细菌16S rRNA基因芯片的构建及其在细菌鉴定中的应用

目的:构建细菌16S rRNA基因芯片,并将其应用于细菌检测.方法:根据细菌16S rRNA基因保守区设计合成针对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌的通用探针,以及针对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的特异性探针,并构建基因芯片.利用所构建的芯片检测相应细菌,并观察其特异性及敏感性.结果:成功构建了相应的基因芯片;所构建的基因芯片能准确检出相应细菌,无交叉阳性现象,检测时间约需6 h;所构建的基因芯片能检测出DNA含量为15 fg的大肠埃希菌基因组DNA.结论:细菌16S rRNA基因芯片可用于细菌的检测,具有良好的特异性及敏感性,且耗时少.     

基因芯片中60 mer寡核苷酸SARS冠状病毒探针的制备

目的用合成仪合成60 mer寡核苷酸SARS冠状病毒的探针来制作寡核苷酸基因芯片.方法根据寡核苷酸探针的制作要求,选取SARS冠状病毒的特异序列30条、长度为60 mer的片段进行合成,并对合成后的纯化方法与条件进行探索.将经12%变性PAGE胶纯化后的探针直接点样制备成12×12阵列的寡核苷酸的基因芯片,初步与处理后的临床样品进行杂交.结果经PAGE纯化的寡核苷酸探针的纯度高,能满足寡核苷酸芯片制备的要求.临床SARS患者标本进行处理后与寡核苷酸芯片杂交、扫描检测,效果较好.结论该室合成的60 mer的寡核苷酸SARS冠状病毒探针能用于基因芯片的制备与检测,这为该疾病的实验室诊断提供了一种快速、平行的检测方法.     

荧光标记寡核苷酸探针检测变形链球菌

【目的】建立应用荧光标记寡核苷酸探针BC73快速检测变形链球菌的方法。【方法】应用流式细胞仪检测荧光标记寡核苷酸探针EUB338和BC73与模式菌株和牙菌斑样品荧光原位杂交后的荧光强度和荧光计数。【结果】荧光标记寡核苷酸探针BC73与变形链球菌S．mutans，10449杂交的荧光强度7倍于S．mitis 15914和E.coli K12。变形链球菌占牙菌斑中细菌总数的1．7％。【结论】荧光标记寡核苷酸探针BC73能特异性检测牙菌斑中的变形链球菌数。     

荧光标记寡核苷酸探针检测变形链球菌

[目的]建立应用荧光标记寡核苷酸探针BC73快速检测变形链球菌的方法.[方法]应用流式细胞仪检测荧光标记寡核苷酸探针EUB338和BC73与模式菌株和牙菌斑样品荧光原位杂交后的荧光强度和荧光计数.[结果]荧光标记寡核苷酸探针BC73与变形链球菌S.mutans10449杂交的荧光强度7倍于S.mitis15914和E.coliK12.变形链球菌占牙菌斑中细菌总数的1.7%.[结论]荧光标记寡核苷酸探针BC73能特异性检测牙菌斑中的变形链球菌数.     

利用寡核苷酸芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变

目的:开发快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB寡核苷酸突变的基因芯片。方法:根据结核杆菌rpoB基因序列设计探针和引物并制备基因芯片,从临床痰标本中提取结核菌的基因组DNA,PCR扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段,荧光标记后与芯片上的特异性寡核苷酸探针进行杂交,同时与DNA测序法比较。结果:22株临床痰标本有18株可用寡核苷酸芯片检测出来,正确率可达82%;患者痰液中少量DNA足够进行芯片检测,无须细菌培养。结论:利用寡核苷酸芯片检测结核菌对利福平的耐药性具有较高的准确性和敏感性,可以应用于临床耐药性诊断。     

基因芯片制作中长片段（70mers）寡核苷酸探针的合成与纯化

研究长片段（70mers）的寡核苷酸探针的合成与纯化。采用固相亚磷酰胺法合成长70mers的寡核苷酸片段，并通过改进的实验装置进行PAGE纯化和分析。结果表明此法能快速、高产率的制备可直接用于点样、长度为70mers的寡核苷酸探针．纯化后探针纯度高，满足基因芯片检测的制作要求。     

黄热病病毒检测基因芯片的研究制备

目的制备黄热病病毒寡核苷酸检测芯片。方法根据黄热病病毒基因组序列,并应用生物信息学软件设计出22条寡核苷酸探针用于制备基因芯片。克隆于质粒上的黄热病病毒全长基因经限制性显示技术完成扩增并标记,杂交清洗后对芯片进行扫描和数据分析。结果大部分黄热病病毒寡核苷酸探针检测出阳性信号,阴性对照和空白对照检出阴性信号。结论基因芯片技术为黄热病病毒检测提供了一种早期、快速、可靠的方法。     

微生物检测基因芯片信号判读的杂交动力学分析

目的为了对微生物检测基因芯片杂交荧光信号进行有效判读。方法通过计算预测结合自由能的方法，充分考虑寡核苷酸探针和目标16S rRNA所有可能的碱基配对，分析计算杂交反应自由能与杂交荧光强度的关系。结果特异性与非特异性杂交反应自由能的差和两种杂交情况下荧光强度的比值具有较高的相关性。结论阳性对照辅助的多阈值微生物检测芯片信号判读系统是可实现的。     

乙型脑炎病毒与黄热病病毒联合诊断基因芯片的初步实验研究

目的制备乙型脑炎病毒（JEV）与黄热病病毒（YFV）联合诊断基因芯片。方法基于早期实验室研究挑选出28条寡核苷酸探针制备检测芯片。克隆于质粒上的乙型脑炎病毒和黄热病病毒基因片段用于检测探针特异性，经限制性显示技术扩增并标记，与芯片杂交后完成扫描和数据分析。结果JEV、YFV探针与相应的荧光标记样本杂交后，均能检测出阳性荧光信号，而空白对照则检出阴性信号。结论基因芯片技术为病毒检测提供了一种早期、可靠的方法，具有应用于多病毒临床鉴别诊断的前景。     

梅毒螺旋体寡核苷酸芯片探针的设计及筛选

【目的】设计梅毒螺旋体寡核苷酸探针,筛选出适合芯片检测的高敏感性和特异性寡核苷酸探针。【方法】根据梅毒螺旋体特异基因设计寡核苷酸探针,人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。提取梅毒螺旋体的DNA,采用通用引物联合标记法进行标记,标记样品与芯片杂交,用芯片扫描仪检测杂交结果。【结果】设计出23条50 mer梅毒螺旋体寡核苷酸探针。标记样品与芯片杂交部分探针有较强的杂交信号,并筛选出符合要求的9条梅毒螺旋体寡核苷酸探针。【结论】以上方法能设计和筛选出敏感性和特异性较高的梅毒螺旋体寡核苷酸探针,可用于制备梅毒螺旋体寡核苷酸芯片。     

应用聚合酶链反应-膜芯片技术快速鉴定分支杆菌菌种

目的建立一种简便、快速、灵敏、特异的分支杆菌菌种鉴定方法。方法通过 1 6SrDNA聚合酶链反应 单链构象多态性 (polymerasechainreaction singlestrandedconformationpolymorphism ,PCR SSCP)分析鉴定 1 4 0株分支杆菌临床分离株 ;设计与合成用于鉴定分支杆菌菌种的 1 6SrDNA寡核苷酸探针 ,制作膜芯片 ,与待测菌株生物素标记的 1 6SrDNA基因PCR产物进行反向斑点杂交。结果 1 4 0株分支杆菌临床分离株中 ,经 1 6SrDNAPCR SSCP初步鉴定 ,1 33株为结核分支杆菌复合群 ,7株为非结核分支杆菌。经膜芯片杂交分析 ,1 33株结核分支杆菌分离株鉴定为结核分支杆菌复合群 ;7株非结核分支杆菌中 ,1株鉴定为戈登分支杆菌 ,1株为土分支杆菌 ,1株为偶发分支杆菌 ,1株为胞内分支杆菌 ,另 3株与分析探针杂交阴性。分析 2 8种分支杆菌标准菌株和 9种非分支杆菌菌株 ,结果显示寡核苷酸探针是特异的。结论 1 6SrDNAPCR 膜芯片技术灵敏度高、特异性强、简便、快速 ,可用于鉴定分支杆菌菌种     

The detection of HBV DNA with gold nanoparticle gene probes

Objective:Gold nanoparticle Hepatitis B virus (HBV) DNA probes were prepared, and their application for HBV DNA measurement was studied. Methods:Alkanethiol modified oligonucleotide was bound with self-made Au nanoparticles to form nanoparticle HBV DNA gene probes, through covalent binding of Au-S. By using a fluorescence-based method, the number of thiol-derivatized, single-stranded oligonucleotides and their hybridization efficiency with complementary oligonucleotides in solution was determined. With the aid of Au nanoparticle-supported mercapto-modified oligonucleotides serving as detection probes, and oligonucleotides immobilized on a nylon membrane surface acting as capturing probes,HBV DNA was detected visually by sandwich hybridization based on highly sensitive aggregation and silver staining. The modified nanoparticle HBV DNA gene probes were also used to detect the HBV DNA extracted from serum in patients with hepatitis B. Results:Compared with bare Au nanoparticles, oligonucleotide modified nanoparticles had a higher stability in NaCl solution or under high temperature environment and the absorbance peak of modified Au nanoparticles shifted from 520nm to 524nm. For Au nanoparticles, the maximal oligonucleotide surface coverage of hexaethiol 30-mer oligonucleotide was (132 ± 10) oligonucleotides per nanoparticle, and the percentage of hybridization strands on nanoparticles was (22 ± 3% ). Based on a two-probe sandwich hybridization/nanoparticle amplification/silver staining enhancement method, Au nanoparticle gene probes could detect as low as 10-11 mol/L composite HBV DNA molecules on a nylon membrane and the PCR products of HBV DNA visually. As made evident by transmission electron microscopy, the nanoparticles assembled into large network aggregates when nanoparticle HBV DNA gene probes were applied to detect HBV DNA molecules in liquid. Conclusion:Our results showed that successfully prepared Au nanoparticle HBV DNA gene probes could be used to detect HBV DNA directly. The detection-visuallized method has many advantages, including high sensitivity,simple operation and low cost. This technique has potential applications in many fields, especially in multi-gene detection chips.     

Rb2/p130寡核苷酸基因芯片的制备及肺癌手术标本的检测

目的：用基因芯片方法检测肺癌标本中Rb2/p130基因的点突变情况,为肺癌诊断探索快速、准确的基因检测途径。方法：收集肺癌患者的手术标本,提取基因组DNA,检索Rb2/p130基因的DNA序列后,设计并合成探针和引物序列,将探针按一定顺序点样于醛基化玻片,制备成基因芯片。用荧光标记引物对肺癌标本DNA进行PCR扩增,扩增产物与基因芯片杂交,通过对杂交信号的检测判断是否发生热点突变,并用测序方法对突变位点进行验证。结果：在30例用寡核苷酸基因芯片的方法检测的肺癌标本中,Rb2/p130基因突变的检出率为16.67%,其中肺腺癌的突变率为20%（4/20）,肺鳞癌的突变率16.67%（1/6）;在检测过程中发现PCR产物浓度和杂交温度是影响结果的关键因素,对突变位点的测序证实了基因芯片的结果。结论：基因芯片法检测出中国人肺癌组织标本存在Rb2/p130基因突变,但突变率（16.67%）低于西方人（78.5%）。未能检测全部突变位点、标本量小和人种差异可能是低突变率的原因。     

PCR法检测细菌23S rDNA在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的　研究建立快速检测细菌DNA的方法。方法　设计一对共同引物 ,应用聚合酶链反应 (PCR)法 ,扩增细菌核糖体 2 3S亚单位基因 2 3SrDNA。对 2 3种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用该方法进行检测 ,并与常规细菌培养法比较。结果　该方法可检测细菌下限为 2 5CFU ,与真菌、乙肝病毒等无交叉反应。对纯菌及培养物均可检出一条明显DNA条带 ,革兰阴性细菌约 35 0bp ,革兰阳性细菌约 4 0 0bp。临床标本 2 3SrDNA检出率明显高于常规培养方法 (P <0 0 1)。结论　应用所设计的共同引物 ,检测细菌 2 3SrDNA ,敏感性和特异性好 ,比常规培养法快速、准确。     

探针的纯化与否对基因芯片重复利用的影响

目的 观察探针的纯度对基因芯片重复利用的影响。方法 将探针为未纯化、纯化两部分并分别与基因芯片杂交，扫描芯片后，用探针剥脱液洗涤芯片；同等条件成像后，进行下一轮杂交。结果 未纯化的探针杂交结果背景高，阳性信号界限不清楚；经探针剥脱洗涤后，仍留有较高强度的背景和原与靶基因片段杂交的阳性信号，即使洗脱4次后，仍有背景和阳性信号存在。纯化的探针杂交结果显示背景低，一般经2次探针剥脱液洗后，可以完全去除信号并进行下一轮杂交。结论 未纯化的探针与基因芯片杂交后，此芯片不能应用于下一轮的杂交；而纯化的探针杂交后，芯片可以再次利用。由此说明探针的纯化是基因芯片重复利用的前提条件。     

应用寡核苷酸探针阵列法快速鉴定临床分离株中的分支杆菌

目的:建立一种简便、快速、灵敏、特异的分支杆菌菌种鉴定方法。方法:通过16S rRNA聚合酶链反应(polym erase chain reaction,PCR)-单链构象多态性(single-stranded conform ation polymorph ism,SSCP)分析鉴定253株分支杆菌临床分离株;应用16S rRNA PCR-寡核苷酸探针与待测菌株生物素标记的16S rRNA基因PCR产物进行反向斑点杂交。结果:分析28种分支杆菌标准菌株和9种非分支杆菌菌株,结果显示寡核苷酸探针是特异的。253株分支杆菌临床分离株,198株为结核分支杆菌复合群,55株为非结核分支杆菌。经寡核苷酸探针阵列法分析,198株结核分支杆菌分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,36株鉴定为非结核分支杆菌,分别与相对应的特异探针杂交,另19株与分析探针杂交阴性。结论:16S rRNA PCR-寡核苷酸探针阵列法灵敏度高、特异性强、简便、快速,可用于鉴定临床分离株分支杆菌菌种。     

寡核苷酸芯片检测肺癌患者痰标本中p53点突变

目的：用寡核苷酸基因芯片方法检测肺癌患者痰标本中p53基因的热点突变,为肺癌的诊断探索快速、准确的基因检测途径。方法：收集肺癌患者痰标本并提取基因组DNA,用荧光标记的引物对DNA进行p53基因Exon5、Exon7PCR扩增,然后用PCR扩增产物与基因芯片进行杂交,通过对杂交信号的检测,判断是否发生点突变,并用测序方法对部分阳性结果进行验证。结果：在27例肺癌患者痰标本中,p53基因突变的检出率为25．92％,其中小细胞肺癌的突变率为40％（2／5）、肺鳞癌的突变率为26．6％（4／15）、肺腺癌的突变率为14．28％（1／7）,检测到的突变位点有175（2）、248（1）、249（2）,对2例阳性标本的测序证实了基因芯片的结果。结论：寡核苷酸基因芯片法可以快速、准确检测出肺癌患者痰标本中p53基因的点突变,今后可用该法对肺癌患者和高危人群的痰标本进行大规模筛选,提高肺癌的早期诊断率。     

HIV基因芯片的初步研究

目的：建立HIV基因检测芯片的分析技术，方法：分离HIV 1U26942基因限制性显示片段作探针，应用PixSys 5500点样仪将探针打印在氨基包被的玻片上制作基因芯片，然后与随机引物荧光标记的HIV样品进行杂交，以分析限制性显示基因片段的杂交动力学，经杂交后清洗和干燥，扫描芯片进行检测。结果：对基因检测芯片的制作与检测的实验条件进行了初步研究并筛选了12个限制性显示基因探针。结论：建立的检测芯片的实验方法可行且较特异。     

HIV基因芯片的初步研究

目的建立HIV基因检测芯片的分析技术。方法分离HIV1U26942基因限制性显示片段作探针,应用PixSys 5500点样仪将探针打印在氨基包被的玻片上制作基因芯片。然后与随机引物荧光标记的HIV样品进行杂交,以分析限制性显示基因片段的杂交动力学。经杂交后清洗和干燥,扫描芯片进行检测。结果对基因检测芯片的制作与检测的实验条件进行了初步研究并筛选了12个限制性显示基因探针。结论建立的检测芯片的实验方法可行且较特异。