人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)亲和层析柱的制备及PTA1/Ig的纯化

目的：制备可用于纯化血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ｐｌａｔｅｌｅｔａｎｄＴｃｅｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ１，ＰＴＡ１）融合蛋白的亲和层析柱，纯化真核表达的ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白，以进一步研究ＰＴＡ１的功能及其配体。方法：以硫酸铵及阴离子交换色谱法纯化抗ＰＴＡ１ｍＡｂ，并交联Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ制备ＰＴＡ１亲和层析柱。通过亲和层析法，从ｐＰＴＡ１／Ｉｇ表达载体转染的ＣＯＳ７细胞培养上清中纯化ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白，用夹心ＥＬＩＳＡ及ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定纯化结果。结果：硫酸铵及阴离子交换色谱纯化后，获得纯度高和活性好的抗ＰＴＡ１ｍＡｂ，用其交联Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ制备ＰＴＡ１亲和层析柱，交联率为９６％。该亲和层析柱可从ｐＰＴＡ１／Ｉｇ转染的ＣＯＳ７细胞上清每１００ｍｌ中，纯化ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白约１２６μｇ。结论：制备成功可用于纯化ＰＴＡ１的亲和层析柱，并获得纯化的ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白，为进一步研究ＰＴＡ１的功能及鉴定其配体提供了有力手段     

人血小板/T细胞活化抗原PTA1/Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

目的：获得人血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ｐｌａｔｅｌｅｔａｎｄＴｃｅｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ１，ＰＴＡ１）胞膜外区与人ＩｇＧ１Ｆｃ段融合蛋白，为ＰＴＡ１配体的鉴定及其功能的研究提供有力的工具。方法：针对人ＰＴＡ１ｃＤＮＡ序列设计３段引物，通过反转录、半套式ＰＣＲ方法从活化Ｊｕｒｋａｔ细胞中扩增出ＰＴＡ１胞膜外区基因片段，并将其克隆入融合蛋白表达载体ｐＩＧ中，通过酶切、ＰＣＲ及序列测定鉴定重组表达载体。重组载体通过ＤＥＡＥｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，经夹心ＥＬＩＳＡ及亲和层析、ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定融合蛋白的表达及免疫学活性。结果：经序列测定后证实重组表达载体含有正确的ＰＴＡ１胞膜外区序列及剪接供体序列，转染ＣＯＳ７细胞后，通过亲和层析纯化证实融合蛋白的Ｍｒ为８３０００，并能被抗ＰＴＡ１胞膜外区单抗及抗人ＩｇＧＦｃ的单抗同时识别。结论：ｐＰＴＡ１／Ｉｇ融合表达载体的构建及表达成功，为ＰＴＡ１的功能及配体（ＰＴＡ１Ｌ）的研究打下了良好的基础。     

可溶性PTA1分子的发现及其检测方法的建立

目的 建立检测ｓＰＴＡ１的方法,探讨正常人和肿瘤患者血清中是否存在可溶性ＰＴＡ１（ｓＰＴＡ１）分子。方法 以亲和层析法从血小板纯化的天然ＰＴＡ１分子作为免疫原,制备抗ＰＴＡ１分子的多克隆抗体（ＰｃＡｂ）,并以此建立检测ｓＰＴＡ１的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法。结果 建立的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法敏感性达１００ｎｇ／Ｌ,应用此方法从经ＴＰＡ,ＰＨＡ及抗ＣＤ３ ｍＡｂ活化的人ＰＢＭＣ细胞培养上清中检测到ｓＰＴ     

一种新的人内皮细胞可诱导性粘附分子PTA1的表达,调？…

观察ＰＴＡ１分子在活化人内皮细胞的表达,调度及其所参与的粘附功能。方法用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察ＰＴＡ１在内皮细胞的表达物分布;用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测内皮细胞中ＰＴＡ１ｍＲＮＡ的表达;用Ｎａ２＾５１ＣｒＯ４标记静止和ＴＰＡ活性Ｊ细胞,采用４ｈ粘附实验观察不同条件下内皮细胞和Ｊｕｒｋａｔ细胞间的粘附以及ＰＴＡ１／Ｉｇ融合蛋白 粘附阻断作用。结果（１）静止内皮细胞表达很弱的ＰＴＡ１分子,     

中国版纳猪MHCI类P1分子全长的原核表达与纯化

目的：获得原核表达的中国版纳猪ＳＬＡＩ类Ｐ１蛋白质分子。方法：ＰＣＲ扩增去信号肽的ＳＬＡＩ类Ｐ１ｃＤＮＡ序列，亚克隆至ｐＧＥＭＴ载体，测序。将亚克隆的Ｐ１　ｃＤＮＡ片段插入表达载体ｐＥＴ４２ｂ（＋），构建重组表达质粒ｐＥＴ－４２ｂ（＋）／ｓｌａ－ｐｌ，转化Ｅ·ｃｏｌｉ表达菌 ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＬ，ＩＰＴＧ诱导 Ｐ１－８ ｘ ｈｉｓ融合蛋白表达，经包涵体洗涤，８ ｍｏｌ／Ｌ尿素变性溶解，Ｎｉ２＋亲和层析，梯度透析后，定量保存。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定目的蛋白的表达与纯化。结果：目的蛋白（分子量３９．５ ｋＤ）表达量占细菌总蛋白 １５％，每升表达菌获得纯度９５％的目的蛋白 ４０ ｍｇ～６０ｍｇ。结论：成功建立猪 ＳＬＡ分子全长原核表达、纯化体系，为建立间接识别猪移植抗原ＳＬＡＩ类分子的人Ｔ细胞系及表位分析打下基础。     

抗Dystrophin特异性抗血清Anti 5－7的制备

应用作者自行制备的含ＤＭＤ基因中段缺失突变热点区ｃＤＮＡ片段的克隆菌株ＴＡＰ１０６（ｐＳＤ），表达出ＤＭＤｃＤＮＡ５－７蛋白，作为抗原制备特异性抗血清。利用彻底变性的、由ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶直接匀浆制备的抗原、和电洗脱纯化使处于相对天然状态的抗原分别免疫兔，得到各为１：２５６０和１：１２８０的高效价抗血清Ａｎｔｉ５－７，为我国ＤＭＤ／ＢＭＤ蛋白诊断创造了条件。     

抗Dystrophin特异性抗血清Anti5—7的制备

应用作者自行制备的含ＤＭＤ基因中段缺失突变热点区ｃＤＮＡ片段的克隆菌株ＴＡＰ１０６，表达出ＤＭＤｃＤＮＡ５－７蛋白，作为抗原制备特异性抗血清，利用彻底变性的，由ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶直接匀浆制备的抗原，和电洗脱纯化使处于相对天然状态的抗原分别免疫兔，得到各为１：２５６０和１：１２８０的高效价抗血清Ａｎｔｉ５－７，为我国ＤＭＤ／ＢＭＤ蛋白诊断创造了条件。     

人细胞色素P4502B6的GST融合蛋白及其抗体的制备

目的：获得纯化抗原用于制备ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体方法：ＰＣＲ扩增目的基因片段,亚克隆入融合蛋白表达载体ＰＧＥＸ－３ｂ,构建了重组质粒ＰＧＥＸ／２Ｂ６。然后将该重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ分离,获纯化融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６。用ＧＳＴ－３Ｂ２免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,自腹水中获取ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体。结果：融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６（ＣＹＰ２Ｂ６２０２￣３５２ａａ）,并获     

人血小板／T细胞活化抗原PTA1／Ig融合蛋白表达载体的构建,表 …

目的；获得人血小板／Ｔ细胞活化抗原１（ｐｌａｔｅｌｅｔａｎｄＴｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ１，ＰＴＡ１）胞膜外区与人ＩｇＧ１Ｆｃ段融合蛋白。为ＰＴＡ１配体的鉴定及其功能的研究提供有力的工具，方法：针对ＰＴＡ１ｃＤＮＡ序列设计３段引物，通过反转录，半套式ＰＣＲ方法从活化Ｊｕｒｋａｔ细胞中扩增出ＰＴＡ１胞膜外区基因片段，并将其克隆入融合蛋白表达载体ｐＩＧ中，通过酶切，ＰＣＲ及序列测定鉴定     

单核细胞趋化蛋白－1在大肠杆菌中的表达

将人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，构建成质粒ｐＧＥＸ／ＭＣＰ转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经ＩＰＴＧ诱导后合成ＧＳＴ－ＭＣＰ－１融合蛋白。用１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测在３０ｋＤ左右有新生蛋白条带出现，表达量约占菌体总蛋白的３１．７％。趋化实验证明，该产物具备明确的单核细胞趋化活性。     

上海人群中TAP与IgA肾炎相关性的研究

目的探讨上海人群中抗原处理相关转运蛋白（ＴＡＰ）与ＩｇＡ肾炎的相关性。方法用ＰＣＲ－ＳＳＯ方法对上海地区８８名正常人及４０名ＩｇＡ肾炎患者ＴＡＰ进行分型。结果在病人组及对照组中共发现３种ＴＡＰ１（ＴＡＰ１Ａ、１Ｂ、１Ｃ）及４种ＴＡＰ２（ＴＡＰ２＊０１０１、＊０１０２、＊０２０１、＊０２０２）等位基因。未发现病人组与对照组之间ＴＡＰ等位基因分布的差异。结论本文结果未能证明ＴＡＰ基因与ＩｇＡ肾炎相关，但不排除未检测的多态位点与ＩｇＡ肾炎关联的可能性。     

人醛缩酶A单克隆抗体的制备及应用

纯化并鉴定了人醛缩酶Ａ、Ｂ、Ｃ（ｈＡＬＤ－Ａ、Ｂ、Ｃ）。用ｈＡＬＤ－Ａ免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，将免疫的脾细胞和Ｐ＿３－Ｘ＿（６３）－Ａｇ８．６５３骨髓瘤细胞用ＰＥＧ进行融合，用ＥＬＩＳＡ法筛选，ｈＡＬＤ－Ｂ、Ｃ作阴性对照，将阳性反应的杂交瘤细胞进行克隆，获得３株杂交瘤细胞株。其ＭｃＡｂ的亚类分别为ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ１、ＩｇＭ，亲合常数分别为７．５×１０￣（１０）、３．５×１０￣９、２．３×１０￣９。３株细胞株分泌的单抗通过Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ得到证实。用亲合层析法从人肝癌细胞中提纯了ＡＬＤ－Ａ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示为单一区带，但其电泳迁移率较ｈＡＬＤ－Ａ滞后。     

甲型肝炎病毒的纯化及其单抗的制备

应用不连续蔗糖／甘油密度梯度超速离心的方法，从培养细胞中纯化甲肝病毒（Ｈｅ－ｐａｔｉｔｉｓＡＶｉｒｕｓ，ＨＡＶ）。纯化的ＨＡＶ抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析，获得三条带：ＶＰ１（３４０００），ＶＰ２（３００００）和ＶＰ３（２６０００）。用纯化的ＨＡＶ抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，将已免疫小鼠的脾细胞与ＳＰ２／０细胞融合，获得６株分泌抗ＨＡＶ单克隆抗体的杂交瘤。它们的培养上清和腹水的抗体滴度分别是５０～１０００和１０００～４０００。Ｉｇ亚类５株为ＩｇＧ１，１株为ＩｇＧ２ａ。采用间接的ＥＬＩＳＡ法分析ＨＡＶ抗原的抗原位点，结果表明ＨＡＶ抗原至少存在４个抗原位点，两个存在于ＶＰ１蛋白带，另两个分别存在于ＶＰ２和ＶＰ３蛋白带     

单核细胞趋化蛋白—1在大肠杆菌中的表达

将人单核细胞趋化蛋白－１（ＭＣＰ－１）的ｃＤＮＡ插入融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１中，构建成质粒ｐＧＥＸ／ＭＣＰ转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经ＩＰＴＧ诱导后合成ＧＳＴ－ＭＣＰ－１融合蛋白。用１２％ＳＣＳ－ＰＡＧＥ检测在３０ｋＤ左右有新生蛋白条带出现，表达量约占菌体总蛋白的３１．７％，趋化实验证明，该产物具备明确的单核细胞趋化活性。     

抗人白细胞单克隆抗体的特异性及其特性鉴定

目的制备抗人白细胞单克隆抗体（ｍＡｂ），并对其识别抗原及组织的特异性进行鉴定。方法采用分离的人全白细胞悬液免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，取脾细胞与Ｓｐ２／０细胞常规融合，用间接ＥＬＩＳＡ筛选ｍＡｂ，流式细胞仪及免疫组化染色ＳＰ法鉴定其组织特异性。　结果成功地制备１株抗人白细胞　ｍＡｂ，命名为ＳＺ－１０５。ＥＬＩＳＡ法测定其腹水效价为１×１０－５。琼脂糖双扩散鉴定为ＩｇＧ１类。流式细胞仪间接免疫荧光技术及免疫组化ＳＰ法测定表明，ｍＡｂ　ＳＺ－１０５可选择性地与外周血液的粒细胞、单核细胞和淋巴细胞呈强阳性反应，而与红细胞及血小板不出现反应。该ｍＡｂ还可与正常人骨髓的白细胞前体起反应。另外，在肝、肺、脾、胸腺及淋巴结正常组织中的巨噬细胞表面，也有ＳＺ－１０５抗原表达。ＳＺ－１０５抗原经亲和层析纯化，再经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ证实，ｍＡｂ　ＳＺ－１０５识别的抗原是相对分子质量（Ｍｒ）为７５　０００左右的单链蛋白多肽。结论　获得１株具有高度免疫学活性和组织特异性的抗人白细胞ｍＡｂ　ＳＺ－１０５，其对研究白细胞的分化、免疫功能，以及隐匿性急、慢性炎症疾病的放免显像诊断都具有一定的临床意义。     

应用Protein G纯化细胞培养上清中的大鼠单抗

用ｍｉｎｉＰｅｒｍ系统旋转连续培养大鼠杂交瘤细胞株,获得大量含抗鼠ＩＬ－４（ＩｇＧ１）和ＩＬ－５（ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ）抗体的培养上清;经ＰＭ１０膜超滤,５０％饱和硫酸铵沉淀及链球菌Ｃ蛋白－琼脂糖亲和层析纯化ＩｇＧ单抗。结果每升杂交瘤细胞２上清得到大鼠,ＩｇＧ２２－３６ｍｇ;１次可纯化抗体２０ｍｇ;经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及ＥＬＩＳＡ鉴定,所得到的抗体纯度高,活性保持良好。     

金属螯合亲和层析法对人源宋内痢疾杆菌脂多糖抗独特型 …

在重组人穴内痢疾杆菌脂多糖抗型抗体重链可变区蛋白的表达质粒的氨基端插入６个组氨酸，合其对金属螯合层析介质能产生特异性吸附，可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化。本研究采用Ｎｉ－ＮＴＡ螯合层介质，以咪唑洗脱表达的蛋白。经ＥＬＩＳＡ检测，纯化的蛋白可特异地与抗宋内痢疾杆菌脂多糖的鼠ｍＡｂ ５Ｂ１２发生反应。     

白细胞介素6单克隆抗体的研制

采用纯化的工程菌表达产物白细胞介素６免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（ＳＰ２／０）在ＰＥＧ作用下进行融合,通过ＥＬＩＳＡ筛选并多次亚克隆,获得了１株能分泌抗ＩＬ－６单克隆抗体的杂交瘤细胞Ｉｃ－１．３．４．５。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示：抗体结合抗原的分子量与ＩＬ－６相符,为特异性抗ＩＬ－６抗体。亚类鉴定表明：该细胞分泌的单克隆抗体为ＩｇＧ１亚类,ｋａｐｐａ型。染色体数目为１００条左     

阴离子交换FPLC制备级纯化单克隆抗体

作者采用ＤＥＡＥ－４０ＨＲ阴离子交换柱。在快速蛋白液相色谱系统（ＦＰＬＣ）建立了ＩｇＧ类单克隆抗体制备级纯化方法。该法是将ＭｃＡｂ腹水经５０％饱和硫酸铵盐析粗分离后，再用阴离子交换色谱纯化，一次上样量相当于８０～１００ｍｌ腹水。可得纯化ＭｃＡｂ５００～６００ｍｇ，得率为６～７ｍｇ／ｍｌ腹水，回收率为５７～６７％．一次纯化周期仅需４５ｍｉｎ。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测ＭｃＡｂ纯度为９５％，ＡＢＣ染色法测定ＭｃＡｂ活性为１：２００００（３．１３×１０－１０ｍｏｌ／Ｌ）．     

小鼠IgG类单克隆抗体三种纯化方法的比较

分别采用辛酸一硫酸铵（ＣＡ－ＡＳ）法、硫酸铵沉淀法（ＡＳ）和ＤＥＡＥ离子交换层析法３种方法，对抗鸡Ｉｇ轻链的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）３Ｇ６进行了纯化效果的比较。结果表明，ＣＡ－ＡＳ法纯度为８３．１％，ＭｃＡｂ回收率为４６．５％；对ＭｃＡｂ活性无影响，制备的酶结合物效价达１．２８×１０－４，是一种可用于一般实验室纯化小鼠ＩｇＧ类ＭｃＡｂ的简便而有效的方法。ＡＳ法纯度最低为６０％，回收率为６３．６％，活性降低５０％。ＤＥＡＥ法纯度最高为１００％，但回收率只有１０％，活性无丧失，可用作电泳纯级样品的制备。