以绿色荧光蛋白为报告基因的环境砷离子生物检测体系的构建

目的 建立环境中砷的生物检测方法.方法 根据GenBank中已发表的革兰阳性菌中参与砷抗性机制的操纵子序列R46 ars,人工合成arsR全部序列(含小部分arsD基因序列)及其上游的启动子序列,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,构建含砷离子特异性诱导启动子表达载体pET28a(+)-ars-gfp,并采用感受态转化法将该重组表达载体转化入大肠埃希菌表达宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)中,构建砷离子检测菌株,并进行PCR和酶切鉴定.结果 通过PCR和酶切鉴定,表明重组表达载体成功构建并转化入大肠杆菌E.coli BL21 (DE3),绿色荧光蛋白报告基因在有砷离子(0.2～1.0μmol/L)存在的环境中得到表达.结论 该菌株适用于环境中砷的生物检测.     

A型流感病毒NP基因的克隆表达与鉴定

目的 构建人A型流感病毒NP基因原核重组表达载体并在E.coli BL21(DE3)中表达.方法 从流感患者咽分泌物中提取总RNA,设计特异性引物,经RT-PCR得到NP基因开放阅读框cDNA后定向克隆到原核表达载体pET28b(+),构建含目的 基因的pET28b(+)-NP重组质粒,经酶切、PCR和测序正确后转化E.coli BL21(DE3),0.1mmol/L IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 ①成功构建了pET28b(+)-NP重组质粒;②在E.coli BL21(DE3)中表达了一分子量约55 kDa的融合蛋白,经Western blot鉴定正确.结论 重组质粒pET 28b(+)-NP构建成功并在E.coli BL21(DE3)中高效表达了人A型流感病毒NP蛋白,为后续该蛋白的功能研究奠定了基础.     

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒非结构蛋白NSs的原核表达及初步鉴定

目的克隆、表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)非结构蛋白NSs,对其功能初步鉴定。方法采用PCR法扩增经密码子优化后的SFTSV NSs基因,并克隆至PGEX-4T-2载体中,构建原核表达载体PGEX-4T-2-NSs,经酶切、测序鉴定后转化表达菌BL21(DE3),再经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NSs融合蛋白,用Western Blot验证融合蛋白GST-NSs的抗原性。结果成功构建了GST-NSs融合蛋白原核表达载体,并在BL21细菌中获得高效表达;纯化后的融合蛋白具有良好的抗原性。结论实现了SFTSV重组NSs蛋白的原核高效表达,为进一步深入研究其结构与功能奠定了基础。     

重组结核杆菌分泌融合蛋白活性鉴定及应用

目的研究融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10免疫学特性.方法将一个柔性的氨基酸接头插入原核表达载体pET32c（＋）中,构建pET32c（＋）-linker.PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因.将CFP10克隆入改建的载体pET32c（＋）的linker前,ESAT-6克隆入linker后,构建CFP10-ESAT-6融合基因;或将ESAT-6克隆入改建载体pET32c（＋）的linker前,CFP10克隆入linker后,构建ESAT-6-CFP10融合基因,分别转化大肠埃希菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠埃希菌BL21中表达,通过Western blot分析其抗原性.结果 2个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c（＋）的linker前或后.重组质粒pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致.融合蛋白在BL21菌中高效表达.Western blot分析表明,融合蛋白与活性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应.结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒;pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白,该蛋白兼具CFP10和ESAT-6两种蛋白的抗原性.     

蛋白磷酸酶LY1基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的构建蛋白磷酸酶LY1基因的原核表达载体,并在E.coliBL21（DE3）中表达。方法PCR扩增LY1的CDs基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中构建重组质粒pET28a（＋）-LY1。经限制性内切酶Nhe I、XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。SDS-PAGE、Western blot方法检测重组蛋白的表达。结果获得全长为1179bp的LY1基因片段,以构建的重组质粒pET28a（＋）-LY1转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导,表达出分子量约为42kD的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21（DE3）的胞质中。Western blot方法检测出LY1融合蛋白的表达。结论成功构建了原核表达载体pET28a（＋）-LY1,并表达出重组LY1蛋白,为进一步单克隆抗体的制备和生物信号转导的相关研究奠定了实验基础。     

小鼠Cdc25B融合蛋白构建和表达

目的研究小鼠N末端缺失286氨基酸的野生型Cdc25B原核表达载体的构建和表达。方法应用Primer5．0软件分析并设计小鼠Cdc2585’及3’端引物（N末端缺失286氨基酶），化学合成并用聚合酶链反就（PCR）方法扩增，经限制性内切酶酶切后连接原核表达载体PGEX4T．2，构建成PGEX4T-2-Cdc25B融合表达载体，转化大肠埃希菌BL21后，通过异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导进行目的蛋白表达。结果通过双酶切、电泳分析及测序证明成功构建了Cdc25B融合表达载体，融合蛋白产物经蛋白印迹（Westem blot）显示，相对分子量为53KD的蛋白谱带，与预期一致。结论成功构建并表达了Cdc25B-N末端缺失的基因，并在原核细胞中获得较高水平的表达，为近一步研究Cdc25B的功能提供基础依据。     

HSV-1 UL18基因重组载体的构建及其编码蛋白VP23的表达

目的:构建含有单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的原核表达载体。方法:先将UL18基因进行全序列PCR扩增,再将PCR产物克隆进pET-28a(+)质粒,最后将重组质粒转化进入原核表达系统E.coli BL21(DE3)中表达出带有6个组氨酸标签的重组VP23蛋白。结果:UL18基因正确重组进pET-28a(+)质粒,并在E.coli BL21(DE3)中表达。结论:成功构建单纯疱疹病毒1型(HSV-1)UL18基因的重组载体,并在原核表达系统表达出其编码的衣壳蛋白VP23且带有组氨酸标签,为进一步优化VP23在发酵中的最佳表达条件,纯化并大量制备VP23,以及制备VP23的多克隆抗体奠定了基础。     

空肠弯曲菌peblA基因的克隆表达及免疫性鉴定

目的：克隆空肠弯曲菌peblA基因，构建其原核表达载体；鉴定重组表达产物的免疫原性。方法：PCR扩增空肠弯曲菌peblA基因，构建pET-28a（＋）-peblA表达载体。转化E coli BL21（DE3）后诱导表达，用SDS—PAGE鉴定表达产物。采用Ni—NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白PEBl。采用CJ全菌抗体的Western blot鉴定rPEBl免疫反应性，双向免疫扩散试验鉴定rPEBl免疫家兔的抗血清效价。结果：所克隆的基因与报道的核苷酸序列同源性为99．9％，转化E coli BL21（DE3）后，表达产物最高表达量占全菌总蛋白的33％左右，纯化后获得纯度为96％的重组蛋白。Western blot证实rPEBl能与CJ全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rPEBl血清的双向免疫扩散效价为1：16。结论：成功地构建了高效表达载体pET-28a（＋）-peblA，并获得rPEBl，所表达的rPEBl具有良好的免疫原性和免疫反应性，为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

利用大肠埃希菌分泌表达乙型肝炎病毒核心抗原

目的:研究乙型肝炎病毒核心(C)基因在大肠埃希菌(E.coli)中的表达,以期获得分泌表达的具有良好免疫反应性和特异性的HBcAg。方法:构建重组质粒pET-3c-cAg、pET-30a-cAg、pGEX-4T-1-cAg,转入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达HBcAg。SDS-PAGE、ELISA和Western blot对表达产物进行分析。结果:限制性内切酶酶切和DNA序列分析证实HBV C基因正确克隆到E.coli各表达载体中。ELISA和Western blot分析表明,以pET-3c和pET-30a为表达载体能在E.coli分泌表达HBcAg,而以pGEX-4T-1为载体只能胞内表达,其中以pET-3c为载体的分泌表达量最高,培养上清中其效价为1∶128;用分泌表达的HBcAg作为诊断抗原检测抗-HBc阴阳性血清及国家参考品,符合率为100%。结论:成功获得HBcAg在E.coli的分泌表达,且其具有较高的特异性和免疫反应性。     

人卵GST-ZP3融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫原性的检测

目的:在大肠杆菌中表达人卵透明带3(Human zona pellucida3,HuZP3)蛋白并对其进行纯化。方法:将HuZP3基因的核心片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,经过酶切和序列分析后,用重组质粒转化E.coli BL21,经IPTG诱导产生GST-HuZP3融合蛋白并通过Glutathione Sepharose 4B纯化。以纯化的融合蛋白免疫纯系Balb/C小鼠制备抗血清。抗血清的效价采用ELISA检测。结果:成功地构建GST-HuZP3融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中高效表达特异性的GST-HuZP3融合蛋白。以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价抗GST-HuZP3抗血清,且该抗血清可识别大肠杆菌表达的重组ZP3。结论:获得高表达的GST-HuZP3融合蛋白并证实其具有良好的免疫原性,可作为抗原研制开发检测不孕妇女体内是否存在抗自身ZP3抗体的诊断试剂盒。     

球形幽门螺杆菌vacA基因表达质粒构建及表达

目的构建球形幽门螺杆菌vacA基因的重组表达质粒,初步观察其在E.coli中的表达。方法采用亚克隆技术,用BamHⅠ和SacⅠ从重组质粒pMD-18T-vacA上切下vacA基因,插入表达载体pET32a（＋）质粒,转化大肠埃希菌BL21,在氨苄青霉素阳性的LB平板上筛选阳性重组子,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒pET32a（＋）-vacA转化大肠埃希菌,（IPTG）诱导表达后进行（SDS-PAGE）电泳和凝胶扫描定量分析。结果重组质粒酶切和PCR鉴定与预期结果相符,成功构建携带vacA基因的重组原核表达质粒pET32a（＋）-vacA。核酸序列测定及同源性分析证实,表达质粒pET32a（＋）-cagA中所含vacA基因与GenBank中的vacA序列同源性达到99.2%。vacA基因在大肠埃希菌中诱导表达后获得约156 kD蛋白,蛋白含量占全菌体蛋白含量15.5%。结论成功构建球形H.pylori vacA基因重组表达质粒,并获得高效表达,为研究该基因蛋白的生物学特性及DNA疫苗研制奠定了基础。     

人畸胎瘤衍化生长因子原核表达载体的构建及表达

目的:构建人畸胎瘤衍化生长因子(teratocarcinoma-derived growth factor-1,TDGF-1)原核表达载体,进一步探讨其生物学作用及机制。方法:从人肝癌细胞系HepG2中提取总RNA,利用TDGF-1特异性引物通过RT-PCR方法扩增TDGF-1 cDNA,克隆入pHB载体中,构建重组载体pHB-TDGF-1。将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并通过SDS-PAGE及免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达TDGF-1。结论:该研究成功构建了人TDGF-1原核表达载体,并能够在大肠杆菌中有效表达TDGF-1,为进一步研究TDGF-1的生物学功能及其机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的构建和表达及其免疫反应性分析

目的 构建结核分枝杆菌H37Rv 株esat-6-cfp-10(简称ec)融合基因及其原核表达载体pET-23b(+).esat-6-cfp-10[以下简称pET-23b(+)-ec],表达、纯化融合蛋白rESAT-6-CFP-10(简称rEC),并分析其免疫反应性.方法 采用基因拼接技术将ESAT-6和CFP-10编...     

华支睾吸虫GST的新编码基因的克隆与纯化

目的 扩增华支睾吸虫(Cs)一个编码谷胱甘肽转移酶(GST)的新基因，确认是否存在内含子，进行原核表达，纯化。方法 用PCR方法从成虫cDNA文库和基因组中扩增CsGST基因，测序，定向克隆到原核表达载体pET-30a( )，在大肠杆菌BL21／DE3表达，按照Ni-NTA agarose说明书纯化重组蛋白，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和薄层色谱(TLC)分析。结果 CsGST基因全长639bp，没有内含子，构建的原核表达质粒pET-30a( )-CsGST在大肠杆菌中得到了有效表达，融合蛋白的分子量约为30kDa。重组蛋白达总蛋白的33％，纯化后的重组蛋白纯度为97％。结论 CsGST基因没有内含子，在大肠杆菌中能有效表达，重组蛋白得到了纯化，为进一步研究该基因的功能打下基础。     

结核杆菌Edman株Ag85C基因的克隆表达与鉴定

目的克隆人结核杆菌Ag85C基因并在大肠杆菌中表达,研究其对结核病预防和治疗过程中的免疫保护作用。方法设计一对特异性引物,PCR扩增人结核杆菌Edman株Ag85C基因开放阅读框并定向克隆到原核表达载体pQE30,通过酶切、PCR和测序鉴定重组质粒,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白。结果构建了pQE30-Ag85C重组质粒;在大肠杆菌中表达了一分子量约30kDa的重组蛋白。结论重组质粒pQE30-Ag85C构建成功并在大肠杆菌中高效表达,为Ag85C保护性抗原位点分析和新型疫苗的研制奠定了基础。     

结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶-GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应技术扩增目的基因片段;通过pGEX4T-1构建表达载体pGEX4T-pncA,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌DH10b,再经IPTG诱导表达谷胱甘肽S转移酶(GST)-吡嗪酰胺酶融合蛋白;用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析重组蛋白。结果扩增出了结核分枝杆菌pncA基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX4T-pncA,转化大肠杆菌BL21后经诱导产生了高水平的表达产物。结论构建了质粒载体,并诱导表达了GST-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。     

空肠弯曲菌peb1A基因的克隆表达及免疫性鉴定

目的:克隆空肠弯曲菌peb1A基因,构建其原核表达载体;鉴定重组表达产物的免疫原性。方法:PCR扩增空肠弯曲菌peb1A基因,构建pET-28a(+)-peb1A表达载体。转化E.coliBL21(DE3)后诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用Ni-NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白PEB1。采用CJ全菌抗体的Western blot鉴定rPEB1免疫反应性,双向免疫扩散试验鉴定rPEB1免疫家兔的抗血清效价。结果:所克隆的基因与报道的核苷酸序列同源性为99.9%,转化E.coliBL21(DE3)后,表达产物最高表达量占全菌总蛋白的33%左右,纯化后获得纯度为96%的重组蛋白。Western blot证实rPEB1能与CJ全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rPEB1血清的双向免疫扩散效价为1:16。结论:成功地构建了高效表达载体pET-28a(+)-peb1A,并获得rPEB1,所表达的rPEB1具有良好的免疫原性和免疫反应性,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

登革2型病毒B株E基因部分序列原核蛋白表达及单克隆抗体制备

目的 通过构建登革2型病毒B株E基因区1～476 bp的原核表达载体,进行原核表达,并制备单克隆抗体,为研制登革病毒诊断试剂奠定基础.方法 将登革2型病毒B株E基因序列克隆入原核表达载体pET28a(+),构建原核表达重组体pET28a(+)-E,将重组表达载体转化BL21(DE3)菌株进行原核表达.纯化后的蛋白免疫B...     

人肿瘤坏死因子相关凋亡配体克隆、表达及纯化

目的应用基因工程技术克隆人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子胞外区(TRAIL)114~281片段的cDNA,构建其原核表达载体,建立原核表达体系。方法采用RT-PCR方法从外周血单个核细胞的总RNA中扩增TRAIL分子的cDNA,克隆入T载体,阳性克隆经过RT-PCR、酶切和测序鉴定。将阳性克隆中TRAIL再亚克隆至原核表达载体pET28a,构建的表达载体用RT-PCR和酶切来验证,IPTG诱导表达。融合表达蛋白复性后,再用层析纯化表达产物。结果电泳显示RT-PCR产物约500bp,与预期值一致。TA克隆RT-PCR和酶切鉴定时的片段大小也为500bp。阳性克隆测序结果与GeneBank报道一致。构建的原核表达载体经RT-PCR和酶切鉴定后用IPTG诱导后,得到大量的融合表达蛋白,此蛋白是以包涵体形式存在的,对表达的蛋白复性和纯化后,电泳显示得到一条约20kD的蛋白条带。结论成功地构建了人肿瘤坏死因子相关凋亡配体分子原核表达载体。