重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质研究

目的 分析重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质。方法 重组尿素酶B亚单位注射免疫BALB／c小鼠、家兔，双向琼脂扩散、ELISA、免疫印迹分析特异抗体的产生及性质。结果 重组尿素酶B亚单位能有效刺激机体的免疫应答，且产生的抗体能与天然幽门螺杆菌发生抗原抗体反应。结论 重组尿素酶B亚单位表现出天然幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的免疫学性质，提示可作为幽门螺杆菌特异性抗体检测的包被抗原及幽门螺杆菌疫苗的有效成分。     

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及其生物学性质

目的基因重组人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)并分析重组蛋白的生物学性质。方法采用PCR从我国临床分离的Hp菌株中克隆UreB基因,并通过DNA重组技术构建非融合表达UreB的重组质粒pET-11C-UreB,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。结果重组UreB在大肠杆菌中表达,相对分子质量约62 000,表达率26%,N端15个氨基酸序列为MKKISRKEYVSMYGP,肽图及氨基酸组成成分分析结果与理论预测值吻合。以重组UreB免疫BalB/c小鼠,能产生抗UreB抗体。ELISA及Western blotting分析显示,重组UreB具有良好的免疫原性和反应性,表现出与天然Hp UreB相似的生物学功能。结论为重组UreB作为Hp亚单位疫苗成分奠定了免疫学基础。     

重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位及其生物学性质

目的 基因重组人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)并分析重组蛋白的生物学性质。方法 采用PCR从我国临床分离的Hp菌株中克隆UreB基因，并通过DNA重组技术构建非融合表达UreB的重组质粒pET-11C-UreB，转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达。结果 重组UreB在大肠杆菌中表达，相对分子质量约62000，表达率26％。N端15个氨基酸序列为MKKISRKEYVSMYGP，肽图及氨基酸组成成分分析结果与理论预测值吻合。以重组UreB免疫BalB／c小鼠，能产生抗UreB抗体。ELISA及Western blotting分析显示，重组UreB具有良好的免疫原性和反应性，表现出与天然Hp UrcB相似的生物学功能。结论 为重组UreB作为Hp亚单位疫苗成分奠定了免疫学基础。     

幽门螺杆菌基因重组尿素酶亚单位免疫预防作用的实验研究

目的 评价幽门螺杆菌（Ｈｐ）基因重组尿素酶Ａ、Ｂ亚单位（ｒＵｒｅＡ、ｒＵｒｅＢ）的免疫预防作用。方法 将ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠分为如下７组：阴性对照组（１０只）、霍乱毒素Ｂ亚单位（ＣＴＢ）对照组（１０只）、ｒＵｒｅＡ对照组（１０只）、ｒＵｒｅＢ对照组（１０只）、ｒＵｒｅＡ＋ＣＴＢ实验组（３０只）、ｒＵｒｅＢ＋ＣＴＢ实验组（３０只）、Ｈｐ超声粉碎物＋ＣＴＢ实验组（３０只）,胃内分别接种如下物质：１５０ｍｌ     

过氧化氢酶和尿素酶B亚单位二价疫苗预防小鼠幽门螺杆菌感染

目的 利用人类幽门螺杆菌(H.priori)感染的小鼠模型研究过氧化氢酶和尿素酶B亚单位二价疫苗预防H.pylori感染的作用.方法 把实验动物无特定致病菌C57BL/6小鼠分成7组,分别通过灌胃方法给予过氧化氢酶和尿素酶B亚单位(各100μg)加霍乱毒素(CT)(2 μg)、过氧化氢酶(100 μg)加CT(2 μg)、尿素酶B亚单位(100 μg)加CT(2 μg)、PBS、单纯过氧化氢酶(100μg)、单纯尿素酶B亚单位(100μg)、单纯CT(2μg),共4次.2周后再用活H.pylori灌胃,再4周后处死动物.取胃粘膜行半定量细菌培养检查H. pytori情况.结果 实验各组H.pylori完全保护率分别为:过氧化氢酶和尿素酶B亚单位加CT组83.3%(20/24)、过氧化氢酶加CT组41.7%(10/24)、尿素酶B亚单位加CT组54.2%(13/24);生理盐水组、单纯过氧化氢酶、单纯尿素酶B亚单位、单纯CT组根除率均为0%.未完全保护的小鼠,疫苗组H. pylori的定植密度明显低于其它4组(P<0.05).此外,二价疫苗组的H. pylori完全保护率及定植密度较单价疫苗组均有显著性差异(P<0.05).结论 由过氧化氢酶和尿素酶B亚单位加免疫佐剂组成的二价口服疫苗较单价口服疫苗有更好的免疫预防效果.     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位优势Th表位的系统筛选与鉴定

目的 筛选幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)中CD4+细胞优势应答表位,并确定其MHC限制性.方法 以重组UreB蛋白(rUreB)与弗氏佐剂联合皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,从小鼠脾脏中体外扩增UreB特异性T淋巴细胞,采用步移重叠合成肽法筛选CD4+T细胞优势应答表位,分析其MHC分子限制性.结果 18mer短肽筛选发现UreB403-420和UreB409-426可显著刺激UreB特异性CD4+T细胞产生IFN-γ.13mer短肽鉴定实验结果显示,UreB409-421可刺激产生与18mer短肽UreB403 420和UreB409-426等同的应答强度.同时抗体阻断实验表明,抗H-2d (I-A)单克隆抗体能有效阻断该表位的应答.结论 UreB403-420和UreB409-426为UreB抗原中的优势Th表位,其刺激免疫反应的核心位置为UreB409-421,且存在H-2d(I-A)限制性.     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位功能片段的纯化及活性研究

目的 建立一种有效的尿素酶功能片段的纯化方法.方法 应用已构建的尿素酶B功能片段表达载体,IPTG诱导表达,包涵体鉴定试验判断目的蛋白表达形式,AKTA100上分别采用亲和层析和离子层析等多级纯化方式优化纯化条件,HPLC检测纯化蛋白纯度,尿素酶活性阻断试验对纯化后功能片段进行活性鉴定.结果 IPTG诱导后目的蛋白高表达,包涵体鉴定试验证实目的蛋白以可溶形式存在宿主细胞中,优化后方案得到目的蛋白纯度＞90%且能被尿素酶B免疫的兔血清识别,纯化后蛋白免疫家兔后产生兔抗血清能够特异性中和Hp尿素酶活性.结论 成功建立了尿素酶功能片段的纯化方法.     

BALB/c小鼠口服重组幽门螺杆菌热休克蛋白A疫苗的免疫应答

目的评价重组热休克蛋白A(rHspA)作为幽门螺杆菌(Hp)口服疫苗成分的效果.方法采用重组Hp保护性抗原HspA与粘膜免疫佐剂(霍乱毒素,CT;大肠不耐热肠毒素B亚单位,LTB)共口服免疫BALB/c小鼠,ELISA分析小鼠血清、胃肠粘液中IgA、IgA抗体水平,体外培养脾淋巴细胞在Hp刺激下的增殖情况以及IL4、IFN-γ的变化.结果单纯口服rHspA组产生的抗体水平与对照组(PBS)相差不显著,而rHspA 佐剂组与对照组相差非常显著.rHspA 佐剂组小鼠脾淋巴细胞体外培养,在Hp抗原刺激作用下出现明显的增殖反应;不加佐剂免疫组分泌IFN-γ水平增加,IL-4水平未发现增加;而加佐剂免疫组除IFN-γ水平增加外,IL-4水平也发现显著增加.结论BALB/c小鼠口服rHspA和CT以及LTB混合制剂能有效激发机体产生全身和局部特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位功能片段构建及免疫原性研究

目的 构建表达免疫活性的尿素酶功能片段原核表达体系.方法 根据尿素酶B基因序列以及文献报道的尿素酶活性中心区域,primer5.0设计相应的引物,以Hp基因组为模版,PCR扩增拟表达的尿素酶活性片段,经测序证实后将片段亚克隆于原核表达载体pET28中,转入宿主茵BL21后IPTG诱导表达后,Tris-Tricine PAGE电泳及抗Hp特异性抗体western-tbollting鉴定目的蛋白表达.结果 PCR从Hp基因组中扩增出414bp目的片段,经酶切及测序证实构建了功能片段表达阳性重组子,命名为pU414,IPTG诱导后电泳分析可以发现相应分子量附近出现可疑目的蛋白,能够被特异性血清识别.结论 成功建立尿素酶活性功能片段蛋白表达载体,为下一步实验研究奠定基础.     

幽门螺杆菌超声处理菌液口服免疫BALB/c小鼠的实验研究

目的 从细胞和分子水平探讨小鼠口服免疫幽门螺杆菌超声处理菌液后的粘膜免疫应答。方法 Hp菌超声上清各粘膜佐剂大肠杆菌不耐热肠毒素（LT）口服免疫小鼠，ELISPOT分析胃粘膜、派伊尔结（Payer's patch PP）抗原特异性抗体分泌细胞（ASC）、RT－PCR分析肠粘膜免疫主要诱导部位PP T细胞因子mRNA表达水平。结果 ①结合佐剂口服免疫可诱导胃粘膜、PP大量抗原特异性抗体分泌细胞（ASC），尤以sIgA-ASC型居多。②单纯抗原免疫小鼠PP T细胞，早期高表达IL－4，晚期高表达IFN－γ。③抗原＋LT免疫小鼠PP T细胞，早期高表达IFN－γ，晚期高表达IL－4。结论 单纯抗原口服免疫诱导的抗体分泌细胞数量尤其是sIgA型明显低于联合应用佐剂组，PP体外抗原刺激后先表现为Th2型优势应答，后转为Th1型优势应答，而结合LT免疫，PP则先表现为Th1型优势应答，后转为Th2型优势应答。     

幽门螺杆菌UreB核酸疫苗的构建

目的:构建含幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)基因的核酸疫苗.方法:抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用PCR技术从基因组DNA扩增UreB基因,克隆入PUCmT载体,检测UreB基因序列.经过一系列酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应进行鉴定.通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES-UreB转染COS-7细胞,Western印迹分析检测pIRES-UreB表达UreB蛋白的免疫原性.结果:扩增出长约1 700 bp的UreB基因,与基因库Hp UreB序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实成功构建了含UreB基因的Hp核酸疫苗pIRES-UreB,并且Western 印迹分析检测到特异性的蛋白条带.结论:构建了具有免疫反应性UreB基因的Hp核酸疫苗,为进一步探索其免疫作用奠定了基础.     

Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimurium expressing Helicobacter pylori urease B subunit

Objective To establish attenuated Salmonella typhimurium producing Helicobacter pylori (H. pylori) urease subunit B （UreB） and determine whether it could be used as an oral vaccine against H. pylori. Methods H. pylori (SS1 strain) UreB gene fragment amplified by PCR was cloned into the prokaryotic expression vector pTC01 after sequencing, and then transformed into attenuated Salmonella typhimurium SL3261 to acquire SL3261/pTC01- UreB. The expression of H. pylori UreB in SL3261 was detected by Western blot. Twelve weeks after oral immunization of mice,antibody responses were evaluated using serum and intestinal fluid by ELISA assay. Interferon- γ （IFN- γ） and interleukin- 10 （IL- 10） in the supernatant of spleen cells culture were also assessed by ELISA. In vitro stability of pTC01- UreB plasmid in SL3261 was confirmed by growing in Luria Broth (LB) medium to 80 generations.Results The UreB gene fragment amplified by PCR was consistent with the sequence of the H. pylori UreB as evidenced by sequence analysis. Enzyme digestion revealed that the correct pTC01- UreB was obtained. Western blot showed that a 61kDa protein was expressed in SL3261/pTC01- UreB, which could be recognized by anti- H. pylori UreB antiserum. After 80 generations of continuous culture, the recombinant plasmid pTC01- UreB was stable in SL3261 and had no obvious toxicity. Multiple oral immunizations with SL3261/pTC01- UreB could significantly induce H. pylori- specific mucosal IgA response as well as serum IgG response. Moreover, there were significant increases of IFN- γand IL- 10 in the SL3261/pTC01- UreB group. Finally, no obvious side effects for mice and no change in gastric inflammation were observed.Conclusion Attenuated Salmonella typhimurium expressing H. pylori UreB may be used as oral vaccine against H. pylori infection.     

Immune responses in mice to oral administration of attenuated Salmonella typhimurium expressing Helicobacter pylori urease B subunit by a lavage technique

Objective： To determine whether attenuated Salmonella typhimurium producing Helicobacter pylori （Hp） urease subunit B（UreB）can elicit specific immune responses against Hp in mice tested by a lavage technique. Methods： Attenuated Salmonella typhimurium producing Hp UreB immunized orally Balb/c mice twice at a 3-week interval. After 12 weeks, mice intestinal secretions were obtained without harm by administering a lavage solution intragastrically. The mice intestinal secretions of immune group were also directly washed out after the mice were killed. The antibody responses were evaluated by using serum and intestinal fluid with ELISA assay. Results： The multiple oral immunizations with SL3261/pTC01-UreB induced significantly Hp-specific mucosal IgA response as well as serum IgG response. The IgA was also consistently higher in the intestinal fluid obtained by the lavage solution than by direct washout. In addition, no obvious side effects and changes in gastric inflammation were observed in mice. Conclusion： The attenuated Salmonella typhimurium expressing Hp UreB may be used as an oral vaccine against Hp infection. And the lavage technique is an ideal method in the study of mucosal immune responses.     

幽门螺杆菌尿素酶减毒鼠伤寒杆菌疫苗诱导小鼠粘膜免疫应答的研究

目的:观察口服减毒鼠伤寒杆菌活菌重组疫苗后小鼠的粘膜免疫应答状况。方法:将已构建成功的表达幽门螺杆菌(H.pylori)尿素酶B亚单位(UreB)的重组减毒鼠伤寒杆菌SL3261/pTC01-UreB口服免疫Balb/c小鼠,12周后检测肠液和血清中的特异性抗体反应。结果:疫苗组小鼠的肠液和血清中可分别检测到针对UreB的特异性抗体IgA和IgG,病理学检查显示疫苗组小鼠较对照组小鼠胃粘膜炎症程度差异无统计学意义。结论:表达H.pyloriUreB的减毒鼠伤寒杆菌SL3261/pTC01-UreB能够诱导小鼠产生抗H.pylori的粘膜免疫,可用作抗H.pylori感染的口服疫苗。     

Cloning of the Gene Encoding Urease Subunit.A in Helicobacter Pylori

Themostefficient ,economicalapproachwithlowriskofadversereactiontothepreventionandcon trolofHelicobacterpylori (H .pylori)infectionistousevaccine .UreaseanditssubunitAisproventobethemainvaccineagainsttheinfectionofH .pylori.Inordertoexpresstheureasesubuni…     

CpG基序对幽门螺杆菌疫苗的免疫佐剂效应实验研究

目的　探讨CpG在幽门螺杆菌疫苗研究中的佐剂效应。方法　将 60只BALB c小鼠分为 4组 ,分别以H .pylori尿素酶B亚单位 (rUreB) CPG、rUreB CT、单独UreB以及PBS进行口服免疫 ,ELISA检测胃、肠、气管冲洗液sIgA以及血清IgG亚类 (IgG1,IgG2a) ,RT PCR差异显示T淋巴细胞IFN γ、IL 4mRNA。结果　①CpG rUreB组在胃、肠、气管和血清产特异性抗体水平显著高于PBS组和单独rUreB组 (P <0 0 1) ,与CT UreBs组差异不显著 (P >0 0 5 ) ;②抗原刺激后CpG rUreB组T淋巴细胞表达的IFN γ、IL 4mRNA显著高于PBS组和rUreB组。结论　①CpG可能是H .pylori疫苗研究中有效的粘膜佐剂 ;②CpG rUreB组诱导的可能是Th1 Th2型免疫应答。