miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞（HEK）293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法：以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040 Vector和FV040 miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48 h后收集慢病毒,以FV040 Vector慢病毒作为对照组,FV040 miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48 h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果：测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组（0.8387±0.1456）比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平（12.6400±0.7884）明显升高（t=14.72,P<0.01）,约为对照组的15.07倍。结论：成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。     

ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定ABCE1基因短发夹状干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,以便进一步研究ABCE1的功能。方法针对已经筛选确定的ABCE1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/GFP载体连接、转化,产生pLV-sh-ABCE1慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLV-sh-ABCE1、pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR和测序证实,成功构建ABCE1shRNA的慢病毒载体pLV-sh-ABCE1。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ML。结论成功构建ABCE1基因shRNA慢病毒载体,为应用RNAi研究ABCE1功能奠定基础。     

人神经营养素3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带人神经营养素3(hNT3)基因的重组慢病毒表达载体。方法:通过双限制性内切酶消化和连接的方法构建pGC-E1-hNT3-EGFP质粒,将该质粒转化大肠杆菌DH5α,通过PCR、酶切、测序和对比验证hNT3,通过Lipofectamine 2000将pGC-E1-hNT3-EGFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0三质粒系统共转染293T细胞包装病毒,经大量扩增后,应用实时定量PCR法鉴定和测定滴度。结果:克隆得到512 bp目的hNT3全长基因,经过PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,hNT3基因成功克隆到慢病毒载体中,可实现hNT3基因的表达,且病毒滴度为5×107TU/L。结论:成功构建表达人hNT3基因的慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够高的病毒滴度,可作为基因转染的有效工具在将来神经损伤修复实验研究中得到应用。     

人胆固醇酯水解酶基因慢病毒载体构建及鉴定

目的构建含有人胆固醇酯水解酶（hCEH）基因的慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH-IRES-EGFP,为hCEH基因治疗缺血性脑卒奠定基础。方法应用聚合酶链反应方法扩增目的片段,在目的基因进行上、下游分别加上PacI和AscI两个酶切位点,经双酶切后,转化入感受态DH5d细胞中,通过筛选获得重组质粒。将目的基因片段和pLenti6.3-IRES-EGFP载体连接,获得慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH—IRES-EGFP,并进行测序。抽提慢病毒载体,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度。结果目的基因与慢病毒表达载体pLenti6．3-IRES-EGFP连接,慢病毒表达载体pLenti6．3-hCEH—IRES-EGFP构建与预期相匹配,包装细胞293T呈绿色荧光。结论成功构建了携带hCEH基因的慢病毒载体。     

人表皮生长因子慢病毒载体的构建及表达

目的:构建人表皮生长因子(hEGF)慢病毒(LV)载体.方法:酶切并收集pcDNA 3.1-hEGF载体中的hEGF目的基因片段,克隆进入含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体内,将所得重组体LV-GFP-hEGF与辅助载体pA8.2和pVSVG共同转染人胚肾293T细胞,进行病毒包装.收集上清液,按按10-1～10-7倍比稀释后培养,检测病毒滴度;裂解细胞,进行Western Blot分析.结果:PCR扩增、HindⅢ酶切鉴定及测序结果均证实LV-GFP-hEGF构建成功.将LV-GFP-hEGF转染293T细胞,紫外光下检测可见绿色荧光;LV滴度达5×108TU/mL,转染效率＞75%,Western Blot证实转染细胞町表达hEGF.结论:成功构建了含有GFP报告基因的hEGF慢病毒载体,包装后的慢病毒可在293T细胞内高效表达.     

人miR-106b的克隆及其慢病毒表达载体构建

目的克隆微小RNAhsa—miR-106b并构建其慢病毒表达载体。方法将PCR扩增得到的miR-106b前体序列和pLVTHM载体经双酶切后连接,产生pLVTHM—miR-106b慢病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆。用pLVTHM—miR-106b、psPAX2和pMD2．G质粒共转染包装细胞293FT,包装产生慢病毒。结果经双酶切鉴定和测序证实,成功构了miR-106b的慢病毒表达载体pLVTHM—miR-106b。倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293FT呈绿色荧光。结论成功构建了has—miR-106b的慢病毒表达载体,为深入研究miR-106b的生物学功能奠定基础。     

RECK基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建RECK基因慢病毒载体,为体内外实验研究提供依据。方法PCR技术构建慢病毒载体表达质粒pGC—FU—RECK,PCR鉴定、测序验证RECK基因,并将其和包装质粒pHelperl．0、pHelper2．0共转染293T细胞,包装产生重组慢病毒GC—FU—RECK。结果pGC—FU—RECK中携有正确的RECK基因,并能在293T细胞中表达;能产生重组病毒GC-FU—RECK。结论成功构建了RECK基因的重组慢病毒载体,为研究其在胰腺癌中的生物学功能奠定基础。     

人Runx3基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Runx3基因重组慢病毒载体。方法 PCR扩增Runx3基因,应用In-Fusion技术将Runx3基因PCR扩增产物交换进入线性化慢病毒载体pGC-FU以构建重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。对长出的阳性克隆进行PCR鉴定,并进行测序和比对分析。将构建成功的重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3与包装质粒pHelper 1.0、包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞进行病毒包装。荧光显微镜下观察重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3转染293T细胞后细胞内绿色荧光表达情况。Western blot检测Runx3与EGFP融合蛋白表达情况。实时定量PCR测定病毒滴度。结果重组慢病毒质粒pGC-FU-Runx3经测序和比对分析证实目的基因序列正确。三质粒共转染293T细胞后荧光显微镜下观察细胞内可见明显的绿色荧光。Western blot证实Runx3与EGFP融合蛋白在293T细胞内稳定表达。浓缩病毒后测定滴度为2.0×108TU/ml。结论成功构建携带人Runx3基因的重组慢病毒载体pGC-FU-Runx3,为进一步研究Runx3过表达对慢性乙型肝炎患者外周血Th细胞分化的影响奠定基础。     

小鼠microRNA-21慢病毒抑制载体的构建及鉴定

目的构建microRNA-21(miR-21)慢病毒抑制载体,为研究miR-21在小鼠体内的功能及作用机制打下基础。方法利用miR-21前体并将其克隆入LV3pGLV-H1-GFP质粒中,经酶切及测序鉴定,利用脂质体将鉴定的阳性重组LV3pGLV-H1-GFP-miR-21抑制载体、PG-P1-VSVG和pCMV-dR3个质粒转染到HEK-293T细胞,将所得病毒感染293T细胞,检测病毒滴度,并将制备的病毒颗粒感染乳鼠心肌细胞和尾静脉注射小鼠,检测miR-21在小鼠体内的表达。结果酶切及测序结果证明成功构建了LV3pGLV-H1-GFP-miR-21重组质粒,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为2.4×109TU/ml,重组病毒成功感染心肌细胞,同时在Balb/c小鼠心脏有表达。结论成功构建miR-21慢病毒抑制载体,获得高效表达miR-21的慢病毒颗粒,为miR-21的进一步研究奠定了基础。     

pHsa-m122真核表达载体的构建及其表达活性的鉴定

目的 构建肝脏特异性的微RNA-miR-122真核细胞表达载体并对其表达活性进行鉴定.方法 经PCR从人基因组DNA中扩增肝脏特异性的微RNA-miR-122的前体序列,引入酶切位点和Poly T转录终止序列,将其插入siRNA专用真核表达载体pSuper中.将构建载体进行酶切、测序鉴定,再通过共转染含miR-122靶序列的GFP表达质粒后,经荧光显微镜和流式细胞仪及Western Blot检测,鉴定载体功能性表达.结果 miR-122的前体序列成功地克隆到真核表达载体pSuper上.且可表达出具有生物活性的miR-122,将该真核表达载体命名为pHsa-m122.结论 成功构建miR-122真核表达载体pHsa-m122,有助于进一步研究miR-122在肝炎病毒复制及肝癌形成中的作用.     

携带小鼠信号转导子及转录激活子3重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建携带小鼠信号转导子及转录激活子3(STAT3)的重组慢病毒载体,并检测 STAT3的蛋白表达,进行慢病毒包装并鉴定。方法将小鼠成肌细胞总 RNA 通过 STAT3引物逆转录为 cDNA PCR 扩增、回收后,同 pLVX-IRES-Zs-Green1载体片段连接,酶切鉴定及测序,将 pLVX-IRES-ZsGreen1-STAT3转染293 T 细胞,48 h 后收集细胞,Western blot 检测STAT3表达量,通过瞬时转染法包装出病毒上清。结果测序结果证实 STAT3成功插入 pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体,成功构建了慢病毒载体 pLVX-IRES-ZsGreen1-STAT3,共转染293 T 细胞48 h,Western blot 检测 STAT3表达量明显增强。测定病毒滴度为8.4×107 TU/mL。结论成功构建了 STAT3基因的重组慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础。     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

大鼠PEDF基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠PEDF 基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定,探讨PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响.方法 构建PEDF基因过表达质粒,测序鉴定.针对PEDF基因不同干扰靶点构建4种RNAi 病毒载体质粒pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA,测序鉴定.过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western blot方法进行外源筛靶确定PEDF基因RNAi 有效靶序列.有效RNAi 病毒质粒和其他3种辅助包装原件载体质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后, 收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度.结果 过表达质粒及4种RNAi质粒构建成功.Western blot外源筛靶显示2个靶点能有效敲减目的基因的表达.PEDF shRNA慢病毒表达载体Serpinf1-RNAi-LV经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定浓缩病毒悬液的滴度为2×1012Tu/L.结论 成功构建了PEDF基因的RNAi慢病毒载体,为研究PEDF基因对缺血心肌血管新生的影响打下基础.     

大鼠Nogo受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠Nogo受体(Nogo receptor,NgR)基因RNA干扰慢病毒表达载体,并观察其对293T细胞感染效率.方法: 应用基因工程技术,首先构建携带目的基因siNgR199的慢病毒穿梭质粒表达载体,然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293T细胞,转染48 h后收集上清离心过滤后冰浴保存,最后进行病毒滴度测定,与标准病毒液分别感染293T细胞,按MOI值分为5个梯度:1、3、5、10、20,以确定病毒滴度及适合感染的MOI值.其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果: 酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达1×108 ifu/m1,适合感染的MOI值为3.结论: 应用基因工程技术,成功构建了大鼠siNgR199慢病毒表达载体,为应用于治疗脊髓损伤后轴突再生创造了条件.     

大鼠STAT3特异性shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的在已经成功构建4个针对STAT3的shRNA质粒表达载体的基础上,筛选出干扰效果最佳者进行慢病毒包装并鉴定。方法将STAT3的干扰质粒shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及Control1(空载体对照),Control2(无效shRNA对照)分别转染目的细胞(大鼠肾小球系膜细胞),48h后收集细胞提取mRNA,以RT-PCR检测各组分STAT3表达量。对于筛选所得干扰效果最佳的质粒,采用pPACKH1TM慢病毒载体系统进行病毒包装。利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对感染效率及病毒滴度进行检测。结果 RT-PCR检测结果显示,shRNA3样品受干扰的效果最佳。成功构建了慢病毒载体Lenti-shRNA3,共转染293T细胞24h、48h,荧光显微镜下可见强绿色荧光,细胞生长状态良好,表明病毒包装成功。转染HT1080细胞,收集慢病毒液,测定病毒滴度为3.34×108ifu/ml,适合感染目的细胞。结论成功构建了STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础。     

磁共振报告基因magA的慢病毒载体质粒构建及体外表达

目的 构建携带磁共振报告基因magA的慢病毒载体质粒,初步检测其体外转铁效应.方法 采用人工DNA合成技术合成目的 基因magA,DNA重组技术将magA基因连接入慢病毒表达载体质粒pLenti-EGFP,酶切及DNA测序鉴定重组质粒pLenti-EGFP/magA的准确性.包装、包膜及重组质粒共转染293FT细胞包装...     

人microRNA149抑制表达慢病毒载体的构建及对黑色素瘤细胞增殖及迁移的影响

目的 构建人microRNA149(Hsa-miR-149)抑制表达慢病毒载体,并探讨抑制miR-149表达对黑色素瘤Mel-RM细胞增殖及迁移的影响.方法 由miRBase及NCBI数据库查找获得miR-149序列,设计合成其引物序列,通过退火反应获得双链DNA寡核苷酸片段,与载体pBS-hU6-1连接,将连接后的载体与FG12连接,经测序鉴定后获得重组慢病毒载体;将重组慢病毒质粒分别与包装辅助质粒共转染至293T细胞中,包装产生病毒,进行病毒滴度测定,再用包装后的病毒感染Mel-RM细胞,利用实时荧光定量PCR法检测miR-149表达水平.同时用MTT法及细胞迁移实验分别检测细胞增殖和迁移能力.结果 成功构建了抑制miR-149表达的慢病毒载体,测序证实了所插入的基因序列正确.在荧光显微镜下观察到转染后的297T细胞表达大量绿色荧光蛋白,收集病毒,用梯度滴定法测得的重组载体病毒滴度为3.2×1010 TU/L.将病毒感染Mel-RM细胞显示可有效降低miR-149的表达水平(P＜0.05).MTT法结果显示与感染空载FG12病毒的对照组相比,感染抑制miR-149表达重组质粒的实验组中活细胞数明显减少(P＜0.05).细胞迁移实验结果显示与对照组相比实验组明显抑制了Mel-RM细胞的迁移(P ＜0.001).结论 成功构建抑制miR-149表达的慢病毒载体,抑制miR-149的表达可以抑制Mel-RM细胞的增殖和迁移.并为后续进一步研究miR-149对黑色素瘤细胞发生发展的影响提供依据.     

miR-122的研究进展

miR-122是一种专一表达于肝脏的miRNA,在生理状态下参与精子发生、肝细胞发育、肝细胞表型、分化代谢,以及肝细胞应急应答等基本生命活动过程.在病理状态下,miR-122有促进HCV复制和翻译的作用,还可促进肿瘤细胞的凋亡,在HCC发生、发展过程中发挥抑癌基因样作用.     

Rac1-GTPase慢病毒的构建及生物学活性鉴定

目的构建携带绿色荧光蛋白的Rac1-GTPase显性负效突变体(Rac1N17)和组成型活性突变体(Rac1L61)的慢病毒。方法构建Rac1N17和Rac1L61慢病毒表达质粒,并以酶切和测序等方法鉴定。利用ViraPowerTM慢病毒表达系统包装制备Rac1-GTPase突变体慢病毒上清,用其感染大鼠前皮质神经元,分别进行Rac1生物学活性检测、细胞转染效率鉴定与神经元形态学观察。结果构建的Rac1N17和Rac1L61慢病毒表达质粒经酶切与测序鉴定正确,包装的慢病毒滴度为1×106TU/ml。用制备的慢病毒上清感染原代培养的前皮质神经元,Rac1生物学活性检测结果显示Rac1N17慢病毒显著抑制表皮生长因子诱导的Rac1活性的升高,而Rac1L61慢病毒感染神经元Rac1活性显著升高。感染效率鉴定显示病毒上清可感染80%以上的前皮质神经元。形态学观察显示经慢病毒感染后的神经元其胞体与树突分支清晰可见。结论成功制备了Rac1N17和Rac1L61慢病毒,并成功实现了慢病毒感染前皮质神经元,为进一步研究Rho蛋白家族信号通路提供了一个重要工具。     

Construction and identification of an RNA interference lentivirus vector targeting the Ras homology C gene of melanoma cells

Background Melanoma has the highest mortality among all superficial malignant tumors.The poor prognosis is due to its high metastasis rate and the lack of therapeutic targets.As a molecular switch that controls tumor metastasis,Ras homology C （RhoC） has been correlated with tumor progression,especially tumor invasion and metastasis.However,little research has been done about the effects of RNA interference （RNAi） targeting RhoC on the invasion and metastasis of melanoma.In this study,we constructed an RNAi lentivirus vector targeting the RhoC gene of melanoma cells and identified its silencing effects on the RhoC gene.Methods Based on the RhoC gene encoding information,three pGPU6/GFP/Neo-short hairpin （shRNA） plasmids were constructed.After detecting their silencing effects on the RhoC gene of A375 cells,the most effective pGPU6/GFP/ Neo-shRNA plasmid was packed with lentivirus to construct the recombinant pLenti6.3-EGFP-453 targeting RhoC.The lentivirus vector was used to infect A375 cells,and then the expression of RhoC mRNA and protein were determined with real-time PCR and Western blotting.Results The plasmids pGPU6/GFP/Neo-shRNA 336,pGPU6/GFP/Neo-shRNA 453,and pGPU6/GFP/Neo-shRNA 680 were constructed.After they were transfected into A375 cells,the expressions of RhoC mRNA and protein were 1.47±0.26,1.13±0.16,1.39±0.11 and 70.98±9.21,50.67±6.06,65.77±4.06,respectively.pGPU6/GFP/Neo-shRNA 453 was the most effective sequence,and was used to successfully construct the pLenti6.3-EGFP-453 lentiviral vector targeting RhoC.pLenti6.3-EGFP-453 was used to infect A375 cells.The expression of RhoC mRNA and protein were 1.05±0.05 and 62.04±15.86 in the lentivirus group,4.21±0.24 and 220.86±24.07 in the negative lentivirus control group,and 4.63±0.32 and 257.39±12.30 in the normal control group respectively with the difference between the lentivirus group and the control groups being statistically significant （P ＜0.05）.Conclusion The successfully constructed pLenti6.3-EGFP-453 vector targeting the RhoC can effectively infect human melanoma A375 cells in vitro,and significantly inhibit the RhoC mRNA and protein expression.