新生大鼠牙乳头细胞的体外培养和矿化特征

目的：观察体外培养的新生大鼠牙乳头细胞的生物学特征。方法：体外培养出生1d大鼠磨牙牙乳头细胞，进行组织学染色，透射扫描电镜观察。结果：体外培养的新生大鼠牙乳头细胞能形成细胞克隆，第3代细胞在含2mmol／L β-甘油磷酸钠、50mg／L抗坏血酸、10^-8moL/L地塞米松的培养液中培养7～8d后可呈现复层生长，培养14～16d后细胞结节中出现矿化，茜素红染色呈阳性反应；透射电镜观察细胞内出现大量含有致密小体的基质小泡样超微结构。结论：发育阶段较早的大鼠牙乳头细胞具有增殖和矿化能力。     

尼古丁对牙胚、牙乳头间充质细胞BMP分泌影响的体外研究

目的 :探讨尼古丁对体外鼠磨牙牙胚及牙乳头间充质细胞BMP分泌的影响。方法 :分别采用器官和细胞培养的方法体外培养牙胚和牙乳头细胞 ,在培养基和培养液中加入不同浓度的尼古丁 ,将 15d胎龄的胎鼠的下颌第一磨牙牙胚置于对照组和实验组RPMI - 16 4 0半固态培养基表面培养 4d ,人牙乳头细胞置于各组培养液中培养 3d ,之后分别制作常规组织切片和细胞爬片 ,免疫组化染色。结果 :实验组与对照组相比较 ,对照组牙胚和牙乳头细胞BMP阳性染色强于实验组 (P <0 .0 1,P <0 .0 5 )。结论 :尼古丁对体外培养胎鼠牙胚和人牙乳头细胞BMP的分泌存在抑制作用。     

牙胚细胞的分离培养

目的：分离培养牙胚细胞。方法：选择出生后（PN）8天的SD大鼠,从第一磨牙牙胚上撕脱牙囊和成釉器组织,切取牙胚颈部组织,剁离牙乳头组织,分别进行细胞培养,通过差速消化法分离符种牙胚细胞。结果：牙囊、牙乳头、成釉器和上皮根鞘细胞被分离纯化出来。结论：利用差速消化法可同时分离培养4种主要的牙胍细胞。     

猪牙乳头细胞的体外培养及生物学特性研究

目的:培养新生猪的牙乳头细胞,探讨其传代细胞的生物学特性。方法:选择刚出生1￣3d的新生猪,取出磨牙胚,分离牙乳头,用酶消化法培养猪牙乳头细胞,并用波形丝蛋白和细胞角蛋白鉴定细胞来源。观察细胞的生长规律,通过免疫组化染色检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、牙本质涎蛋白(DSP)等的表达情况。结果:猪牙乳头细胞在体外培养时生长良好,波形丝蛋白染色阳性而细胞角蛋白染色阴性,细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、DSP呈阳性表达。结论:通过酶消化法,可以体外扩增培养猪牙乳头细胞,细胞为间充质来源,其传代细胞在合成胶原及DSP的能力上与体内牙乳头细胞相似,提示猪牙乳头细胞可能具备作为牙髓-牙本质复合体再生研究种子细胞的潜能。     

钟状期牙胚来源的猪牙乳头细胞培养

目的 观察新生猪牙胚的发育情况并培养猪牙乳头细胞,对传代细胞的生物学特性进行研究.方法 选择3日龄新生猪,分离牙胚,通过组织学、免疫组化等研究牙胚的发育情况.分离牙乳头组织,酶消化法培养牙乳头细胞并鉴定;观察细胞生长特性,通过牙本质涎蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原免疫组化染色比较体内外细胞的生物学性状.结果 新生猪磨牙尚未萌出,其中第二磨牙为典型的钟状期牙胚.分离培养的牙乳头细胞在体外生长良好,经鉴定细胞来源于间充质组织,免疫组化表明,牙本质涎蛋白和Ⅰ型胶原表达阳性,Ⅲ型胶原表达阴性.结论 新生猪可以提供处于钟状期的牙胚,通过酶消化法可成功培养猪牙乳头细胞,第3代细胞的生物学特性与体内细胞有一定相似性,可用于进一步深入研究.     

大鼠牙乳头细胞旁分泌效应对巨噬细胞分泌炎症因子的调控作用

目的:研究大鼠牙乳头细胞(rat dental papilla cells,RDPCs)对LPS活化的巨噬细胞分泌免疫因子的影响.方法:分离SD大鼠牙胚,酶消化法原代培养牙乳头细胞并进行矿化诱导和成脂诱导,茜素红染色观察矿化结节形成.油红O染色观察脂滴形成.CCK8法检测大鼠牙乳头细胞条件培养基(rat dental papilla cells' conditioned medium,RDPC-CM)对巨噬细胞增殖能力的影响,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定RDPC-CM对巨噬细胞分泌炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的影响,Griess reagent法检测RDPC-CM对巨噬细胞分泌炎症因子NO的影响.采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:原代培养24 h后,大鼠牙乳头细胞从组织块中爬出,传代后可得到纯化大鼠牙乳头细胞;茜素红染色见矿化诱导组中出现散在的红色矿化结节;油红O染色后可见经成脂诱导的牙乳头细胞中脂滴形成;CCK8结果表明,RDPC-CM对巨噬细胞增殖能力无影响;ELISA结果显示,大鼠牙乳头细胞条件培养基可对LPS活化巨噬细胞分泌细胞因子产生作用,表现为条件培养基作用于巨噬细胞24h可减少细胞分泌TNF-α,而对IL-1β和IL-6分泌无影响;Griess reagent法结果显示,RDPC-CM对LPS活化的巨噬细胞分泌NO无影响.结论:大鼠牙乳头细胞条件培养基作用于LPS活化的巨噬细胞,可使巨噬细胞分泌TNF-α下降,提示牙乳头细胞具有一定的免疫调控作用.     

体外诱导培养大鼠牙乳头细胞碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的表达

目的:观察体外诱导培养的大鼠牙乳头细胞碱性磷酸酶和I型胶原蛋白合成的变化。方法:原代培养法获得大鼠牙乳头细胞,在条件培养基中进行诱导培养,在不同时间进行钙结节染色,ALP染色和定量测定,ELISA法和RT-PCR法测定细胞I型胶原蛋白的量和mRNA表达水平。结果:体外诱导培养的大鼠牙乳头细胞形成含钙化物的细胞结节,体外培养至12d的诱导组细胞ALP高于对照组(P<0.05),细胞内I型胶原表达量高于对照组(P<0.05),且I型胶原mRNA表达水平上调(P<0.05);培养15d后诱导组细胞分泌的I型胶原高于对照组(P<0.05)。结论:大鼠牙乳头细胞在体外分化的过程中碱性磷酸酶活性明显增高,矿化能力增强,并不断合成和分泌I型胶原形成胞外基质。     

氯离子通道CLC-3在小鼠牙胚发育中的表达

目的:探讨CLC-3在BALB/c小鼠下颌第一磨牙牙胚不同发育时期的时空表达。方法:选取E13.5、E15.5、E18.5 d的BALB/c胎鼠和P1、P5 d的BALB/c小鼠,脱颈处死后取其头部,梯度乙醇脱水,石蜡包埋后连续切片,最后对石蜡切片行CLC-3免疫组化染色。结果:当胎鼠牙胚处于蕾状期时,CLC-3在牙胚的牙板上皮中可见表达;当牙胚发育为帽状期时,在牙乳头和牙囊细胞中表达;到钟状期时,CLC-3在牙乳头、牙囊、星网状层细胞和中间层细胞中广泛表达。出生后的小鼠CLC-3在牙乳头、牙囊、成釉细胞、成牙本质细胞、星网状层细胞、中间层细胞中均广泛表达。结论:CLC-3在小鼠牙胚发育的不同时期呈现不同的时空表达。     

氟对体外培养人牙乳头细胞分泌I型胶原的影响

目的　了解氟对体外培养人牙乳头细胞分泌I型胶原的影响。方法　对人牙乳头细胞体外培养 ,分别给予 0 .0 g/L、0 .2× 10 -6g/L、1.0× 10 6g/L、5 .0× 10 6g/L、2 5 .0× 10 -6g/L氟处理 ,采用Westernblot方法分析氟对细胞培养外I型胶原的影响。结果　体外培养的人牙乳头细胞合成Ⅰ型胶原可以分泌Ⅰ型胶原。 0 .0g/L、0 .2× 10 -6g/L、1.0× 10 6g/L、5 .0× 10 6g/L氟对细胞外Ⅰ型胶原量无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;2 5 .0× 10 -6g/L氟处理组细胞外I型胶原量较其它组高 (P <0 .0 5 )。结论　过量氟可能抑制细胞外I型胶原降解     

大鼠牙乳头与成釉器重组肾被膜下种植的研究

目的：观察大鼠牙乳头对成釉器上皮的诱导作用。方法：出生后7dSD大鼠下颌第一磨牙根部的牙乳头与出生后2d的第二磨牙成釉器分别重组，出生后2d冠部牙乳头与成釉器重组为对照组。体外培养2d后种植于成年大鼠肾被膜下，1周，4周后取材，组织学观察上皮分化情况和硬组织形成情况。结果：1周后实验组重组体生成薄层的牙本质结构，内侧成牙本质细胞排列整齐，牙源性上皮未分化成成釉细胞，而有大量的骨样物质生成，对照组形成较为完整的牙冠结构。4周后，实验组重组体形成类牙根形态但仍无釉质形成。结论：根部牙乳头不具有促进成釉上皮分化的能力。     

人牙乳头细胞体外矿化特征及其分化表型的表达

目的：观察人牙乳头细胞体外矿化特征。方法：组织块法培养人牙乳头细胞,取第三代细于矿化液中长期培养,检测不同培养时间细胞碱性磷酸酶（alkaline phospha tase,ALP)活性,骨钙素（osteocalcin,OC)活性,且倒置显微镜观察细胞生长。结果：体外培养的牙乳头细胞呈现以下表现特征：复层增长,胞外基质分泌与矿化结节形成。在β-GP和L－抗坏血酸存在条件下培养第14天细胞内ALP活性开始升高而OC在21d才开始升高,有细胞外基质分泌,但未见矿化。35d产生特异性牙本质矿化结节。42天以后,OC、ALP活性降低。结论：培养的人牙乳头细胞具有成牙本质细胞某些表型,可在体外形成牙本质或牙本质样矿化物质,可作为研究牙本质形成机制的实验模型。     

褪黑素对大鼠牙乳头细胞和牙齿发育的影响

目的 研究褪黑素(MT)对大鼠牙乳头细胞及牙齿发育的影响.方法 新生鼠牙乳头细胞的分离培养与鉴定,应用免疫组化检测培养第4代牙乳头细胞褪黑素MT1、MT2受体,四唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度褪黑素对牙乳头细胞增殖的变化,双荧光标记检测褪黑素对SD新生大鼠牙本质生长情况的影响.结果 培养第4代牙乳头细胞存在MT1受体,主要分布于细胞膜、细胞浆和细胞核周围,呈棕黄色阳性颗粒,而MT2受体呈阴性;MTT法检测吸光度(A)值,高浓度MT组明显小于对照组(P<0.05);荧光标记检测10天牙本质生长距离褪黑素组明显小于对照组(P<0.05).结论 褪黑素能够明显抑制牙乳头细胞的增殖,对牙本质生长的早期发育起抑制作用.     

Mineralized nodule formation by human dental papilla cells in culture

Human dental papilla cells were enzymatically separated from deciduous tooth germs of an 8-month-old embryo legally aborted. the second passage cells were cultured up to 35 days in 3 groups. The β-gp group was cultured in the Dulbecco MEM containing ascorbic acie and β-glycerophosphate supplemented with 15% fetal bovine serum. The Dex group was in the same medium, in addition containing dexamethasone. The Control group contained none of the 3 chemicals, Mineralized nodules were formed after 15 days in the β-GP and Dex groups. Only in the presence of ascorbic acid and organic phosphate did they mineralize. The addition of dexamethasone caused a significant increase in the number of nodules. By electron microscopy, the nodules contained needle-shaped crystals associated with a network of collagen fibrils. Calcium and phosphorus were detected by energy-dispersive X-ray diffiractometry. Cells showed high levels of alkaline phosphatase activity, which was increased 2∼3 times in the presence of the 3 chemicals. These results indicated that human dental papilla cells have the ability to from dentin in culture. The formation of mineralized nodules by human dental papilla in vitro provides a useful model for studying the morphogenesis and differentiation of dental papilla cctomesenchyme.     

人类牙乳头细胞的体外培养及细胞生物学性状研究

目的　体外分离培养人类牙乳头细胞,并对传代细胞的生物学特性进行研究。方法　选择3~4月胎龄 的自然流产人胚胎,分离牙乳头,组织块法培养人类牙乳头细胞并鉴定。观察细胞的生长特性,经Ⅰ型胶原、纤维 粘连蛋白和层粘连蛋白免疫细胞化学染色及细胞矿化诱导后的钙盐染色对细胞的生物学性状进行研究。结果　 分离培养的人类牙乳头细胞在体外生长良好,细胞及分泌基质中的Ⅰ型胶原、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白表达阳 性。将培养细胞行矿化诱导后,细胞可形成钙化基质。结论　通过机械分离及贴壁法可获得人类牙乳头细胞,其 传代细胞在基质形成和矿化能力方面与体内人牙乳头细胞有相似性,有潜力作为牙组织工程的种子细胞。     

Dental papilla cells synthesize but do not deposit fibronectin in culture

The dental papilla cells play a major regulatory role during tooth morphogenesis, and they are the only mesenchymal cells capable of differentiating into odontoblasts secreting dentin. In this paper, we have extended our studies on the behavior of cultured dental papilla cells which have been disaggregated from 17-day mouse embryo teeth. Quite unexpectedly, we observed that these cells, which in vivo are embedded in a fibronectin-rich extracellular matrix, lose all surface-associated fibronectin when cultured as monolayers. Fibronectin was, however, detected intracellularly, and metabolic labeling and immunoprecipitation studies indicated that the dental papilla cells continued to synthesize fibronectin in culture. Furthermore, when purified plasma fibronectin was added at 50 micrograms/mL to the culture medium, it became incorporated as fibrillar matrix on the surfaces of dental papilla cells. This indicates that the cells are not deficient in cell-surface receptors or other surface-associated molecules which bind fibronectin. When pieces of dental papillae were cultured as explants, an abundant matrix containing fibronectin was deposited on their surfaces. This matrix was gradually lost as the cells migrated from the explants. Furthermore, when the cells were disaggregated and cultured at high cell density, the cells in the central area of the pellet were covered by fibronectin containing fibrillar structures which were lost as the cells spread out. This indicates that the maintenance of close contacts between the dental papilla cells is required for the assembly of fibronectin into the extracellular matrix.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

牛血浆纤维粘连蛋白对培养的鼠牙乳头组织的影响

目的观察牛血浆纤维粘连蛋白（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，ＦＮ）对牙乳头组织及细胞的作用。方法对大鼠牙乳头和牙胚组织进行器官培养，实验组将微孔滤膜用８０ｍｇ／ＬＦＮ液浸润２ｈ，然后将牙乳头组织置薄膜上培养３、６天，同时设对照组，牙胚培养３、６、９天，常规组织学染色。结果牙胚在体外可有成牙本质细胞分化和前期牙本质的形成。实验组于牙乳头组织和滤膜交界处出现极化细胞，而对照组则未出现上述现象。结论ＦＮ参与了成牙本质细胞的极化过程。     

1稳定表达cbfa1的人牙乳头细胞模型的建立和鉴定

目的 :建立能稳定表达核心结合因子a1(cbfa1)的人牙乳头细胞模型。方法 :体外培养人牙乳头细胞 ,脂质体法转染重组质粒 ,G418筛选抗性克隆 ,并从基因 (原位杂交和RT -PCR)和蛋白水平 (免疫组化和westernblot)进行鉴定。结果 :共获得三个G418抗性克隆 ,其中PC -3克隆能够稳定表达cbfa1基因和蛋白。结论 :成功建立了稳定表达核心结合因子a1的人牙乳头细胞模型PC -3。     

大鼠牙囊细胞体外培养技术的建立及其鉴定

目的　建立体外培养大鼠牙囊细胞的方法,观察牙囊细胞体外生长的生物学特性。方法　分离乳鼠下颌第一、第二磨牙牙胚的牙囊组织,应用组织培养的方法进行牙囊细胞原代和传代培养。显微镜观察培养细胞的形态,电镜观察体内牙囊组织和体外培养的牙囊细胞的超微结构。免疫组化法检测细胞波形蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结果　分离组织培养24 h后,梭形细胞和多角形细胞从组织块中游出,经消化排除法获得纯化的牙囊细胞。显微镜下牙囊细胞为成纤维细胞样,电镜下牙囊细胞无桥粒,胞浆中含有高密度电子颗粒和大量粗面内质网(RER)。免疫组化染色显示牙囊细胞表达波形蛋白、Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白。结论　运用组织培养和细胞生物学技术可以成功获得原代和传代培养的大鼠牙囊细胞,体外培养的细胞具有与正常大鼠牙囊细胞相一致的生物学特性。