小寡核苷酸对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的：筛选具有促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化作用的小寡核苷酸（ODN）,探讨ODN对BMSCs向成骨细胞分化的影响。方法：取第3代BMSCs孵育24 h后进行成骨诱导,双盲法加入12条不同的ODN,PBS作为溶媒对照组,应用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测ODN于不同工作浓度（4.0、 2.0、 1.0和 0.5 mg/L）、不同时间点（24、72和120 h）刺激经成骨诱导后的BMSCs内ALP的表达水平,筛选出具有促成骨分化作用的ODN。结果：与PBS溶媒对照组比较,ODN工作浓度为4.0和0.5 mg/L时,实验组与对照组ALP表达水平差异无显著性(P>0.05),ODN工作浓度为2.0和1.0 mg/L时,有2条ODN在不同时间点（24、72和120 h）均可促进BMSCs内ALP的表达（P<0.01）。结论：在12条不同的ODN中共筛选出2条具有促进BMSCs成骨分化作用的ODN,表明特定序列的ODN能够影响大鼠BMSCs向成骨细胞的分化。     

体外诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨兔骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）在特定培养条件下向软骨细胞定向分化的情况。方法密度梯度离心法分离兔BMSCs，在体外培养扩增后用含有骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP)-2的条件培养液诱导其在体外单层培养模式下向软骨细胞分化。采用甲苯胺蓝染色、Masson染色、免疫组织化学染色、阿利新蓝比色法测定糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）的含量检测BMSCs分化情况。统计学分析比较第2、4、7代（P₂、P₄、P₇）BMSCs诱导后增殖能力及向软骨细胞分化能力的变化。结果定向诱导后BMSCs表现出软骨细胞的特性。P₂、P₄间的细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力比较差异无统计学意义（P＞0.05）；P₇与P₂、P₄相比，细胞增殖能力和成软骨细胞分化能力均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论BMP-2能诱导兔BMSCs在体外单层培养模式下向软骨细胞分化；细胞传代对BMSCs向软骨细胞分化有重要影响。     

葡萄糖、胰岛素对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的 观察不同浓度葡萄糖及胰岛素(INs)对骨髓间充质干细胞(BMSC)向成骨细胞(OB)分化能力的影响,探讨葡萄糖及INs对骨代谢的作用机制.方法 采用体外细胞培养技术自大鼠股骨和胫骨中分离BMSC进行纯化,培养,然后在成骨培养基中诱导BMSC分化为OB,并用不同浓度的葡萄糖(5.6、25、50 mmol/L)及加或不加INs(0.6 μg/ml)干预诱导过程,光镜下观察茜素红染色分化后的OB钙结节的细胞比例.Realtime PCR测定OB的标记物碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)及转录因子Runx2 mRNA表达.结果 随着糖浓度升高,茜素红染色红色钙结节数目明显减少,PCR结果显示ALP,BGP及Runx2 mRNA表达也明显降低,差异有统计学意义(P<0.05).提示随着糖浓度增加成骨分化逐渐减少,在同等糖浓度下,加入INs干预组,茜素红染色阳性细胞计数明显增加,PCR结果ALP,BGP及Runx2 mRNA表达明显升高(P<0.01),提示INs可提高OB分化.结论 葡萄糖呈量效性地抑制BMSC向OB分化,这可能为糖尿病性骨质疏松形成的重要机制之一.INs可促进BMSC向OB分化,并可改善高糖对BMSC向OB分化的抑制作用.     

细胞表面分子在骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的表达

目的研究成人骨髓间充质干细胞(MSCs)在诱导条件下定向分化为成骨细胞过程中,细胞表面分子的表达及变化特征。方法从人骨髓中分离有核细胞,在含有15%胎牛血清、维生素C和β-甘油磷酸钠的α-MEM培养基中培养。在培养早期加入10-8mol/L地塞米松(实验组)或保持基础培养状态(对照组1),同时部分细胞仅培养于α-MEM培养基中(对照组2)。于培养第7、12、17天分别收集实验组和各对照组细胞,用流式细胞方法观察细胞表面分子CD45、CD34、CD117、CD90和人白细胞抗原-DR(HLA-DR)的表达,并定量对比分析。结果成人骨髓MSCs在体外诱导条件下分化为具有成骨细胞特征的成熟细胞。培养第7天实验组、对照组1和对照组2均少量表达CD45,第12、17天CD45表达转为阴性。各组各时间点CD34、CD117表达均为阴性。培养第12天,实验组和各对照组细胞CD90表达均较第7天升高,以对照组升高明显。实验组细胞HLA-DR表达随着成骨细胞分化成熟逐渐上升,而对照组细胞HLA-DR表达下降。结论MSCs在诱导条件下可以向成骨细胞分化。细胞表面分子的表达在细胞分化过程中呈特征性改变,是成骨细胞分化早期的一个重要标志。     

内参基因GAPDH和β-actin在BMP9诱导的骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的表达情况

目的:观察常用内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和β肌动蛋白(β-actin)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化过程中表达情况,以确定相关研究的内参基因。方法:检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)确定BMP9诱导的MSCs(包括C3H10、C2C12和MEF)向成骨分化;以real-time PCR分别检测0、1、3、5、7 d GAPDH和β-actin的m RNA表达水平;以Western blot检测GAPDH和β-actin蛋白。结果:(1)β-actin在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中m RNA表达水平逐渐升高,0 d与5 dβ-actin的m RNA表达量存在统计学差异(C3H10、C2C12和MEF的P值均为0.000,GAPDH的m RNA表达水平未见明显改变(P>0.05);β-actin蛋白表达量随成骨分化逐渐增加,而GAPDH蛋白表达未见明显变化。结论:在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中,GAPDH比β-actin更适合做内参。     

淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的:探讨淫羊藿苷对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。方法:采用差速贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定表面标志。取第3代细胞加入10-6mol/L淫羊藿苷培养基,对照组仅加入等量普通培养基进行培养。通过镜下观察细胞形态,流式细胞仪测定细胞表面标志,碱性磷酸酶试剂盒测定诱导细胞碱性磷酸酶活性,组织化学染色观察钙化结节形成能力。结果:体外培养的细胞表达CD29、CD44、CD105、CD166。淫羊藿苷诱导组细胞碱性磷酸酶呈阳性反应并有钙化结节形成,而对照组未见钙化结节形成。结论:淫羊藿苷能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,可视为一种良好的骨诱导活性因子。     

MicroRNA-195-5p调节Bmpr1α表达对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响

目的 探讨miR-195-5p在补肾方含药血清干预大鼠原代骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell, BMSC)中的表达及其对成脂分化的影响。方法 体外贴壁法原代培养的大鼠BMSC细胞经流式细胞术、CD44和CD34免疫荧光染色鉴定后,与椎间盘软骨细胞和成骨细胞一起采用荧光定量RT-PCR方法检测细胞中rno-miR-195-5p的表达情况;采用荧光素酶报告基因实验验证骨形态发生蛋白受体-1α(Bmpr1α)是否为rno-miR-195-5p的靶基因,采用Western印迹法和油红O染色检测rno-miR-195-5p对Bmpr1α表达和BMSC成脂分化的影响。结果流式细胞术与免疫荧光分析显示所培养细胞具备BMSC特征。rno-miR-195-5p在补肾方含药血清干预的原代BMSC中表达明显升高(P<0.01),且在分化完成的软骨细胞和成骨细胞中高表达。双荧光素酶报告实验与Western印迹法证实Bmpr1α是rno-miR-195-5p的靶基因。转染rno-miR-195-5p mimics上调BMSC中rno-miR-195-5p可抑制Bmpr1α的表达(P<0.05),降低成脂分化能力;而转染rno-miR-195-5p inhibitor可显著增加BMSC中Bmpr1α的表达(P<0.01),增强成脂分化能力。结论 补肾方含药血清干预BMSC上调rno-miR-195-5p,通过降低其靶基因Bmpr1α的表达而降低BMSC的成脂分化,改善骨质疏松症状。     

雌马酚对原代培养小鼠骨髓间充质干细胞增殖及向成骨细胞分化的作用

目的：探讨植物雌激素雌马酚（Equol）对体外原代培养小鼠骨髓间充质干细胞（bone marraw -derived mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖及向成骨细胞分化的作用.方法：以无酚红（α-MEM,含活性碳吸附过的10%胎牛血清）培养小鼠BMSCs,同时分别给予雌马酚（10^-8mol/L～10^-6mol/L）、雌马酚（10^-6mol/L）合用雌激素受体（ER）拮抗剂ICI 182 780（10^-7mol/L）;测定[^3H]-甲基胸腺嘧啶掺入率反映细胞增殖情况;测定细胞内碱性磷酸酶活性与钙沉积量反映细胞向成骨细胞分化状态.结果：雌马酚呈剂量依赖性（10^-8mol/L～10^-6mol/L）增加[^3H]-甲基胸腺嘧啶掺入率、细胞内碱性磷酸酶活性与钙沉积量;合用ER拮抗剂ICI182 780（10^-7mol/L）可拮抗雌马酚（10^-6mol/L）刺激BMSCs增殖及向成骨细胞分化的作用.结论：雌马酚可能通过作用于ER而促进骨髓间充质干细胞增殖及向成骨细胞分化.     

中药及其提取物诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究进展

骨髓中除了造血干细胞之外,还有另一类重要的成体干细胞——骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）,其是一种分泌多种细胞因子的未分化的骨髓基质细胞。在一定环境和特异因子诱导下,MSCs可分化为除造血以外的多种组织细胞,如可分化为内胚层来源的肝细胞,中胚层来源的成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞和血管内皮细胞,外胚层来源的神经元样细胞。     

鹿茸多肽对人骨髓间充质干细胞BMP-2和Runx2表达的影响

目的:探讨鹿茸多肽(VAP)对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)中骨形态发生蛋白2(BMP-2) 和骨特异性转录因子2(Runx2)基因和蛋白表达的影响,阐明其对骨合成及hBMSCs向成骨细胞方向分化的作用机制。方法:体外培养的hBMSCs分为对照组和5、10、15、20 g·L^-1 VAP组,通过检测各组hBMSCs中碱性磷酸酶(ALP)活性,确定体外用药最佳药物浓度;CCK-8法检测对照组和10 g·L^-1 VAP组hBMSCs增殖情况;荧光定量 PCR 法与Western blotting法测定对照组和10 g·L^-1 VAP组hBMSCs中BMP-2和Runx2基因与蛋白的表达。结果:VAP各组细胞中ALP活性均高于对照组,其中以10 g·L^-1 VAP组细胞中ALP活性最高(P<0.01);CCK-8法,10 g·L^-1 VAP组hBMSCs增殖率明显高于对照组(P<0.05),VAP诱导培养第9天hBMSCs增殖率最高,且进入平台期,之后hBMSCs的增殖率开始下降;荧光定量 PCR和Western blotting检测,10 g·L^-1 VAP组hBMSCs中BMP-2和Runx2基因及蛋白表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:VAP能够提高hBMSCs中ALP活性,促进hBMSCs增殖分化,上调hBMSCs中BMP-2及其下游Runx2基因和蛋白的表达,这可能是VAP对hBMSCs骨形成及骨代谢影响的分子调控机制之一。     

利拉鲁肽对失重大鼠骨质疏松及骨髓间充质干细胞成骨细胞分化的影响

目的:探讨利拉鲁肽对失重大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响,为航天员飞行后骨量丢失的缓解提供实验依据.方法:取30只12周龄SD雄性大鼠,应用随机数字表法分为对照组、失重组、失重+利拉鲁肽组,每组10只.采用尾悬吊28 d的方法构建大鼠失重模型,失重+利拉鲁肽组悬吊2 d后开始给予利拉鲁肽200μg/(k...     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响

目的 观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对兔源骨髓间充质于细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）定向分化为成骨细胞的作用及机制. 方法 离心法分离兔骨髓后,体外培养BMSCs,体积分数5％和10％的PRP与BMSCs共培养,观察BMSCs诱导分化过程中茜素红染色阳性率,应用酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaliphosphatase,ALP）活性,应用ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中骨钙素（osteocalcin,OCN）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的含量,应用real time-PCR检测成骨相关基因CTGF、ALP、成骨细胞核心结合因子α1（core-binding factor alpha 1,Cbf-α1）、兔Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和OCN的表达. 结果 BMSCs诱导分化后细胞茜素红染色阳性率、ALP活性、OCN及CTGF含量升高,CT-GF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN的mRNA表达增加. 结论 PRP可促进BMSCs向成骨细胞分化,可能与PRP促进BMSCs中CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN表达有关.     

α-玉米赤霉醇对大鼠成骨细胞IL-6表达及分泌的影响

目的：探讨α-玉米赤霉醇对体外培养的大鼠成骨细胞IL-6表达及分泌的影响。方法体外培养原代SD新生大鼠颅骨成骨细胞,形态学观察、碱性磷酸酶（ALP）染色、I型胶原免疫荧光染色进行成骨细胞鉴定,分别以雌激素及不同浓度的α-玉米赤霉醇作用于成骨细胞,采用RT-PCR法检测IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测成骨细胞培养上清中IL-6的含量。结果10^-10-10^-5mol/Lα-玉米赤霉醇能够抑制成骨细胞IL-6 mRNA的表达及其蛋白分泌,其中以10-6 mol/L、10-7mol/L的α-玉米赤霉醇作用显著。结论α-玉米赤霉醇能够抑制成骨细胞细胞因子IL-6 mRNA及蛋白的表达,这可能是α-玉米赤霉醇防治绝经后骨质疏松症的机制之一。     

兔腰椎融合术中BMP和bFGF对骨髓间充质干细胞的作用

目的评价骨形态发生蛋白(BMP)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的兔骨髓间充质干细胞(MSC)复合多孔生物陶瓷对提高腰椎融合率的作用。方法将32只家兔随机分为4组(n=8),用下列移植物分别进行腰椎后外侧路融合:Ⅰ组单独应用MSC;Ⅱ组以bFGF作用MSC;Ⅲ组用BMP-2作用MSC;Ⅳ组用BMP-2和bFGF共同作用MSC。实验动物术后6周处死,利用放射学、手工生物力学和组织学方法观察和分析椎体融合的情况。结果影像学和手工力学检测,Ⅳ组椎体融合情况要比其它3组好得多;组织学检测示,在Ⅳ组中,可以看到在融合区周围出现大量的新生成的骨小梁。Ⅱ,Ⅲ组在融合区新生骨小梁较Ⅳ组少,而是新生骨小梁与纤维结缔组织混杂出现;Ⅰ组新生骨小梁显著减少,生物陶瓷微孔内多为纤维结缔组织。结论经BMP和bFGF体外培养的MSC可取得比单独应用MSC更好的融合效果。     

BMP-14与bFGF联合诱导骨髓间充质干细胞向软骨分化的实验研究

目的 研究骨形态发生蛋白-14(BMP-14)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)向软骨分化的协同作用.方法 采用密度梯度离心法与贴壁分离法相结合分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,用含10%胎牛血清的L-DMEM培养至第3代作为种子细胞,对照组A组不加生长因子,实验组B、C、D组分别加入100 ng/ml BMP-14、10 ng/mlbFGF和100ng/ml BMP-14+10 ng/ml bFGF,培养24 h后各组间行细胞增殖比较,14 d后观察各组细胞形态学改变,各组间行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色和阿尔辛蓝染色.结果 培养14 d后,A、B、C、D 4组的Ⅱ型胶原细胞染色阳性率分别为(7.5210±3.7243)%、(40.8271±1.2787)%、(17.2818±1.4242)%、(60.5114±1.7634)%;阿尔辛蓝染结果 为:A组阴性,B、C组呈淡染,D组呈蓝色.结论 BMP-14和bFGF的联合应用较单个细胞因子可以明显诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞表型分化及促进细胞增殖.     

骨形态发生蛋白2浓度对兔骨髓间充质干细胞生长的影响

目的:探讨骨形态发生蛋白-2(BMP-2)浓度对兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone mesenchymal stem cells,rBMSCs)生长作用的影响。方法:分别用浓度为100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml的BMP-2培养初始数量约1×10⁴个的rBMSCs 12d,以单纯10%MEM培养的rBMSCs为对照组。分析4组间每天细胞计数的变化,并分别观察第6及第12天细胞形态的差异。Real-Time PCR检测第6、12天4组Notch通路关键分子Notch1/Jagged1/Hes1的表达。结果:3种浓度的BMP-2实验组与对照组之间细胞繁殖量没有统计学差异(P>0.05)。对照组细胞基本保持长梭形,聚集生长现象不明显。3个浓度实验组的细胞形态呈多样性,聚集生长明显加强,但组间形态无明显差异。第6、12天3个BMP-2组之间细胞的Notch1/Jagged1/Hes1 mRNA的表达量无明显差异(P>0.05),但与对照组比较均明显上升(P<0.05)。结论:BMP-2可能通过Notch通路促进兔BMSCs的生长聚集...     

脂质体介导的hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 观察脂质体介导的人骨形态发生蛋白-2(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)基因转染兔骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后mRNA及其蛋白的表达.方法 采用脂质体介导的真核细胞转染技术,将含hBMP-2编码序列的真核表达质粒转染兔BMSCs,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化及免疫印迹法(Western blot)等手段检测转染后hBMP-2 mRNA及其蛋白的表达.结果 通过脂质体介导的真核转染方法能成功将外源hBMP-2基因转入兔BMSCs,并经RT-PCR、免疫组化和蛋白印迹法证实,转染pcDNA3.1-hBMP-2 后的兔BMSCs内有大量hBMP-2 mRNA 的转录和蛋白的表达.结论 通过脂质体介导的真核转染方法可以将外源hBMP-2基因转染BMSCs,并使其获得较为稳定的表达.     

m6A结合蛋白YTHDC2对人骨髓间充质干细胞分化的影响

目的 研究N6-腺苷酸甲基化(N6-methyladenosine,m6A)结合蛋白YTH结构域蛋白2(YTH domain-containing protein 2,YTHDC2)对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)成骨及成脂分化的调控...     

淫羊藿对骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化以及FN表达的影响

目的 研究中药淫羊藿对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stroma cells,MSCs)向成骨细胞方向分化以及对纤维连接蛋白(FN)表达的影响,探讨其促成骨作用的分子机制.方法 分别用淫羊藿含药血清和地塞米松干预诱导体外培养的骨髓间充质干细胞,即分为淫羊藿组(M组)、地塞米松组(D组)和阴性对照组(C组),分别于诱导培养的第2、5、8天对细胞进行Giemsa染色和FN免疫细胞化学染色,于诱导培养的第8天对细胞进行矿化结节染色.结果 ①随着培养天数的增加,M组和D组细胞中有大量的立方形和多角形细胞形成,C组细胞以梭形为主;②随着培养天数的增加,三组细胞的FN表达均呈现先下降后上升的趋势,但M组和D组FN上升的速率较C组快;③M组和D组均有大量矿化结节形成.结论 淫羊藿具有促进MSCs向成骨细胞分化的能力.淫羊藿在骨髓MSCs向成骨细胞分化早期,对FN的表达具有一定的抑制作用,之后可能具有促进作用,提示FN可能是淫羊藿促成骨细胞分化作用后期的辅助因子.