牵张力与雌激素对兔鼻软骨细胞增殖效应调节的初步研究

目的：探讨牵张力与雌激素对兔鼻软骨细胞增殖效应的影响。方法：1）采用MTT四唑盐比色法,检测不同剂量的17~β雌二醇（E2）（10^-12-10^-6mol/L）对第4代新生及6周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞增殖活性的影响。2）将第4代新生及6周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞在细胞膜式牵张力施加装置上培养,检测不同浓度17-β雌二醇（10^-10-10^-8mol/L）及5 kPa牵张力联合应用0、12 h后,对兔鼻软骨细胞增殖活性（PI值）的影响。结果：（1）10^-10-10^-8mol/L17-β雌二醇体外培养新西兰白兔兔鼻软骨细胞生长具有刺激作用,且呈剂量依赖性,最大效应浓度为10^-8mol/L,进一步增加E2浓度则刺激作用减弱。10^-6mol/L具有明显抑制性。（2）5 kPa牵张力联合17-β雌二醇培养较17-β雌二醇的单独作用具有更强的促兔鼻软骨细胞增殖作用。结论：牵张力与雌激素可以调节兔鼻软骨细胞增殖活性。     

牵张力对体外培养兔鼻软骨细胞影响的实验研究

目的：探讨牵张力对体外培养的不同年龄兔鼻软骨细胞增殖活性的影响及牵张力大小与兔鼻软骨细胞增殖活性改变的量效关系。方法：将第4代体外培养的新生及6周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞置于细胞膜式牵张力施加装置上培养，流式细胞仪检测不同的牵张力(5kPa、10kPa)在0-12h内对兔鼻软骨细胞增殖活性的影响。结果：0-10h内5kPa牵张力组软骨细胞增殖指数随着牵张力作用时间的延长不断上升，增殖指数峰值位于10h处；0～8h内10kPa牵张力组软骨细胞增殖指数随着牵张力作用时间的延长不断上升，增殖指数峰值位于8h处；5kPa较10kPa牵张力对体外培养兔鼻软骨细胞具有更大的促增殖作用；牵张力对体外培养的新生兔兔鼻软骨细胞具有更大的促增殖作用。结论：牵张力可促进体外培养的新生及六周龄新西兰白兔兔鼻软骨细胞增殖活性。提示我们鼻软骨牵张方法不仅适用于临床矫治新生儿唇腭裂伴发鼻畸形，而且有可能用于矫治1岁左右婴儿甚至更大年龄患儿的唇腭裂伴发鼻畸形。     

IGF-1信号通路相关蛋白在大鼠髁突软骨细胞增殖分化中的表达

目的:研究胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号转导通路在大鼠髁突软骨细胞增殖分化调控过程中相关基因的表达。方法:体外单层培养并鉴定出生后1、7、14、28 d共4组SD大鼠髁突软骨细胞。免疫组织化学方法检测细胞内IGF-1表达情况,Real-time PCR及Western印迹法检测细胞内IGF-1R、Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达。饥饿培养24 h后,实验组加入质量浓度为100 ng/mL的重组大鼠IGF-1细胞因子(rrIGF-1)继续培养24、48 h,CCK-8检测细胞增殖情况,Real-time PCR技术检测各组髁突软骨细胞内IGF-1R、IGF-2R、Raf1、GSK-3、IGFBP3、NF-κB、Bcl-2、Bax、integrin、TGF-βmRNA表达情况;对照组培养液不加rrIGF-1。结果:各鼠龄组SD大鼠髁突软骨细胞内IGF-1表达均阳性,IGF-1R mRNA及蛋白表达相对平稳,Bcl-2、Bax mRNA及蛋白表达逐渐增强,在出生14 d后表达下降(P<0.05)。加入100 ng/mL rrIGF-1后,髁突软骨细胞增殖速度显著增加,细胞凋亡减少,Real-time PCR结果显示实验组IGF-1R、GSK-3、Bax、integrin mRNA表达整体呈下降趋势;IGF-2R、Raf1、IGFBP3、NF-κB、Bcl-2、TGF-βmRNA表达水平总体呈上调趋势,差异有统计学意义。结论 :IGF-1介导的信号转导途径参与了髁突软骨细胞的增殖、分化以及软骨形成早期的调控,并可能与integrin、TGF-β等其他蛋白相互作用,共同参与髁突发育过程。     

牵张应力对Hedgehog通路相关基因和细胞增殖的影响研究

目的：观察牵张力下Hh通路相关基因的表达以及牵张力对成骨细胞增殖的影响,探索机械应力对成骨细胞的调控机制。方法：应用Flexcell4000TM加力系统对大鼠成骨细胞施加0．5Hz,3％、6％和9％的张应变,作用时间4h、12h和24h。用机械通道抑制剂三氯化钆（GdCI。）对成骨细胞进行干预。采用流式细胞技术测定细胞周期分布与细胞增殖变化,定量PCR检测Hedgehog通路相关基因Ihh、Shh、Ptch和Smo的表达。采用SAS8．0软件包对结果进行统计分析。结果：不同强度、不同作用时间的张应变对Ihh表达量的上调作用亦不相同,6％张应变作用24h的对Ihh表达量上调最为明显,其下游基因Ptch和Smo的表达变化与Ihh类似;上述上调Ihh表达的作用均可被GdCl3抑制。;6％同30％牵张力相比,更能促进成骨细胞的增殖。结论：Ihh基因对力学刺激敏感;Ihh基因表达量的变化与成骨细胞的增殖相关。     

间歇性机械牵张力对人牙周膜成纤维细胞增殖动力学的影响

目的　观察间歇性机械牵张力作用下,人牙周膜成纤维细胞(hPDLFs)增殖动力学的变化,探究机械力介 导的牙周组织改建的可能机制。方法　体外培养hPDLFs,取第4~7代细胞,通过四点弯曲细胞力学加载仪对细胞 加载不同力值大小的间歇性机械牵张力(1 000,2 000,3 000μstrain),分别在不同时间点收集细胞,流式细胞仪测定 细胞DNA含量,计算增殖指数(PI)。结果　机械牵张力影响hPDLFs增殖活性。1 000μstrain和2 000μstrain机械牵 张力组与对照组相比,均能促进细胞增殖,hPDLFs DNA含量增多(P<0·05),增殖指数升高(P<0·05);3 000μstrain 机械牵张力组与对照组比较,增殖指数无差异(P>0·05),但抑制细胞DNA合成(P<0·05)。结论　一定力值范围 的机械牵张力能促进hPDLFs的增殖活性,过大力值的机械牵张力反而抑制细胞增殖。     

不同牵张力对成骨细胞增殖与合成功能的影响

目的:观察周期性牵张应变对成骨细胞增殖与合成功能的影响。方法:体外分离和培养新生大鼠颅顶骨成骨细胞,应用Flexcell 4000TM加力系统施加力学刺激,频率为0.5 Hz,牵张应变大小分别为1.5%、3%、6%及9%,作用时间分别为12、24及48 h。检测成骨细胞的增殖以及合成功能的变化。采用SAS 8.0软件包对结果进行统计分析。结果:①1.5%、3%的牵张应变可以促进成骨细胞I型胶原、骨钙素和总蛋白的分泌量增加,以3%牵张应变增加最为明显。同时,在3%牵张应变的初期可以促进成骨细胞的增殖,而促进成骨细胞的分化成熟的作用大于促进增殖的作用;②6%牵张应变下,成骨细胞骨钙素、I型胶原和总蛋白的分泌量减少,但在6%牵张应变作用的各时间段均使细胞增殖活性明显增高;③9%牵张应变下,成骨细胞增殖和分化功能均受抑制。结论:适度的牵张应变可促进成骨细胞的生长,较小的牵张应变促进分化成熟的作用较明显,较大的牵张应变促进增殖的作用较明显,但过大的牵张应变对细胞的增殖和分化均有抑制。     

雌激素对人胚髁突软骨细胞增殖分化的影响

目的 观察不同浓度的雌激素作用于体外培养的人胚髁突软骨细胞（MCCs）,探讨雌激素对MCCs增殖分化的影响。方法 体外培养MCCs,甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色法鉴定;甲基噻唑基四唑（MTT）法检测不同浓度雌激素对MCCs增殖与分化的影响。结果 高浓度（10-6 mol·L-1）、低浓度（10-12 mol·L-1）雌二醇抑制MCCs增殖分化,生理浓度（10-10、10-8 mol·L-1）雌二醇促进MCCs增殖分化,且随作用时间延长,促进或抑制作用增强。结论 雌激素对体外培养的人胚MCCs增殖分化具有双向调节作用,呈时间和剂量依赖性。表明雌激素对维持颞下颌关节的正常功能具有重要意义,可能在颞下颌关节病的发生和进程中发挥作用。     

静张应力对大鼠髁突软骨细胞增殖效应调节研究

目的　探讨静张应力环境对髁突软骨细胞增殖效应的影响。方法　将第4代大鼠下颌髁突软骨细胞在细胞膜式张应力施加装置上培养,检测不同血清浓度及持续不同的静张应力(5 kPa、10 kPa)在0~12 h内对髁突软骨细胞增殖活性的影响。结果　低血清培养基中,随培养时间的延长,硅胶膜上髁突软骨细胞的增殖活性受到抑制;短期(2h)的静张应力(5 kPa、10 kPa)对髁突软骨细胞细胞周期的调控影响不大;0~10 h内5 kPa静张应力组软骨细胞增殖指数随着张应力作用时间的延长不断上升,增殖指数峰值位于10 h处;0~8 h内10 kPa静张应力组软骨细胞增殖指数随着张应力作用时间的延长不断上升,增殖指数峰值位于8 h处;5 kPa静张应力组较10 kPa静张应力组对髁突软骨细胞具有更大的促增殖作用。结论　静张应力可以调节髁突软骨细胞的增殖活性。     

机械压力对大鼠下颌髁突软骨细胞增殖活性影响的体外研究

目的:建立体外培养细胞加力装置,在细胞水平探讨机械力作用下大鼠髁突软骨细胞功能代谢的变化。方法:采用流式细胞术检测不同时段、不同力值的机械压力对体外培养的大鼠髁突软骨细胞增殖活性的影响。结果:在一定时间、0～2.03×10-4Pa(0～207g/cm2)力值范围内,随着机械压力的增大,受压的下颌髁突软骨细胞增殖活性增高,以持续压力作用6h最为明显;当持续压力作用于下颌髁突软骨细胞24h后,细胞增殖活性则出现下降。结论:在一定时间、一定力值范围内,随着机械压力的增大,受压的下颌髁突软骨细胞增殖活性有逐渐增高的趋势;当持续压力作用超过一定的范围,细胞增殖活性则出现下降趋势     

生长激素对兔下颌髁突软骨细胞增殖活性及分泌功能的影响

目的了解生长激素对体外培养的兔下领裸突软骨细胞周期、增殖活性及分泌功能的影响,为功能矫形治疗时下领裸突的生长改建提供可靠的实验依据。方法采用流式细胞仪和免疫组织化学方法,定量、定性地观察不同浓度的生长激素在不同的时间点对体外培养兔下领裸突软骨细胞的作用。结果①不同浓度的生长激素可刺激下领裸突软骨细胞的增殖活性,增殖指数(PI)变化以生长激素10 pg/ml, 24 h组最为显著,DNA合成变化以 10 r-tg/ml,12 h组变化最为明显。②生长激素有促进兔下领骸突软骨细胞分泌n型胶原的能力,以生长激素 10蒯闹组最为显著。结论生长激素可促进体外培养兔下领骸突软骨细胞的增殖活性及分泌II型胶原的能力。     

不同加载频率拉应力对髁突软骨细胞增殖分化的影响

目的:探讨不同加载频率的拉应力对髁突软骨细胞增殖、分化的影响。方法:体外分离2周龄新西兰兔髁突软骨细胞,对细胞施加2 h/d,为期3 d的不同频率(0 Hz、0.1 Hz、0.5 Hz、1 Hz)的拉应力。采用CCK8检测细胞增殖水平,实时荧光定量RT-PCR检测Sox9、Runx2、VEGF的表达。结果:细胞增殖水平在静止性(0 Hz)组显著高于周期性加力(0.1~1 Hz)组和对照组;Sox9、Runx2、VEGF表达在0.5 Hz组和1 Hz组显著高于静止性(0 Hz)组和对照组。结论:不同加载频率拉应力对髁突软骨细胞增殖分化有差异性影响。     

软骨细胞增殖与凋亡在人重组白细胞介素-1β介导的颞下颌关节炎症损伤中的意义

目的:探讨细胞增殖与凋亡在人重组白细胞介素-1B介导的颞颌关节炎症损伤中的作用。方法:选用SD大鼠颞下颌关节腔内反复多次注射rhIL-1B,造成炎症损伤,利用免疫组织化学染色及原位末端标记法,观察炎症损伤过程中髁突软骨细胞增殖及凋亡的变化。结果:注射后1~30 d,实验侧髁突软骨增殖层PCNA阳性指数均较对照侧低,以1~7 d最明显;实验侧髁突软骨细胞凋亡数较对照侧多,主要分布于软骨增殖层及前肥厚层中,以1~7 d 最明显,15 d后凋亡细胞数明显减少,仅见个别凋亡细胞散在分布于软骨浅层。结论:rhIL-1B关节内注射不仅使髁突软骨细胞增殖受抑制,而且细胞凋亡也可能是rhIL-1B致关节损伤的途径之一,细胞增殖与凋亡协同参与了颞下颌关节炎症损伤的病理过程。     

甲状旁腺素对共培养的髁突软骨细胞和BMSCs成骨分化的影响

目的:研究甲状旁腺素(PTH)在持续性或间歇性作用方式下对共培养的髁突软骨细胞和BMSCs分化和骨质形成的影响.方法:根据PTH应用方式不同分为3组:PTH持续应用组、PTH间歇应用组、空白对照组.用茜素红染色检测培养6 d和14 d后,各组细胞矿化结节的形成情况;用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶活性,应用Western blot和Real-time PCR检测BMSCs成骨分化、骨形成相关蛋白和基因mRNA.结果:PTH间歇应用组在6 d和14 d时形成的矿化结节数量最多,而PTH持续性应用组形成的矿化结节在3组中数量最少.经过6 d和14 d的PTH作用,PTH间歇应用组的ALP活性,RUNX2、BSP和MMP13蛋白,成骨分化标志物RUNX2,ALP和骨形成相关基因OCN及OSX的表达,均明显高于PTH持续应用组和空白对照组(P<0.05).PTH持续应用组COL2a1的mRNA及成骨抑制基因SOST mRNA的表达量明显高于PTH间歇应用组(P<0.05).结论:间歇性应用PTH可明显促进共培养体系的成骨向分化及骨质形成,而持续性应用PTH则抑制该过程.     

咬合干扰对大鼠髁突软骨细胞内质网应激及凋亡的影响

目的:探讨咬合干扰致大鼠髁突软骨退变过程中内质网应激及凋亡相关分子的表达情况。方法:30只8周龄SD大鼠,采用大鼠上颌第一磨牙粘接不良修复体造成咬合干扰大鼠模型,4、8、12周后取颞下颌关节,甲苯胺蓝染色、苏木精-伊红染色观察组织形态学变化,透射电镜观察超微结构,免疫组织化学染色检测GRP78、Caspase-12的表达情况。结果:实验组髁突软骨基质降解、细胞密度降低,内质网膨胀、断裂;GRP78阳性细胞率较对照组显著增多(P<0.05),Caspase-12阳性细胞率在8、12周时明显增加(P<0.05)。结论:咬合干扰后大鼠髁突软骨细胞发生内质网应激及内质网凋亡,可能是髁突软骨退变的重要机制之一。     

ALK2对小鼠髁突软骨细胞增殖分化的影响

目的:探讨ALK2对小鼠髁突软骨细胞增殖及成软骨分化的作用。方法:采用酶消化法提取小鼠髁突软骨细胞并鉴定。体外采用siRNA沉默小鼠髁突软骨细胞中Alk2基因的表达,通过MTT法检测细胞增殖。通过实时定量RT-PCR方法检测软骨细胞标志基因的表达。结果:倒置显微镜观察体外培养的小鼠髁突软骨细胞形态。免疫组化染色显示COLⅠ强阳性,AGGRECAN弱阳性,COLⅡ弱阳性。Pellet培养后实时定量RT-PCR检测发现ColⅡ,ColⅩ和ColⅠ表达上调。证实所分离的细胞是髁突软骨细胞。MTT结果显示Alk2沉默后细胞数量增加,实时定量RT-PCR结果显示Alk2沉默后软骨细胞基因表达下调,并有显著统计学意义。结论:ALK2抑制小鼠髁突软骨细胞的增殖,促进小鼠髁突软骨细胞的成软骨分化。     

不同静压力下髁突软骨细胞MMP-13的表达变化研究

目的:探讨在不同强度及不同时间的静压力作用下,髁突软骨细胞中MMP-13表达的变化及意义。方法 :体外分离培养SD大鼠髁突软骨细胞,用甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定;分别用0、50、100、150、200 k Pa静压力进行2 h的加压处理。另外在200 k Pa静压力下,分别对髁突软骨细胞进行0、1、2、4、8和12 h的加压,采用Western blot免疫印迹及实时荧光定量PCR,分析髁突软骨细胞在不同强度及不同时间的静压力加载后,MMP-13的m RNA和蛋白表达变化。结果 :在50~200 k Pa的静压力范围内,随着压力的增大,MMP-13蛋白及m RNA表达水平均呈下降趋势,实验组表达水平均降至对照组(0 k Pa组)以下,且差异有统计学意义(P<0.05)。在200 k Pa的静压力下,随着加压时间的延长,MMP-13表达呈先上升后下降的趋势,且4 h实验组达最高水平(P<0.05)。结论:髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有较好的适应能力,压力的改变可能影响颞下颌关节的适应性改建。