他两组明显增高(P < 0.05)。结果表明Egr-1 DNA酶的表达能有效抑制自体移植静脉内膜的增生及促进血管平滑肌细胞凋亡。 关键词：纳米粒子;DNA酶;移植静脉;转染;血管平滑肌细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.08.006     

超声微泡介导转染FKBP12.6基因对小鼠H9c2(2-1)心肌细胞中Ca2+浓度的影响

目的:探讨超声微泡介导转染FKBP12.6基因后,对小鼠H9c2(2-1)心肌细胞中Ca2 浓度的影响。方法:将pcDNA3.1-FKBP12.6质粒与白蛋白包裹微泡造影剂混合,经超声转染H9c2(2-1)细胞后,通过倒置显微镜观察心肌细胞生长状况的变化;激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2 浓度的变化;免疫组织化学方法检测FKBP12.6蛋白的表达。结果:超声触发微泡破裂转染的FKBP12.6基因可在心肌细胞高效表达,细胞生长良好。高表达FKBP12.6的心肌细胞中,总的钙离子浓度增加。结论:超声微泡介导FKBP12.6基因转染心肌细胞,可以明显增加心肌细胞中的Ca2 浓度,心肌细胞的收缩能力增强。     

超声破坏微泡法介导增强型绿色荧光蛋白质粒转染兔股骨头组织的安全性及可行性

背景：超声微泡转染系统已尝试于体内多部位的基因转染,但尚未见有用于骨部位基因转染的报告。 目的：观察超声破坏微泡法介导增强型绿色荧光蛋白质粒转染兔股骨头组织的效率及可行性。 方法：将日本大耳白兔按随机均分为裸转染组,预照射+裸转染组,超声定位转染组,预照射+超声定位转染,重复定位转染组。其中前2组不给予超声定向转染照射,后3组利用超声微泡破裂法介导增强型绿色荧光蛋白质粒,定向基因转染兔股骨头。各组转染1周后,于荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白在股骨头组织中的表达情况。 结果与结论：超声定位转染组,预照射+超声定位转染,重复定位转染组均有增强型绿色荧光蛋白表达,且复定位转染组增强型绿色荧光蛋白质粒在兔股骨头内的转染效率明显高于其他组(P < 0.01)。超声定位转染组,预照射+超声定位转染,重复定位转染组兔超声照射部位软组织和骨组织切片未观察到明显损伤病灶。结果证实,超声微泡破裂法能安全、有效实现增强型绿色荧光蛋白质粒在兔股骨头组织的转染。     

他汀类药物联合抗血小板药物降低冠状动脉搭桥术后血管再狭窄的研究

冠状动脉旁路移植术（CABG）是治疗冠心病有效手段之一,但是其术后易发生桥静脉再狭窄甚至闭塞,发生复发性心绞痛、心肌梗死以及再次血运重建的风险增加。抗血小板药物和他汀类药物是临床提高桥血管通畅率的常用药物,抗血小板药物能减少早期的血栓形成,他汀类药物能够延缓中期的内膜增厚和晚期的粥样斑块的形成。本文就联合使用抗血小板药物和他汀类药物降低CABG术后血管再狭窄的研究作一综述,并对综合治疗CABG术后血管再狭窄的方法进行展望。     

Cationic lipid-mediated transfection of bovine aortic endothelial cells inhibits their attachment

The need for a small-diameter vascular graft for coronary artery and peripheral vascular replacement is great and is projected to increase as the population ages. Synthetic small-diameter vascular grafts fail because of acute thrombosis or chronic intimal hyperplasia leading to restenosis. Endothelial cell seeding has been attempted with limited success in the femoral artery by Zilla and others. However, patency rates have not increased sufficiently to justify large clinical trials. Genetic engineering of endothelial cells before seeding has been proposed to encourage endothelial cell phenotypes that would predispose the graft to patency. In this study, we investigate the effect cationic lipid-mediated transfection of endothelial cells with respect to their attachment to a potential graft material, Fluoropassiv (Vascutek). Liposomal transfection was optimized for maximum gene expression. We report that transfection decreases the ability of bovine aortic endothelial cells to attach by approximately 100% as compared with nontransfected control over 18 h. Further, when placed under physiologic shear conditions, this difference is sustained. The effects of gene transfer on endothelial cell adhesion must be included as an important optimization criterion along with gene expression for engineered endothelial cell-seeding applications.     

超声靶向微泡破碎介导EGFP基因转染肝癌细胞的影响因素研究

观察超声靶向微泡破碎(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)在不同转染条件和细胞状态下对肝癌细胞HepG2转染率及细胞活性的影响.体外培养HepG2细胞,随机分为4组:质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组和超声+微泡+质粒组,各组再分为贴壁和悬浮状态2组.悬浮状态的超声+微泡+质粒组根据质粒和微泡浓度不同分为微泡浓度组和质粒浓度组,转染24h后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在HepG2细胞中的表达,流式细胞仪测定细胞转染率,MTT法检测细胞活性.结果 在超声声强2w/cm2、占空比20％、照射时间60s的超声参数作用下,质粒5μg/ml、微泡:细胞20∶1时,悬浮状态细胞转染率为7.33％±0.98％,存活率为90.37％±1.80％贴壁状态细胞转染率为1.56％±0.81％,存活率为81.10±1.26％,两者比较有显著差异(P＜0.01).悬浮状态下,提高质粒和微泡浓度至质粒10 μg/ml、微泡:细胞40∶1时转染效率增至15.63％±1.81％,且细胞生存率＞80％.结论 相同转染条件下悬浮状态细胞转染率及存活率明显优于贴壁状态.优化质粒、微泡浓度可进一步提高超声微泡介导的基因转染效率和存活率.     

反义凝血酶受体基因表达抑制大鼠动脉内膜损伤后内膜增生

目的 了解凝血酶及其受体在血管损伤后动脉内膜增生中的作用,以进一步阐明经皮冠状动脉血管腔内成形术（PTCA）后再狭窄的发生机制,为寻找再狭窄的防治途径提供线索。方法 采用球囊导管损伤动脉内膜的方法建立大鼠颈动脉球囊损伤模型。用纳米粒子包装凝血酶受体重组反义基因质凿pLXSN/ATR,用保护灌注的方法局部定位转染损伤后的大鼠颈动脉。结果 PCR检测发现重组基因整合,RNA斑点杂交观察到实验组大鼠颈动脉壁内有重组反义凝血酶受体基因表达,正义凝血酶受体基因的表达受到明显抑制,反义基因转染组新生内膜,中膜比例降低了40．9％。结论 反义凝因酶受体重组基因转基因表达对大鼠颈动脉球囊损伤后动脉内膜的增生具有抑制作用,提示凝血酶及其受体在PTCA后再狭窄过程中有重要作用,为再狭窄的防治提供了新的线索。     

tPA基因局部定位转染抑制兔动脉损伤后内膜增生的研究

目的: 观察局部转染组织型纤溶酶原激活物 (tPA)基因, 对手术损伤兔右髂外动脉后内膜增生的影响并探讨可能的机制。方法: 采用显微外科手术方法, 建立兔右髂外动脉损伤模型。将 105只新西兰大白兔随机分为 3组, 每组 35只。A组为生理盐水对照组, B组为脂质体介导的pBudCE4. 1转染组, C组为脂质体介导的pBudCE4. 1 /tPA转染组。用微注射器将各种转染液注入损伤的血管壁, 每组按实验终点(术后 2、3、7、14、28d)再分为 5个亚组, 每个亚组 7只兔。于术后各实验终点, 取损伤段的血管用于病理学检查、电镜观察、RT PCR和免疫组化染色检查。结果: 与A组和B组相比较, 术后各时间点C组血管内膜的厚度、内膜的面积和血管腔的狭窄率均显著减小 (P<0. 01)。术后 28d时, C组血管腔的狭窄率比A组和B组分别降低了 51. 5%和54. 2%。术后各时间点, C组血管壁的tPAmRNA的表达量明显高于A组和B组(P<0. 01), 在术后 7d到达高峰, 并持续到 28d。扫描电镜观察显示, C组的血管壁只见少量血小板附着, 未见血栓形成; 而A组和B组的血管壁可见大量血小板黏附聚集, 且有血栓形成。免疫组化染色显示, C组的血管壁血小板源性生长因子(PDGF)阳性细胞的百分率明显低于A组和B组(P<0. 01)。A组和B组之间相比较, 以上数据差异无显著性(P>     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。 目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。 方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA 进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。 结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。