骨髓基质干细胞治疗实验性自身免疫性神经炎的研究

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSC)移植治疗实验性自身免疫性神经炎(experimentalautoimmuneneuritis,EAN)的疗效以及相应的作用机制。方法:用P0180-199多肽与弗氏完全佐剂的混合液免疫Lewis大鼠,建立EAN动物模型。治疗组在免疫后第10天,尾静脉回输荧光染料PKH26标记的BMSC(2×106个细胞/只),通过临床评估、免疫组化及ELISA等方法,研究了BMSC对EAN的治疗作用。结果:回输的BMSC能向脱髓鞘神经组织周围迁移,减轻脱髓鞘的病理改变和炎性细胞浸润。与对照组比较,治疗组CD4 和CD8 T细胞的浸润显著减少(P<0.05),血清中IFN-γ和TNF-α的水平明显降低(P<0.05),培养上清中IL-4的水平显著增加(P<0.05)。结论:BMSC静脉移植治疗EAN有一定的疗效。BMSC通过调节细胞因子的表达逆转Th1/Th2型细胞之间的失衡而发挥治疗作用,并能够抑制T细胞活化增殖。     

促红细胞生成素对实验性自身免疫性神经炎大鼠的治疗作用及机制

目的研究促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)对实验性自身免疫性神经炎(Experimental autoimmune neuritis,EAN)的治疗作用及机制。方法将Lewis大鼠共12只随机分的为EPO治疗组6只和PBS对照组6只,使用大鼠外周神经P257-81肽段诱发急性EAN模型,每天测量体重和神经功能评分至实验结束,免疫后第7天开始进行EPO治疗。第14天(高峰期)取大鼠坐骨神经,用免疫组化染色观察T细胞炎症浸润。第21天(恢复期)取大鼠淋巴结,用荧光定量PCR方法检测IFN-γ、IL-17、IL-4和Foxp3的相对表达。使用放射性3H-TdR掺入法检测淋巴细胞增殖实验中EPO的抑制作用。结果 EPO治疗后大鼠EAN严重度显著降低;免疫组化显示治疗组外周神经T细胞浸润减少;荧光定量PCR结果显示治疗组淋巴结中IFN-γ和IL-17表达降低,而IL-4和Foxp3表达增加;淋巴细胞增殖实验表明EPO剂量依赖地抑制淋巴细胞增殖。结论 EPO对EAN有明显治疗作用,这种治疗作用可能与EPO抑制T细胞的炎症浸润和增殖反应,抑制Th1/Th17类细胞因子炎症损伤,促进Th2/Treg类细胞因子免疫抑制作用有关。     

IL-12和IL-18对系统性红斑狼疮患者NKT细胞的影响

目的:探索体内、体外应用不同干预因素对系统性红斑狼疮(SLE)患者自然杀伤T细胞(NKT)的含量变化的影响,为SLE患者治疗寻求一条新的途径.方法:采用流式细胞术(FCM)检测30例SLE患者体内外应用不同干预因素前后外周血Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT细胞含量.结果:SLE患者体内应用甲强龙及甲强龙加丙球24 h后Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率明显高于用药前(P<0.01),SLE患者体外制备PBMC后加甲强龙、甲强龙加丙球及IL-12+IL-18进行细胞培养48 h后,Vα24+Vβ11+、CD161 Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率明显高于用药前(P<0.01).结论:体内外应用甲强龙及甲强龙加丙球后,Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率明显高于用药前;体外加IL-12+IL-18后与用药前比,Vα24+Vβ11+、CD161+Vα24+NKT细胞占淋巴细胞比率明显高于用药前;表明细胞因子IL-12+IL-18可能成为治疗SLE的一种新的方法.     

乙肝病毒感染者外周血IL-21表达及意义

在慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)小鼠模型的研究中发现,病毒特异性CD8+T淋巴细胞(cytotoxic T cell,CTL)功能的发挥需要特异性CD4 +T细胞的辅助.IL-21主要由活化的CD4+T细胞分泌,对维持病毒特异性的CTL功能具有重要的作用.本研究在体外观察不同乙肝病毒( HBV)感染状态下,血浆中IL-21的表达及产生IL-21的HBV特异性CD4+T淋巴细胞频数,探讨IL-21在HBV感染中的意义.     

TLR4,TLR9 mRNA在P0 180-199诱导Lewis大鼠EAN模型中的动态表达及TWP对其的影响

目的:观察TLR4,TLR9 mRNA在P0 180-199诱导Lewis大鼠FAN模型中动态表达,以及雷公藤多甙对其的影响.方法:以周围神经髓鞘蛋白P0 180-199免疫Lewis大鼠,给予雷公藤多甙灌胃,TWP 40 mg/(kg·d)干预治疗.观察免疫后大鼠症状和组织病理学改变及TWP对其的影响,利用RT-PCR检测TLR4,TLR9的mRNA表达水平.结果IEAN组出现EAN行为学改变、炎性细胞浸润和髓鞘脱失,TLR4、TLR9的表达高于ETA组(P＜0.05).EAN+TWP组大鼠症状较FAN+NS组稍改善,炎性浸润减少,FAN+TWP组,TLR4和TLR9的表达低于EAN+NS组(P＜0.05).CFA组大鼠无症状,TLR4和TLR9的表达高于NS组(P＜0.05).结论:TLR4和TLR9可能参与EAN发病;雷公藤多甙可能通过抑制TLR4和TLR9的功能来减轻EAN的发病.     

肺动脉高压大鼠肺部炎症与CD4+ T 淋巴细胞上Cx40、Cx43 的相关性研究

目的:探讨肺动脉高压大鼠肺组织炎症的变化与CD4~+T淋巴细胞上连接蛋白(Cx) 40、43表达的相关性研究。方法:选取12周龄雄性SD大鼠12只,随机分为对照组和肺动脉高压(PAH)组,野百合碱(MCT)溶液一次性腹腔注射60 mg/kg,4周造模成功后,记录右心室肥厚指数(RVHI),HE染色观察大鼠肺脏病理学变化,ELISA方法检测肺组织中IL-6、TNF-α的表达,流式细胞术检测T淋巴细胞CD4/CD8的表达比率以及CD4~+T淋巴细胞上Cx40、Cx43的表达变化。结果:与对照组比较,PAH组右心室重量与RVHI升高; PAH组肺脏中小动脉血管壁增厚,炎性细胞浸润,PAH组大鼠肺中小型动脉的管壁厚度占血管外径的百分比(WT%)和肺动脉管壁面积与管总面积的百分比(WA%)均增高(P0. 05);肺动脉高压大鼠肺组织匀浆中细胞因子IL-6和TNF-ɑ表达水平上调(P0. 05); PAH组CD3~+T淋巴细胞比例升高(P 0. 05),PAH组CD4~+/CD8~+升高(P0. 05); PAH组CD4~+T淋巴细胞上Cx40、Cx43表达显著增高(P0. 01),肺组织匀浆中细胞因子IL-6、TNF-α与CD4~+T淋巴细胞上Cx40和Cx43高表达呈显著正相关(P0. 05)。结论:MCT诱导的肺动脉高压引起的肺部炎性改变可能与T淋巴细胞上连接蛋白表达增高有关。     

EAE模型中IL-17阻断MBP经鼻黏膜免疫诱导耐受的机制研究

目的探讨MBP68-86肽段经鼻黏膜诱导EAE模型免疫耐受中IL-17的作用机制。方法向4组Lewis大鼠鼻黏膜分别给与PBS、MBP、MBP+IL-17及MBP+IL-17~+腹腔注射Anti-IL-6,诱导免疫耐受给药5 d后,建立EAE动物模型。ELISA方法测定各组血清中细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-17和TGF-β的含量;评估EAE临床发病情况;脊髓切片分别做HE染色观察淋巴细胞浸润及分布情况,免疫组化方法检测脊髓中单位面积IL-17~+细胞数量;流式细胞仪检测淋巴结中Th17细胞和Treg细胞数量。结果IL-17组与MBP组细胞因子含量相比IFN-γ(P0.05)、IL-4(P0.01)、IL-6(P0.01)、IL-17(P0.001)、TGF-β(P0.01)有显著差异,与PBS组无差异;IL-17组、PBS组与MBP组、Anti-IL-6组相比,免疫后出现体重减轻、尾瘫、后肢瘫痪等临床表现;脊髓切片中淋巴细胞浸润面积较大且细胞数量较多、IL-17~+细胞数显著增多;淋巴结中CD4~+IL-17~+T细胞百分率显著增多、CD4~+Foxp3~+T细胞显著减少。结论鼻黏膜给予IL-17可以打破MBP特异性免疫耐受的形成;并且IL-17是通过促进IL-6表达增加,使初始化的T细胞向Th17细胞分化增加,从而打破MBP鼻黏膜免疫耐受治疗EAE。     

重症肌无力中白介素4、15、18与端粒酶活性的相关性研究

目的:探讨IL-4、IL-15、IL-18在重症肌无力(MG)中的表达及其与CD4~+T淋巴细胞端粒酶活性的相关关系.方法:应用ELISA及重复扩增-酶联免疫吸附实验(PCR-ELISA)检测30例MG患者(MG组)和30例健康对照者(NC组)血清中的IL-4、IL-15、IL-18水平和CD4~+T淋巴细胞端粒酶活性.结果:MG组血清IL-4、IL-15、IL-18水平及CD4~+T淋巴细胞端粒酶活性显著高于NC组,差异具有统计学意义(P<0.01); MG组CD4~+T淋巴细胞端粒酶活性与血清IL-4、IL-15、IL-18水平均存在正相关关系(P<0.01).结论:IL-4、IL-15、IL-18及CD4~+T淋巴细胞端粒酶均参与了MG的发病过程;MG中IL-4、IL-15及IL-18有可能通过各种途径直接或间接的上调CD4~+T淋巴细胞的端粒酶的活性.     

趋化因子MCP-1在EAN中的作用及雷公藤多甙的影响

目的 探讨单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)在实验性变态反应性神经炎(experimental autoimmune neuritis,EAN)中的作用及雷公藤多甙(TWP)对其影响.方法 用兔坐骨神经匀浆免疫Wistar大鼠建立EAN模型,TWP灌胃治疗,观察大鼠发病情况和组织病理改变,用免疫组化技术检测MCP-1在坐骨神经中的表达.结果 EAN组大鼠在第15天发病达到高峰,且病理改变可见炎性细胞浸润及脱髓鞘,其MCP-1表达高峰在疾病早期(9 d),随后逐渐下降,与对照组相比有显著差异性(P＜0.001).EAN TWP组大鼠发病程度较EAN NS组轻,MCP-1表达的整体趋势较EAN NS组降低.结论 MCP-1可能对EAN 发病起始动作用.TWP可能通过抑制趋化因子MCP-1的表达来减轻EAN.     

小鼠CD4+T细胞活化后IL-10受体I表达的研究

目的:检测抗小鼠CD4+T淋巴细胞活化后表面白细胞介素10受体I(IL-10R1)表达变化,为进一步研究白细胞介素10(IL-10)相关免疫疾病的发病机制及进展提供有力支持.方法:取C57BL/6小鼠脾细胞,溶血后采用尼龙毛去除B淋巴细胞后,流式细胞仪无菌分选CD4+T淋巴细胞,利用anti-CD3和anti-CD28多克隆抗体刺激分选后细胞,分别在第0、12、24、48和72小时流式细胞术检测IL-10R1表达情况.结果:0小时时小鼠CD4+T淋巴细胞不表达IL-10R1,随着刺激时间的延长IL-10R1表达增加,24小时时达到最高,随后表达水平开始下降,72小时时表达情况与0小时基本相同.结论:CD4+T淋巴细胞活化后IL-10R1表达短暂,以24小时时表达最高.     

Ovarian follicular concentration of IL-12, IL-15, IL-18 and p40 subunit of IL-12 and IL-23

BACKGROUND: The aim of the study was to determine the presence of interleukin (IL)-12, IL-15, IL-18 and p40 subunit of IL-12/IL-23 in follicular fluid from spontaneous cycles and the relation between the concentration of selected cytokines and IVF-embryo transfer outcome. METHODS: IVF-embryo transfer and enzyme immunoassay (EIA) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA and MBL, Nagoya, Japan) were used. RESULTS: Follicular fluid of women included in the IVF-embryo transfer procedure contained common p40 subunit of IL-12/IL-23 (median 70.1 pg/ml), IL-15 (median 1.3 pg/ml) and IL-18 (median 38.2 pg/ml). There was a significant negative correlation between follicular fluid concentrations of IL-15 and IL-18 (R=-0.392, P=0.003). Significantly higher concentrations of common p40 subunit of IL-12/IL-23 (median 79.8 pg/ml) were found in the follicular fluid taken from follicles containing oocytes, when compared with those without an oocyte (median 44.5 pg/ml, P=0.006). Patients who achieved clinical pregnancy had significantly decreased concentration of IL-15 (median 0.8 pg/ml) compared with patients without successful IVF-embryo transfer outcome (median 1.4 pg/ml, P=0.047). CONCLUSION: Follicular fluid collected from spontaneous cycles contains detectable levels of p40 subunit of IL-12/IL-23, IL-15 and IL-18. Increased concentrations of p40 subunit of IL-12/IL-23 in follicles containing oocytes suggest an important role of this cytokine in reproduction. Possible negative value of IL-15 as a predictor of IVF-embryo transfer success remains to be determined.     

IL-2、IL-4和IL-7体外诱导人外周血淋巴因子激活的杀伤细胞效应的比较

比较了淋巴因子ＩＬ－２、ＩＬ－４和ＩＬ－７在体外诱导健康人外周血淋巴因子激活的杀伤 （ＬＡＫ）细胞活性的效应。结果表明，ＩＬ－７可单独，亦可与ＩＬ－２、ＩＬ－４协同诱导ＬＡＫ细胞，而且ＩＬ－７ 诱导ＬＡＫ细胞的效应不被抗ＩＬ－２、抗ＩＬ－４所抑制。ＩＬ－７单独诱导的ＬＡＫ细胞活性高峰迟于ＩＬ－ ２或ＩＬ－４所诱导的活性高峰，且与增殖反应曲线一致。抗ＣＤ８抗体明显抑制ＩＬ－７诱导ＬＡＫ细胞 的效应，而ＩＬ－７诱导ＬＡＫ细胞的效应不能被抗ＮＫＨ－１所抑制。提示：ＩＬ－７ 激活ＬＡＫ细胞的效应 机制不依赖ＩＬ－２和ＩＬ－４，并很可能成为肿瘤过继治疗中的重要淋巴因子。     

Treatment of old mice with IL-2 corrects dysregulated IL-2 and IL-4 production

Splenic T cells from old BALB/c mice, activated in vitro withantibody to CD3e, secrete more IL-4 but less IL-2 than splenicT cells from young mice. The age-associated increase in IL-4secretion is associated with a significantly increased concentrationof intracellular IL-4 and its mRNA, although there is no increasein the number of activated T cells with intracellular IL-4.In contrast, the age-associated decrease in IL-2 secretion isassociated with a significant decrease in the number of activatedT cells with intracellular IL-2. In vivo there is a similarage-associated change in the number of activated T cells withdetectable cytokine. The number of activated T cells with intracellularIL-4 is comparable in old and young mice, while the number ofactivated T cells with intracellular IL-2 is significantly decreasedin old compared with young mice. Of great interest is the factthat old mice continuously exposed to IL-2 In vivo followingthe transplantation of J558 cells expressing the transfectedIL-2 gene product have an increased number of splenic T cellswith intracellular IL-2 that equals the level of such cellsobserved in young mice. Most important, the effect of continuousIL-2 administration in vitro was stable as spleen cells fromold, IL-2-treated mice when stimulated in vitro with anti-CD3ehad a young-like pattern of both intracellular IL-2 and IL-4expression as well as IL-2 and IL-4 secretion following in vitroactivation. Thus, it appears that exposure of old mice to exogenousIL-2 can redress the age-associated imbalance in cytokine expressionin vivo and cytokine secretion in vitro.     

IL-4、IL-13蛋白表达及抗IL-4、IL-13人源单链抗体的筛选

目的:表达IL-4和IL-13蛋白,从人源单链抗体文库中分别筛选抗IL-4和抗IL-13单链抗体.方法:采用RT-PCR从健康志愿者外周血单核细胞(PBMC) mRNA中扩增IL-4和IL-13 cDNA;构建硫氧还蛋白融合表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定.以生物素化的IL-4和IL-13为抗原从前期构建的人源抗体文库中采用噬菌体展示技术分别筛选抗IL-4和抗IL-13人源单链抗体(scFv).结果:扩增的IL-4 cDNA大小为280 bp,表达的融合蛋白大小为27 kD左右.扩增的IL-13 cDNA大小为252 bp,表达的融合蛋白大小为25 kD左右.分别以生物素化的IL-4和IL-13蛋白为抗原,采用噬菌体展示技术对人源抗体文库进行3轮富集后,分别有大约37％的scFvs与IL-4有结合特性,有约27％的scFvs与IL-13有结合特性.筛选了4株分别与IL-4和IL-13结合能力强的单链抗体进行了Westem blot鉴定和测序.结论:成功筛选到抗IL-4和抗IL-13人源性单链抗体.     

IL-17/IL-17R与恶性肿瘤

IL-17是新近被确认的一种细胞因子,由T细胞、中性粒细胞等产生,其靶细胞分布广泛。IL-17具有强大的招募中性粒细胞、促进多种细胞释放炎性因子、促进细胞增殖的作用,被认为参与了机体多种炎症疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等的发生,本文就IL-17/IL-17R在肿瘤中的研究进展做一综述。     

IL-13对成纤维细胞IL-13受体和IL-4受体表达的影响

目的研究IL-13对人肺成纤维细胞株HFL-1和人肝星状细胞株LX-2 IL-13受体和IL-4受体表达的调节作用。方法 RT-PCR法检测HFL-1细胞株和LX-2细胞株IL-13Rα1、IL-4R和IL-13Rα2 mRNA的表达;凝胶电泳定量软件Image Tool2.0对RT-PCR电泳条带进行光密度分析;ELISA法检测HFL-1细胞株和LX-2细胞株分泌可溶型IL-13Rα2以及检测细胞裂解液总IL-13Rα1、IL-4R和IL-13Rα2含量。结果 IL-13(5～100 ng/ml)对HFL-1细胞株和LX-2细胞株表达IL-13Rα1和IL-4R无影响;IL-13为5、10、20 ng/ml时能诱导HFL-1细胞株表达IL-13Rα2并呈现剂量依赖,当IL-13为50 ng/ml时,对HFL-1细胞株IL-13Rα2表达的诱导作用明显减弱,IL-13 100 ng/ml组没有检测到HFL-1细胞株IL-13Rα2的表达;LX-2细胞株IL-13Rα2表达缺失且IL-13不能诱导LX-2细胞株表达IL-13Rα2。结论 IL-13不能上调人肺成纤维细胞株HFL-1和人肝星状细胞株LX-2表达功能型受体IL-13Rα1和IL-4R,表明IL-13不能通过上调IL-13Rα1和IL-4R表达量来放大自身作用;一定浓度的IL-13能诱导人肺成纤维细胞株HFL-1表达抑制型受体IL-13Rα2,表明IL-13的自身负调控。     

IL-10、IL-17及IL-18在肝细胞肝癌中的表达特点及其临床意义

目的 检测IL-10、IL-17及IL-18在肝细胞肝癌中的表达特点,为肝细胞肝癌的诊断与治疗提供实验依据.方法 采用RT-PCR方法检测肝癌以及癌旁组织中IL-10、IL-17及IL-18mRNA水平的表达,采用Western Blot、免疫组化方法检测肝癌以及癌旁组织中IL-10、IL-17及IL-18蛋白水平的表达;采用ELISA检测肝癌细胞株BEL-7402、HepG2中IL-10、IL-17及IL-18的释放水平.结果 IL-10、IL-17在肝癌组织及细胞株中高表达,与血清AFP检测结果呈正相关;IL-18在肝癌组织及细胞株中不表达或者少量表达,与血清AFP检测结果呈负相关.结论 IL-10、IL-17的过表达和IL-18的沉默与肝细胞肝癌的发生密切相关,IL-10、IL-17的过表达可作为肝细胞肝癌诊断的重要标志.     

脂多糖和金黄色葡萄球菌对IL-23、IL-12表达的调控

目的：检测脂多糖（LPS）和金黄色葡萄球菌（SAC）对人外周血单个核细胞（PBMC）IL-23和IL-12各亚基表达的调节作用并探索其作用机制。方法：用LPS和SAC直接刺激人PBMC，或用CD14抗体或p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂Mastoparan预处理PBMC后再予LPS和SAC刺激，半定量RT-PCR方法检测IL-23p19、IL-12p35和IL-12p40亚基的基因表达变化。结果：人PBMC组成性表达p19和p35，不表达p40。LPS和SAC可上调各亚基的表达。LPS诱导的IL-23和IL-12各亚基表达均需通过CDl4；CDl4仅部分参与SAC诱导的IL-12p40和p35表达上调，而与p19上调无关。LPS和SAC诱导的IL-23和IL-12各亚基表达均需要p38MAPK通路。结论：LPS和SAC刺激下IL-23和IL-12亚基表达及信号传导通路既有相似之处又有不同点，为单独或同时调控这两种因子的表达提供线索。     

IL-13和IL-4在哮喘发病中的作用及相互关系

目的　探讨IL 13在哮喘发病中的作用及其与IL 4的相互关系。方法　哮喘组 2 4例 ,男 17例 ,女 7例 ;健康对照组 2 4例 ,男 12例 ,女 12例。用ELISA法检测不同时段PBMC培养上清IL 13和IL 4水平及加IL 13单克隆抗体 (McAb)和IL 4McAb干预后PBMC培养上清IL 4、IL 12、IL 13和IFN γ水平。结果　 (1)IL 13动态变化 :①对照组PBMC培养 3d、5d、7d水平均较培养 1d水平高 ,差异有显著性 ,培养 3d的水平较培养 5d、7d的高 ,差异有显著性 ;②哮喘组PBMC培养 3d、5d、7d的水平均较培养 1d的水平高 ,差异有显著性 ,培养 5d的水平均较培养 3d、7d的水平高 ,但之间差异无显著性 ;③哮喘组PBMC培养 3d、5d、7d的IL 13水平均较对照组高 ,差异有显著性。 (2 )IL 4动态变化 :①对照组和哮喘组PBMC培养 1d后 ,IL 4水平明显上升 ,第 3天仍保持较高水平 ,第 5、7天明显下降 ;②哮喘组 1d、3d、5d和 7d水平均较对照组高 ,差异有显著性。 (3)IL 4McAb干预后 ,哮喘组和正常组IL 13水平与对应小鼠IgG组相比有显著性降低 ,哮喘组IFN γ水平与对应小鼠IgG组相比有显著性增高。 (4)IL 13McAb干预后IL 12水平在哮喘组和正常组均提高 ,与对应小鼠IgG组相比差异有显著性。 (5 )IL 13McAb和IL 4McAb联合干预后哮喘组I     

Cytokine-specific ELISPOT assay single cell analysis of IL-2, IL-4 and IL-6 producing cells

In order to assess cytokine-producing cells at the single cell level, the cytokine-specific ELISPOT assay has proven to be an important and sensitive method. The purpose of this study was to adapt this method to elucidate individual cells producing murine IL-2, IL-4 or IL-6. In order to establish these cytokine-specific ELISPOT assays, IL-2-, IL-4- and IL-6-specific cDNA transfected myeloma cell lines, e.g., X63-Ag8-653 X2, X63-Ag8-653 X4 and X63-Ag8-653 X6, respectively, were used as specific cytokine-producing cells. In the IL-2 ELISPOT assay, the coating reagent, monoclonal antibody (mAb) rat IgG2a anti-mouse IL-2 (CR #40014) was used while rabbit IgG polyclonal anti-mouse IL-2 was employed for detection of IL-2 spot forming cells (SFC). The mAbs anti-mouse IL-4, BVD4-1D11 and BVD6-24G2 were selected as capture and detection antibodies for enumeration of IL-4 SFC. For the IL-6 ELISPOT assay, anti-mouse IL-6 (MP5-20F3) mAb was used for coating and MP5-32C11 mAb was used for detection of IL-6 SFC. When IL-2 producing X63-Ag8-653 X2 cells were subjected to these three different ELISPOT assays, IL-2-specific SFC were only noted with the IL-2 ELISPOT system. In the case of IL-4 SFC, only X63-Ag8-653 X4 cells formed specific spots using the tandem of BVD4-1D11 and BVD6-24G2 mAbs. IL-6-specific spots developed in MP5-20F3 mAb pre-coated wells containing X63-Ag8-653 X6 cells, when developed with mAb anti-IL-6 (MP5-32C11). Addition of cycloheximide (50 μg/ml) inhibited formation of IL-2, IL-4 and IL-6 SFC by approximately 90%. When an unrelated mAb was used as detection antibody in these three different cytokine-specific ELISPOT assays, IL-2-, IL-4-and IL-6-specific SFC were not detected. Further, when concanavalin A stimulated T cells from Peyer's patch of normal mice were subjected to the respective cytokine-specific ELISPOT assay, IL-2, IL-4 and IL-6 SFC were enumerated. These results have shown that cytokine-specific IL-2, IL-4 and IL-6 ELISPOT assays have now been established and will allow analysis of the frequency of cytokine-secreting cells at the single cell level.