幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在pMAL-C2x中的表达与免疫学活性研究

目的:在pMAL-C2x中表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)融合蛋白HspA-UreB,探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:从重组质粒pNHA27和pNUB27中纯化回收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接后插入原核表达载体pMAL-C2x中,表达麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合蛋白。采用亲和层析法纯化融合蛋白MBP-HspA-UreB,并辅以弗氏佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印迹法对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体,并以融合蛋白形式MBP-HspA-UreB高效表达,相对分子量为119 000,约占细胞总蛋白的31%。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在119 000处出现特异杂交带。结论:融合蛋白HspA-UreB具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

沙眼衣原体T细胞抗原CT143原核表达、纯化及免疫活性鉴定

目的克隆沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,Ct）T细胞抗原Ct143基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性。方法采用PCR技术从ct基因组中扩增Ct143基因,并构建pGEX-6p—Ct143原核表达质粒,转化E．coli XL1-Blue．IPTG诱导重组GST-CT143融合蛋白表达,经酶切后得到无GST标签的纯蛋白免疫Balb／c鼠,ELISA及Western-blot分析CT143蛋白免疫原性及免疫反应性。结果成功构建了pGEX-6p—CT143原核表达质粒,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的CtD型一致,长度为843bp;GST—CT143融合蛋白在E．coli中获得稳定高效表达;纯蛋白与佐剂混匀后肌肉免疫小鼠,ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1：12800,Westem blot结果表明该蛋白与Ct泌尿生殖道感染病人混合血清中IgG结合,具有免疫反应性。结论成功克隆表达了CtT细胞抗原CT143,该抗原经纯化后具有良好的免疫原性及免疫反应性。     

沙眼衣原体质粒蛋白pORF5原核表达及免疫原性鉴定

目的 构建沙眼衣原体(CT)pORF5蛋白基因重组质粒pGEX-6p/pORF5,表达并纯化质粒蛋白pORF5,并鉴定其免疫原性.方法 用PCR法扩增pORF5基因,定向插入pGEX-6p原核表达载体构建原核表达重组体pGEX-6p/pORF5,重组体经酶切、PCR及测序鉴定后,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达pORF5融合蛋白.融合蛋白纯化后免疫BALB/c鼠,ELISA及Western-blot分析pORF5质粒蛋白免疫原性及免疫反应性.结果 PCR扩增出795 bp基因片段,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的D型Ct一致;pORF5融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1:25 600.结论 pORF5蛋白在原核细胞中可有效表达并具有较好的免疫原性,为进一步研究该蛋白的结构功能、阐明Ct的致病机制、研制基因工程疫苗提供了有利的条件.     

人3型腺病毒纤突的原核表达及其免疫原性分析

目的克隆表达人3型腺病毒(HAdV-3)的纤毛蛋白纤突片段(knob),分析其免疫原性,为腺病毒临床诊断试剂及新型疫苗的研发奠定基础。方法 PCR扩增knob基因片段,克隆到表达载体pGEX-4T-3中进行诱导表达,SDSPAGE电泳分析表达产物,包涵体溶解复性后亲和层析纯化融合蛋白,Western blot鉴定,纯化的蛋白免疫小鼠制备抗血清,间接ELISA法检测小鼠血清的效价,Western blot鉴定抗血清特异性。结果成功构建了重组原核表达质粒pGEX-Ad3 knob,其在大肠杆菌中高效表达并纯化重组knob融合蛋白,融合蛋白免疫小鼠抗血清效价高达10~7,Western Blot证实此抗血清可识别人3型腺病毒纤维蛋白。结论成功获得了重组HAdV-3 knob蛋白,其具有强免疫原性,可以作为研发人3型腺病毒入侵机制研究、诊断试剂及疫苗研发的原料。     

模式抗原破伤风毒素C蛋白的克隆、表达条件优化及免疫原性初步分析

目的 获得高纯度、高免疫原性的破伤风毒素C片段(TTC)蛋白.方法 以PCR从破伤风杆菌质粒DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pET43.1a( )并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达.用Ni2 NTA琼脂糖柱纯化融合蛋白,经凝血酶酶切,再用Ni2 -NTA琼脂糖柱分离目的 蛋白.SDS-PAGE和免疫印迹分析目的 蛋白的相对分子质量和抗原性,动物免疫实验鉴定其免疫原性.结果 获得1373 bp的TrC基因片段,构建成重组表达载体pET43.1a( )-TTC并在大肠杆菌中表达.TTC-Nus融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的22％,酶切后TTC蛋白可与载体蛋白有效分离,获得纯度为95.5％的TTC蛋白,该蛋白可被破伤风抗毒素识别;将TTC蛋白免疫小鼠后,免疫血清可与破伤风毒素特异性结合,三次免疫后其抗体效价可达1:25 600.结论 所获TTC蛋白纯度高,免疫原性好,为研究体内外抗原提呈、免疫应答提供了良好的模式抗原.     

间日疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化及免疫活性的鉴定

目的 在大肠杆菌中表达间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,对重组蛋白进行纯化并测定其免疫活性.方法 将构建的LDH/pGEX-4T-1重组菌BL21接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,ELISA检测血清效价,Western-blotting鉴定其免疫活性.结果 重组质粒在大肠杆菌中表达PvLDH与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在,经复性、纯化后免疫小鼠,能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,ELISA法测效价为1:51200,Western-blotting结果显示该血清能特异性与间日疟和恶性疟患者全血发生反应,而不能与正常人起交叉反应.结论 PvLDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性.     

幽门螺杆菌UreB-Omp11融合蛋白的表达、纯化与免疫学活性检测

目的:在大肠杆菌TB1(pMAL-c2X)中表达幽门螺杆菌(Hp)UreB-Omp11融合蛋白,并探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研制奠定基础.方法:以重组质粒pET30a(+)-ureB-omp11为模板获得融合基因ureB-omp11片段,并插入到原核表达载体pMAL-c2X中进行融合蛋白的表达,用Amylose亲和层析法纯化融合蛋白,纯化的融合蛋白辅以免疫佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印记法对免疫小鼠血清进行检测.结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因ureB-omp11克隆入表达载体pMAL-c2X中;重组菌TB1(pMAL-ureB-omp11)经诱导获得了高效表达的MBP-UreB-Omp11融合蛋白,该融合蛋白可以被Hp免疫小鼠血清的相应抗体所识别,纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在134 000处出现特异杂交带,融合蛋白具有良好的免疫学活性.结论:成功构建了Hp MELHP27融合蛋白UreB-Omp11的重组疫苗候选株TB1(pMAL-ureB-omp11),为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础.     

福氏志贺菌毒力蛋白IpaC的表达、纯化及免疫活性鉴定

目的表达、纯化福氏志贺菌毒力蛋白IpaC并对其免疫活性进行鉴定。方法将含有ipaC基因的pET32a．ipaC表达质粒载体转入大肠杆菌BL21（kDE3）中表达,表达产物进行SDS—PAGE鉴定,并采用QIA expressionist^TM蛋白纯化系统纯化IpaC蛋白;用纯化的蛋白免疫动物获得抗血清,Western-blot检测抗原的免疫活性。结果诱导后的表达产物经SDS—PAGE发现有一相对分子量约为63000的条带,其含量约占总蛋白量的11％,对融合蛋白进行纯化纯度可达90％以上,抗His的抗体Western-blot分析,发现特异性区带出现在63000u处,证明该蛋白是所要表达的融合蛋白,制备的免疫血清可与Ipac发生特异免疫反应。结论pET32a-ipaC重组表达质粒转入大肠杆菌后,可稳定、高效地表达毒力蛋白IpaC,且纯化后的蛋白具有免疫活性。     

EBV编码潜伏膜蛋白2A抗原表位的串联表达及其免疫原性分析

目的:制备具有免疫原性的EB病毒潜伏膜蛋白2A (latent membrane protein 2A,LMP2A)的表位串联蛋白并分析其免疫学特性?方法:用DNAstar软件分析LMP2A的抗原表位,将预测的免疫原性较强的两个表位通过基因合成串联在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,经大肠杆菌BL21表达并纯化?制备的含LMP2A表位重组蛋白经SDS-PAGE?Western blot鉴定后,免疫小鼠制备多克隆抗体,以ELISA检测抗体的效价,免疫组织化学法检测该抗体对天然LMP2A的特异性?结果:通过原核表达与纯化,获得高纯度的表位融合蛋白,经小鼠免疫并制备效价高且特异性的小鼠抗LMP2A的多克隆抗体,该抗体可用于ELISA和免疫组织化学分析?结论:本研究制备的表位融合蛋白,具有天然抗原的免疫原性,可制备能特异性识别天然LMP2A分子的多克隆抗体,为利用表位融合蛋白筛选全人源基因工程抗体奠定了基础?     

人lrg在大肠杆菌中的表达及表达产物的免疫血清制备和鉴定

目的：在大肠杆菌表达人lrg,制备鉴定人Lrg免疫血清．方法：构建pcTAT-lrg重组表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达相应的融合蛋白;对表达的融合蛋白采用镍柱和SDS-PAGE纯化;以纯化蛋白作为免疫抗原,对新西兰白兔实施多次免疫(问隔时间分别为1mo,3wk,2wk)．结果：获得兔抗人Lrg免疫血清．经过ELISA和Western Blot检测,效价在1：1000以上．真核细胞实验表明,6His-TAT-Lrg蛋白具有良好的穿透性,可以在30min内从培养液进入细胞质;免疫组化实验表明Lrg是一种胞质蛋白;兔抗人Lrg免疫血清可有效应用于细胞和组织的检测．结论：制备得到兔抗人Lrg免疫血清,为lrg的功能研究打下基础。     

Cpn0425重组蛋白诱导细胞凋亡和产生前炎症因子的研究

目的研究Cpn0425重组蛋白在体外诱导人单核细胞产生前炎症细胞因子IL-8和IL-1β的水平及诱导细胞凋亡的作用,为进一步探索Cpn感染致病的分子机制提供试验依据。方法 PCR扩增肺炎嗜衣原体Cpn0425蛋白编码基因,构建pGEX6p-2/Cpn0425重组质粒,在E.coli BL21中诱导表达,超声裂解后用谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）纯化树脂纯化重组蛋白,ToxinEraser纯化柱去除内毒素后用不同浓度的GST-Cpn0425刺激THP-1细胞;ELISA法检测经刺激后的THP-1细胞产生的IL-8和IL-1β水平;以WST-1法检测经GST-Cpn0425处理后THP-1细胞的增生或抑制作用;用AnnexinV-FITC-PI染色法检测细胞凋亡情况。结果GST-Cpn0425能诱导THP-1细胞表达IL-8和IL-1β,当浓度增加到6μg/m（l8μg/ml）时,所产生的IL-8和IL-1β量最大,浓度分别为（716.11±41.26）pg/ml和（32.91±5.49）pg/ml。当6μg/ml GST-Cpn0425分别刺激细胞6h后即可从培养基中检测到IL-8和IL-1β,而刺激24h产生的量则达到高峰。GST-Cpn0425以剂量依赖方式抑制THP-1细胞增殖;GST-Cpn0425处理THP-1细胞24h后能诱导其发生凋亡,其细胞凋亡率最高为（17.76±4.2）%。结论Cpn0425蛋白能诱导THP-1细胞表达并分泌前炎症细胞因子IL-8和IL-1β;既能抑制THP-1细胞增殖,又能诱导其凋亡;因而可能是一个重要的致病因素。     

大鼠GAD65基因的克隆与原核表达

目的构建pGEX-6P-3/GAD65原核表达载体,获得大量纯化的大鼠GAD65蛋白。方法通过RT-PCR技术从大鼠脑组织中扩增GAD65cDNA,克隆至PGEM-Teasy载体上并测序,利用引物上的BamHI与EcoRI酶切位点将GAD65基因插入PGEX-6P-3,转化大肠杆菌BL21,限制性内切酶消化鉴定。IPTG诱导重组菌株表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定,并用Sepharose4B亲和层析柱对表达产物进行纯化,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行酶切。结果扩增的GAD65长度为1758bp,测序结果与已知序列吻合。重组子经酶切鉴定,获得PGEX-6P-3GAD65原核表达菌株,获得分子量约91000的PGEX-6P-3/GAD65融合蛋白,分离纯化出约65000的GAD65蛋白,Western-blot表明重组蛋白能被GAD65单克隆抗体特异结合。结论成功获得GAD65蛋白,为研究GAD65生物学作用奠定了基础。     

人Tau基因多表位肽段原核表达载体的构建与表达

目的构建含人Tau多表位肽段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化目的蛋白,检测Tau多表位DNA疫苗免疫小鼠后特异性抗体产生情况。方法以质粒pVAX1-Tau为模板,用PCR扩增人Tau多表位肽段基因,插入表达载体pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-TauP1/P2。将鉴定后的阳性重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并采用GST法纯化、SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达。以TauP1/P2 DNA疫苗免疫小鼠获取血清,Dot-blot检测TauP1/P2特异性抗体产生情况。结果 PCR扩增出约300 bp的基因片段,克隆至表达载体后,经酶切和测序验证正确;获得了纯化的目的蛋白,并证实了GST-TauP1/P2融合蛋白的表达。Dot-blot检测到特异性TauP1/P2抗体的产生。结论成功构建和表达人Tau多表位肽段基因的目的蛋白GST-TauP1/P2,能够识别Tau多表位DNA疫苗免疫后小鼠产生的特异性TauP1/P2抗体。     

重组人Importin α的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的重组表达人细胞核输入蛋白α（Importin α）,制备多克隆抗体。方法提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RT-PCR法扩增Importin α基因。构建pGEX-6P-1-Importin α融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达GST-Importin α重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果 RT-PCR扩增出的Importin α基因片段（1300bp）与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GST-Importin α重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。     

人胰岛素瘤相关蛋白-2基因的克隆及原核表达研究

目的：克隆1型糖尿病自身抗原人胰岛素瘤相关蛋白-2(IA-2)的编码基因，并从大肠杆菌中表达具有免疫原性的人IA-2重组蛋白。方法：抽提胎脑总RNA，通过RT—PCR获得编码IA-2胞内结构域的cDNA，与Pinpoint Xa-IT质粒相连接，构建表达型重组质粒，经转化、筛选并鉴定后，从大肠杆菌诱导表达生物素酰化融合蛋白，进而用亲和层析纯化之，以dot—blot鉴定其免疫原性。结果：重组质粒转化的大肠杆菌经IPTG诱导表达及亲和层析后得到了纯度较高、分子量约为59kd的融合蛋白，表达产物用dot—blot证明具有免疫原性。结论：原核表达的生物素酰化人IA-2胞内段融合蛋白具有正确的免疫学构象。     

Expression and identification of type 1 diabetes associated autoantigen IA-2

Objectives To obtain prokaryotic expressed IA-2 recombinant protein and to identify its immunological activity.Methods The complimentary DNA (cDNA) coding for the intracytoplasmic part of IA-2 (IA-2ic) was amplified from human fetal brain RNA, and was subcloned into the PinPoint Xa-1 T vector to construct recombinant expression plasmid, and was then expressed in E. coli JM109 cells as a fusion protein with a biotinylated peptide sequence at the aminoterminus. The biotinylated fusion protein was then purified by affinity chromatography and was subsequently dialyzed. Finally, its immunogenicity was evaluated by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results The purified IA-2ic fusion protein resolved on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) as a single Coomassie brilliant blue stained band with a molecular weight of 59 kDa and its immunogenicity was confirmed by ELISA.Conclusions E. coli expressed IA-2ic fusion protein has immunological activity. It can be used for detection of IA-2 autoantibodies (IA-2A) and for further studies on type 1 diabetes in future,     

Cpn0585蛋白的免疫活性及血清学诊断初步评价

目的克隆肺炎嗜衣原体包涵体膜蛋白Cpn0585基因,初步探讨其在血清学诊断中的应用价值。方法构建pGEX-6p-2／Cpn0585重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,免疫BALB／c小鼠,间接酶联免疫附试验（ELISA）检测小鼠血清抗体滴度,以重组蛋白作为ELBA包被抗原检测血清中CpnIgG抗体和检测36份Cpn-／Ct＋IsG阳性参考血清。结果高效表达和纯化出一相对分子质量约为95kDa的重组蛋白,蛋白质印迹法证明其能与人抗CpnIgG抗体发生反应;在被免疫的BALB／c小鼠体内,特异性IgG抗体的滴度为1：12800;检测104例临床血清标本中的IgG抗体,与以色列SavyonDiagnostics公司SeroCPTMIgGELISA诊断试剂盒的检测结果进行比较,符合率为98．3％。结论表达的Cpn0585重组蛋白具有良好的免疫活性,在Cpn的血清学诊断中具有较高的应用价值。     

人类疱疹病毒6型U94基因克隆?表达?纯化及抗体制备

目的:制备人类疱疹病毒6型U94蛋白及其抗体.方法:PCR扩增U94基因,经测序后克隆到原核表达载体PGEX-6p-1中.重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,诱导蛋白表达.应用酶切鉴定、SDS-PAGE及Western blot等方法确保基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.表达的蛋白经亲和层析纯化.纯化的蛋白免疫动物制备抗血清.结果:成功地获得了高纯度的U94融合蛋白,纯度可达90%以上.用其制备多克隆抗体滴度可达1:100 000.结论:获得高纯度的U94融合蛋白及其高效价的抗体.     

结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875、Rv3804c细胞表位融合蛋白的表达及其免疫原性评价

  目的  评价结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c的细胞表位融合蛋白的免疫原性,为研制新型多阶段结核疫苗提供可靠的靶抗原。  方法  将Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c基因中的细胞表位串联构成融合抗原基因(命名为msv),克隆到原核表达载体pEASY-Blunt E1中,诱导表达后采用亲和层析纯化表达产物,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用纯化的融合抗原蛋白免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度;分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,采用淋巴细胞增殖法检测其免疫原性。  结果  成功构建了能表达融合抗原基因msv的原核表达质粒;SDS-PAGE和Western blot结果表明,表达产物亲和层析纯化后,获得相对分子质量为41.3×103的目的蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度,结果表明特异性抗体效价约为1:81 920;淋巴细胞增殖实验结果表明,抗原致敏的淋巴细胞经融合蛋白msv刺激后明显增殖。  结论  成功表达并纯化出融合蛋白msv,该融合蛋白可诱导小鼠特异性抗体表达和刺激细胞免疫应答,可作为结核疫苗的抗原组分。