RP构建不同孔隙率骨支架材料对成骨细胞增殖的影响

目的观察复合培养时,成骨细胞在由快速成型技术构建的具有不同孔隙率的骨支架材料中的增殖情况,考察材料的孔隙率对成骨细胞生长的影响,以探索用快速成型技术(RP)构建骨组织工程支架材料的可行性.方法体外分离培养、扩增乳鼠颅骨骨膜成骨细胞,经传代培养作为种子细胞接种于由快速成型技术构建、孔隙率分别为80%,90%,95%的骨支架材料中,复合培养4天及10天后,通过细胞计数及碱性磷酸酶ALP生化染色半定量测定等方法,检测支架材料中细胞增殖情况的变化.结果1.各孔隙率组的成骨细胞增殖数均呈现随培养时间延长而增长的趋势,细胞随培养时间的增加量则以80%孔隙率组为最低(0.35×105),而90%孔隙率组为最高(2.84×105);2.各孔隙率组的成骨细胞内碱性磷酸酶的半定量值变化趋势基本与成骨细胞增殖情况一致,均呈现随培养时间延长而ALP相对活性增高的趋势,随培养时间的增加量也仍以80%孔隙率组为最低,90%孔隙率组为最高.结论快速成型技术构建的骨支架材料的孔隙率对成骨细胞的增殖及ALP相对活性有一定影响,可为组织工程骨支架材料的构形设计提供一定的参考,值得进一步研究.     

小肠黏膜下层对牙周膜干细胞体外增殖、骨向分化的影响

目的 观察小肠黏膜下层 (SIS)与人牙周膜干细胞(PDLSCs)的生物相容性及其作为支架材料对PDLSCs的骨向分化诱导作用。方法 体外分离培养 PDLSCs,分别用四唑盐比色法（MTS）、茜素红染色法、碱性磷酸酶(ALP)和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法观察 SIS 生物材料对PDLSCs增殖活性和骨向分化能力的影响。结果 SIS 显著地刺激体外培养的PDLSCs增殖,诱导了细胞的矿化和提高细胞ALP活性。RT-PCR结果显示SIS诱导后细胞 mRNA 水平表达骨涎蛋白(BSP)和骨钙素（OCN)。结论 体外培养条件下,SIS与PDLSCs有良好的生物相容性,能够诱导PDLSCs骨向分化。     

山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因表达的变化

目的:研究山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因ALP、OCN、COL I mRNA表达水平的变化.方法:采用全骨髓培养法培养骨髓基质干细胞,使用成骨条件培养液体外诱导成骨细胞,通过细胞形态学观察、免疫组化染色、钙结节等检测手段进行成骨细胞鉴定,采用RT-PCR和实时定量PCR检测诱导2周后骨髓基质干细胞ALP、OCN、COL Ⅰ的表达水平,未诱导的骨髓基质干细胞作为对照组.结果:通过成骨细胞鉴定,骨髓基质干细胞成功诱导分化为成骨细胞:OCN和COL Ⅰ基因存细胞诱导组表达上调,ALP基因表达在诱导组和未诱导组间无显著差异.结论:成功诱导山羊BMSCs向成骨细胞分化,成骨分化相关基因在诱导后为适应成骨细胞的功能发生变化.     

碳酸化羟基磷灰石支架及其细胞因子复合物修复鼠胫骨缺损的实验研究

目的:通过动物实验检测碳酸化羟基磷灰石支架材料(carbonated hydroxyapatite,CAP)的骨传导性和生物吸收性。并探讨骨形成蛋白-2(rhBMP-2)、重组人巨噬细胞集落刺激因子(rhM-CSF)对CAP成骨特性和生物吸收的影响。方法:选取45只雄性SD大鼠,制备双侧胫骨临界性骨缺损模型,以复合骨形成蛋白-2(rhBMP-2)的碳酸化羟基磷灰石支架材料、复合重组人巨噬细胞集落刺激因子(rhM-CSF)的碳酸化羟基磷灰石支架材料、单纯的碳酸化羟基磷灰石支架材料作为实验组,羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAP)作为对照组,植入大鼠胫骨缺损处,并设立空白对照组。术后2、4和8周,通过组织学观察对比新骨形成和材料吸收降解情况。结果:实验组和对照组材料均能完全充填骨缺损,材料界面与骨组织结合紧密,显示了良好的生物相容性和成骨性能。随着植入时间的延长,实验组材料可逐渐降解并被新生骨爬行替代,而对照组未见显著降解和新生骨替代。rhM-CSF能够促进碳酸化羟基磷灰石材料的降解,与CAP组、CAP/rhBMP-2复合物组比较,差异有统计学意义。结论:CAP具有出色的骨传导性和生物吸收性,是一种良好的骨再生移植物。且该支架材料的成骨性和生物降解能够被成骨及破骨细胞因子所调控。     

镁黄长石对乳牙牙髓干细胞增殖和成骨分化的影响

目的:研究山羊乳牙牙髓干细胞在镁黄长石表面黏附、增殖和成骨分化特性。方法:采用酶消法培养山羊乳牙牙髓干细胞。在生长培养液条件下,应用荧光显微镜观察细胞在材料表面的黏附情况,以CCK-8法检测细胞在材料表面的增殖特性;在矿化培养液条件下,以pNPP法检测细胞在材料表面于1、4、7 d碱性磷酸酶(ALP)活性,并通过实时定量PCR检测4、7 d时成骨标志基因ALP、COL I、OPN和OCN的表达。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与β-TCP相比,山羊乳牙牙髓干细胞在镁黄长石表面伸展更开,在第4天起增长明显加快,ALP活性在4、7 d更高,镁黄长石组的基因表达水平明显上调,其中OCN表达量在第7天显著增加(P<0.01)。结论:山羊乳牙牙髓干细胞在镁黄长石表面能够良好黏附和增殖。与β-TCP相比,镁黄长石能够促进山羊乳牙牙髓干细胞向成骨方向分化。     

nHACP／CF材料与成骨细胞体外复合培养的实验研究

目的:检测甲壳素纤维增强多孔胶原基骨组织工程支架材料(nHACP/CF)对成骨细胞附着增殖的影响,为骨组织工程支架材料的选择提供实验依据.方法:原代培养大鼠成骨细胞,将第3代细胞与nHACP/CF材料体外复合培养.碱性磷酸酶(ALP)染色对成骨细胞进行鉴定;将不同浓度成骨细胞接种到nHACP/CF支架上,通过检测ALP活性测定最佳接种浓度;通过扫描电镜观察和各培养时点细胞增殖率及ALP活性检测,评价nHACP/CF材料对成骨细胞的影响.采用SPSS11.5软件包对测定结果进行单因素方差分析.结果:大鼠成骨细胞ALP染色阳性.统计分析表明,6×105/ml为细胞最佳接种浓度;大鼠成骨细胞能在nHACP/CF材料上附着、增殖,其生长及功能不受抑制.结论:nHACP/CF材料是大鼠成骨细胞附着生长的良好载体.     

壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米复合物的制备及细胞相容性研究

目的:由壳聚糖(chitosan,CS)和磷酸化壳聚糖(phosphorylated chitosan,PCS)通过静电自组装仿生合成一种新型骨修复材料并体外评价其细胞相容性。方法:对CS进行磷酸根接枝,合成PCS,然后将PCS溶液逐滴滴加到CS的醋酸溶液中,得到壳聚糖/磷酸化壳聚糖复合物(CS/PCS)。将CS/PCS水胶体置于饱和的Ca(OH)_2溶液中矿化供细胞培养用。第3～5代成骨细胞与矿化后的CS/PCS复合物共同培养,以羟基磷灰石组为对照组。倒置显微镜下观察细胞的黏附、生长情况。MTT法检测细胞的增殖;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)检测细胞的分化。结果:CS/PCS复合物呈多孔网状结构,矿化后的CS/PCS可以促进成骨细胞的增殖和分化。结论:仿生合成的CS/PCS复合水胶体矿化后显示了良好的细胞相容性,可以促进成骨细胞的增殖和分化,可作为一种新型的骨修复材料。     

钛表面形貌和亲水性表面对成骨细胞增殖、分化的影响

目的:通过体外实验研究普通喷砂酸蚀纯钛表面和亲水性喷砂酸蚀纯钛表面对成骨细胞增殖、分化等生物学行为的影响。方法:纯钛片表面分别采用光滑处理(smooth pretreated Ti,PT)、大颗粒喷砂酸蚀表面处理(sand-blasted,large-grit,acid-etched,SLA)及亲水性化学活化大颗粒喷砂酸蚀表面处理(chemically-modified SLA,modSLA/SLActive),在表面接种MC3T3-E1成骨细胞,采用MTT、碱性磷酸酶半定量测试以及茜素红染色检测其对成骨细胞增殖、分化的影响,并采用实时荧光定量PCR检测成骨细胞在不同材料表面骨功能基因表达的差异。应用SAS 9.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与光滑钛表面相比,普通喷砂酸蚀钛表面能通过促进ALP、钙基质的分泌和成骨功能基因(Runx2、OSX、OCN和OPN)的表达而显著抑制成骨细胞增殖并促进其分化。在表面粗糙度的基础上增加亲水性,可使这一效应更加明显。结论:表面粗糙度和亲水性是影响成骨细胞生物学行为的重要因素,粗糙钛表面能显著抑制成骨细胞增殖,促进其分化,亲水性的粗糙钛表面促进成骨细胞分化的作用更加显著。     

格列美脲对高糖环境下大鼠下颌骨成骨细胞增殖、分化及矿化的影响

目的:探讨格列美脲对高糖培养的大鼠下颌骨成骨细胞增殖、分化和矿化功能的影响。方法:分离培养大鼠下颌骨成骨细胞,分别给予5.5 mmol/L(生理糖浓度)、16.5 mmol/L葡萄糖浓度的培养液培养,加入或不加入10μmol/L格列美脲后,用噻唑蓝法(MTT)观察成骨细胞7 d时的增殖情况,生化法测定7 d时的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,Western免疫印迹检测7 d和14d时Ⅰ型胶原(collagenⅠ,ColⅠ)的表达,实时定量PCR检测21 d时的骨钙素(osteocalcin,OCN)mRNA的表达,采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:高糖浓度降低了成骨细胞的增殖、ALP活性和OCN的mRNA表达,提高了14 d时的ColⅠ的表达。格列美脲能够促进2种糖浓度下的成骨细胞增殖、ALP活性、ColⅠ的蛋白表达和OCN的mRNA表达。结论:高糖浓度降低了大鼠下颌骨成骨细胞的增殖、分化和矿化能力,在2种糖浓度下,格列美脲促进大鼠下颌骨成骨细胞的增殖、分化和矿化。     

三维打印β-TCP颌骨修复支架的生物学评价

目的:探讨三维打印β-磷酸三钙(β-Tricalcium Phosphate, β-TCP)颌骨修复支架的生物学特性及体内成骨作用。方法:采用自动注浆技术制作β-TCP支架,将前成骨细胞(MC35T3-E1)接种在支架上,扫描电镜(SEM)观察材料结构与细胞黏附,CCK-8法检测细胞增殖,ALP法检测碱性磷酸酶活性。将2种支架复合重组人骨形成蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2, rhBMP-2)后植入大鼠体内,发泡法制作的β-TCP支架为对照组,6周后取材行组织学观察。结果:三维打印支架具有规则多孔的立体结构,适合细胞黏附,且增殖及分化能力均高于对照组(P<0.05)。组织学显示复合rhBMP-2后三维打印支架新骨生成量高于发泡法制作的β-TCP支架(P<0.05)。结论:三维打印TCP支架生物相容性良好,复合rhBMP-2后可异位成骨。     

HMGB1对大鼠骨髓基质干细胞增殖和分化的影响

目的：探讨高迁移率族蛋白B1（HMGBl）对于大鼠骨髓基质干细胞BMSCs增殖、成骨／破骨的影响。方法：原代培养的大鼠BMSCs,分别以浓度为0,100,500ng／mLHMGBl作用于BMSCs,M‘rr法检测细胞数目;以浓度为0,100,500ng／mLHMGBl作用于BMSCs,7d后行AIJP染色和RT—PCR检测成骨／破骨基因的表达（骨钙素OCN,骨保护素OPG,核因子KB受体活化因子配体RANKL）。结果：HMGBl存100、500ng／mL浓度时,第3d和第5dBMSCs的OD值有明显升高,在第7d对BMSCs的ALP染色没有明显的改变,OCN和OPG基因的表达也没有明显变化,HMGBl明显提高了BMSCs的RANKI．及RANKI．／OPG基因表达。结论：HMGBl对大鼠BMSCs的增殖和破骨基因表达有明显的促进作用,为HMGBl应用于临床提供实验依据。     

淫羊藿苷对犬骨髓间充质干细胞增殖、成骨和成脂分化的影响

目的:研究淫羊藿苷对犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖和成骨、成脂分化的影响。方法:将淫羊藿苷配制成终浓度为1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4 mol/L的溶液,以0 mol/L组为空白对照组,分别用于体外培养犬BMSCs。CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶活性。然后实验分为淫羊藿苷组和对照组,分别在含或不含成骨、成脂诱导液条件下,行成骨、成脂诱导分化实验,通过茜素红和油红O染色检测各组钙沉积和脂质形成面积。结果:发现淫羊藿苷1×10-6 mol/L组促进犬BMSCs增殖,而1×10-4mol/L组抑制增殖。碱性磷酸酶活性与淫羊藿苷浓度呈剂量依赖性关系。不含成骨、成脂诱导液条件下,各组均几乎未见明显钙沉积和脂质形成;含成骨、成脂诱导液条件下,淫羊藿苷组(1×10-6 mol/L)钙沉积面积高于对照组,脂质形成面积低于对照组。结论:淫羊藿苷能促进犬BMSCs增殖和成骨分化,并抑制其成脂分化。     

组蛋白去甲基化酶KDM6A促进骨髓间充质干细胞成骨分化研究

目的研究组蛋白去甲基化酶KDM6A对骨髓间充质干细胞成骨定向分化能力的影响。方法构建Flag-KDM6A慢病毒表达质粒。利用慢病毒转染构建稳定过表达KDM6A的骨髓间充质干细胞。碱性磷酸酶活性实验检测成骨分化早期指标-碱性磷酸酶活性。茜素红染色及钙离子定量分析检测干细胞体外矿化能力。实时：毫量RT-PCR检测成骨分化相关基因．骨桥蛋白和骨钙素的表达。结果过表达KDM6A促进骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性、骨髓间充质干细胞体外矿化能力以及骨桥蛋白和骨钙素的表达。结论组蛋白去甲基化酶KDM6A具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的潜能,可以作为一个候选的靶基因用于骨组织工程技术,促进骨组织再生。．     

新型多孔磷酸钙支架对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

目的评价新型多孔磷酸钙（CPC）作为骨组织工程支架对Beagle犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）黏附、增殖及成骨分化等生物学行为的影响。方法将Beagle犬BMSCs接种于新型多孔CPC三维支架表面,以磷酸三钙（TCP）和聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物（PLGA）为对照组,通过观察细胞形态、绘制细胞生长曲线、测定碱性磷酸酶（ALP）活性、进行茜素红染色并半定量测定骨钙素等方法,检测BMSCs在支架材料上的黏附、增殖及成骨分化情况。结果细胞形态和生长曲线结果显示BMSCs在新型多孔CPC三维支架材料表面分布均匀,生长及增殖活跃。ALP活性半定量结果表明,CPC、TCP组ALP表达强度明显高于PLGA组（P＜0.05）,CPC组与TCP组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。骨钙素染色与半定量检测结果均显示：各观察点PLGA组钙盐沉积量明显少于CPC和TCP组（P＜0.05）,而TCP和CPC组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。结论本实验所用多孔CPC材料具有与TCP类似但优于PLGA的良好生物相容性,利于BMSCs的黏附、增殖及成骨分化,可作为支架材料与BMSCs共同培养,构建具有成骨能力的组织工程化骨。     

低氧对人牙周膜细胞骨向分化能力的影响

目的 研究低氧对人牙周膜细胞（PDLC）的碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨相关基因表达的影响.方法 采用组织块法体外分离培养人PDLC;取第3 ～ 5 代细胞分别在常氧和低氧条件下培养后检测其ALP 活性;并通过荧光定量聚合酶链反应（PCR）观察低氧处理后人PDLC 中成骨相关基因的表达变化.结果 低氧12、24、36、48 h 组ALP 活性均比常氧组高;其中低氧48 h 组与常氧组相比明显升高,差异有统计学意义（P ＜ 0.05）;低氧48 h 组ALP mRNA 表达比常氧组高,差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）;4 个时间点低氧组骨钙蛋白（OCN）mRNA 表达均比常氧组高,且差异有统计学意义（12、36 h：P ＜ 0.05;24、48 h：P ＜ 0.01）.结论 低氧增强人PDLC 的ALP 活性,上调ALP mRNA 和OCN mRNA 的表达,促进人PDLC 向成骨细胞分化,同时促进成骨细胞的矿化,提示低氧环境对人PDLC 的骨向分化功能产生一定的影响.     

牙骨质附着蛋白对猴骨髓基质细胞增殖和矿化能力的影响

目的观察牙骨质附着蛋白（CAP）对体外培养的猴骨髓基质细胞增殖及矿化能力的影响。方法抽取猴髂骨骨髓，全血培养法获得骨髓基质细胞。培养液中CAP的浓度分别为0．125、0．25、0．5、1、2μg／ml，以不加CAP为空白对照。MTF法测定各组细胞的增殖活性，同时检测细胞内碱性磷酸酶活性。采用SAS6．12软件对实验数据行单因素方差分析。结果从第3天开始，0．5、1、2μg／ml CAP组与对照组相比能显著促进细胞增殖。对照组与不同浓度CAP实验组对细胞内碱性磷酸酶合成差异无统计学意义。结论0．5～2μg／ml的CAP都能显著促进体外培养的猴BMSCs增殖，但各浓度组CAP对细胞内碱性磷酸酶合成无影响。     

BMP受体在大鼠骨髓间充质细胞成骨中的作用

目的:研究骨形成蛋白受体(BMP-R)在大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)成骨中的作用机制。方法:分离大鼠BMSCs,将原代细胞分为4组,分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)、骨形成蛋白-2(BMP-2)和OM+BMP-2诱导培养基培养。应用碱性磷酸酶(ALPase)活性和钙结节染色(Von Kossa法)检测成骨分化程度,RT-PCR检测骨形成蛋白受体(BMP-R)的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果:OM可诱导BMSCs成骨分化,表现出高碱性磷酸酶活性和基质矿化能力。BMP-2可提高OM诱导BMSCs成骨分化的能力;OM在早期即可诱导BMP-RⅠA和BMP-RⅡ的表达,而BMP-2诱导BMP-R较迟。结论:BMP-2可提高OM诱导BM-SCs分化成骨的能力,BMP-R在BMSCs分化成骨中起重要作用。     

腺病毒介导TWEAK对大鼠骨髓间充质干细胞影响的实验研究

目的：探讨腺病毒介导的TWEAK基因对骨髓间充质干细胞（Bone M esenchym al Stem Cells,BMSCs）细胞的影响。方法：构建含有TWEAK基因的腺病毒载体Ad5CMV-TWEAK和含绿色荧光蛋白的对照腺病毒载体Ad5CMV-EGFP;利用全骨髓贴壁法分离纯BMSCs,通过转染Ad5CMV-EGFP确定病毒对BMSCs的转染效率;以未经转染的BMSCs细胞为空白对照组,以转染Ad5CMV-EGFP为实验对照组,以转染Ad5CMV-TWEAK为实验组,通过计数细胞和测定细胞碱性磷酸酶含量观察转染TWEAK对BMSCs增殖和骨形成能力的影响。结果：Ad5CMT-EGFP对大鼠BMSCs的感染率在300partic les/cell时可达到85%;感染后72小时组实验组与空白对照组差异有统计学分析意义（P〈0.05）,实验对照组与空白对照组差异无统计学分析意义;感染后15 d内各时间点3组间碱性磷酸酶的分泌量经t检验,差异无统计学意义。结论：腺病毒介导的TWEAK基因对于BMSCs具有增殖作用,但并不通过碱性磷酸酶影响BMSCs成骨能力,其在骨形成中的作用需要进一步探讨。     

犬自体血清培养骨髓基质细胞的实验研究

目的:探讨犬自体血清培养骨髓基质细胞的可行性方法:获取犬自体血清,配制成含10%和20%自体血清的培养液,与含10%胎牛血清的培养液在相同条件下培养犬骨髓基质细胞(BMSCs)。通过倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数以及MTT法对细胞增殖情况进行检测。并且对第2代细胞用3种不同血清成分培养液(均加入β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及地塞米松)进行成骨诱导分化,采用免疫组化检测碱性磷酸酶及钙结节形成。对检测到的量化数据做统计学分析,比较各组间的差异,以评价不同血清成分培养液对细胞增殖分化的影响。结果:3组细胞的生长及形态无明显差别,经过诱导培养均能形成钙结节。对3组间量化检测做统计学分析,各组间差异无统计学意义。结论:制备的犬自体血清能完全替代胎牛血清对骨髓基质细胞进行诱导培养。     

静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜诱导骨髓间充质细胞成骨分化的研究

目的：观察静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜对骨髓间充质细胞（BMSCs）粘附、增殖和成骨分化的影响。方法：通过静电纺丝技术制备聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜,将第4代BMSCs接种于纤维膜,扫描电镜、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色、MTT检测BMSCs粘附、分化及增殖能力。结果：在静电纺丝技术制备的聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜表面,BMSCs的黏附和增殖增强,呈现明显升高的ALP活性,并形成矿化结节,提示具有向成骨细胞方向分化的倾向。结论：静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜对BMSCs的细胞相容性较好,适合BMSCs的黏附生长,具有诱导其向成骨细胞分化的潜能,有望成为一种新型牙周组织工程支架材料。