小鼠β2m基因打靶载体的构建及序列分析

目的 采用分子生物学技术，构建小鼠β2m基因打靶载体，为进一步进行胚胎干细胞基因敲除、建立β2m基因缺陷型干细胞奠定基础。方法 通过设计和合成引物，经PCR从小鼠β2m-pSV2ΔHXgpt基因组克隆分别扩增小鼠β2m的4.2kb和0.8kb片段作为同源臂，将其分别插入载体pPNT的neo基因两侧，构建小鼠β2m基因替换型打靶载体pPNT-β2m。结果 经过PCR、限制性酶酶切鉴定，以及DNA序列分析，证实此两条同源臂为包含小鼠β2m前三个外显子在内的基因片段，证明载体构建成功。结论 PCR法构建基因打靶载体是新颖、简便而可靠的方法。     

小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶载体的构建

目的 构建用于小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶的载体,为产生Znf230基因敲除的小鼠模型准备条件.方法 设计和合成引物,经PCR从小鼠的基因组中扩增出5'同源臂、3'同源臂及锚定序列,长度分别为4,4,1 kb的片段,反向插入pBS载体的neo基因的两侧,从而构建小鼠Znf230条件基因打靶载体Znf230-pBS(5).结果 经过限制性内切酶及DNA测序鉴定,证实该条件基因打靶载体含有的同源序列与Genebank公布的基因序列一致,表明载体构建成功.结论 PCR技术和定向克隆技术是构建条件基因打靶载体简单而可靠的方法.运用该技术可获得小鼠锌指蛋白基因Znf230的条件基因打靶载体.     

Brevican基因敲除小鼠的制备

目的制备brevican基因敲除小鼠。方法采用ET克隆方法,构建brevican打靶载体。线性化打靶载体,电转化胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),将正确同源重组的ES细胞注射入囊胚腔,生育嵌合体,再交配繁育杂合子及纯合子。PCR法鉴定小鼠的基因型。结果将PGK启动子指导的NEO表达框敲进Bcan第3外显子,敲除第3～8外显子序列,得到打靶载体,上游臂为2.4 kb,下游臂为4.8 kb。基因打靶后,得到双臂均发生正确同源重组的克隆数14个。利用阳性ES细胞克隆注射入囊胚,得到3只嵌合率大于50%的雄鼠,繁育得到6只Brevican-/-纯合子小鼠。结论利用同源重组方法,成功敲除干细胞靶基因,建立Brevican-/-建系小鼠。     

LTC4合酶基因敲除靶向载体的构建

目的:构建鼠LTC4合酶基因靶向敲除载体,用于转染鼠胚胎干细胞,建立LTC4合酶基因敲除鼠。方法:分离、克隆LTC4合酶基因的1.85kb和1.35kb片段,作为靶向载体的5'同源臂和3'同源臂,重组到pJNS2载体中,筛选鉴定阳性重组子。结果:构建的靶向载体由5'同源臂-Neo-3'同源臂-hTk-pJNS2构成。结论:经DNA测序及限制性酶切鉴定分析,该构建载体结构及序列正确,可用于转化鼠胚胎干细胞。     

成体兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的打靶研究

目的构建兔HPRT基因打靶载体。方法在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HGPR乃基因BAC克隆（LBNL1—304M19）的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12．5kb无启动子的HGPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS-HGPRT质粒。然后基于pKS-HGPRT和pEGFP—C1-SD1211质粒,构建了含有绿色荧光蛋白（GFP）及新霉素（neo）筛选标记基因的打靶载体pKS-HGPRT-GFP—neo。结果将线性化的打靶载体通过脂质体转染的方法整合到成体兔成纤维细胞基因组中,利用G418及6-TG进行细胞克隆的抗药物筛选,共得到抗性细胞克隆20个。对细胞克隆进行PCR及测序初步鉴定,获得8个发生同源重组的细胞克隆,还需利用Southern blotting做进一步验证。结论成功快速地构建了且PR丁基因敲除型打靶载体,为下一步进行体细胞核移植制备HGPRT基因敲除转基因克隆兔奠定基础。     

小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶基因打靶载体的构建及鉴定

目的：对牙釉质丝氨酸蛋白酶（EMSP1）基因 进行体外扩增，构建基因打靶载体，利用基因打靶技术建立转基因动物模型，研究EMSP1生理功能和病理学意义。方法：根据EMSP1的DNA序列，采用Oligo 6.0软件设计两对引物，以129品系小鼠基因组DNA为模板，分别扩增长为5 000 bp和1 700 bp片段作为同源长短臂。将其分插入通用型基因敲除载体pSSC-9的正向筛选基因neo两侧，用PCR方法、限制性酶切DNA 序列分析进行鉴定。结果：采用双酶切鉴定，阳性重组克隆分别切出5000 bp和1700 bp片段，表明长短臂已克隆于载体中。DNA序列分析表明，成功构建 EMSP1基因打靶载体pSSC-9- EMSP1。结论：成功构建小鼠EMSP1基因打靶载体。     

小鼠MPI基因的打靶载体的构建和筛选

目的　构建小鼠MPI基因的基因打靶载体转染ES细胞 ,构建用于同源重组筛选的对照载体。方法根据计算机分析小鼠MPI基因的基因组序列 ,构建用于同源重组载体的长臂和短臂并且转染小鼠ES细胞 ,经抗性筛选后得到阳性克隆 ,抽提基因组DNA后用PCR的方法进行重组子的初步筛选。结果　成功构建了MPI基因的基因打靶载体并且摸索了用PCR的方法进行重组细胞初步筛选的方法。结论　这个载体的构建为MPI基因功能的研究打下了基础 ,同时用PCR方法进行初步筛选大大减少了Southern杂交的工作量 ;利用实验小鼠来研究印迹基因是非常有效的方法 ,它不仅能了解印迹基因在小鼠生长发育过程中的功能 ,而且进而有助于研究人的相应印迹区。     

利用PCR产物快速构建兔HPRT 基因无启动子打靶载体

目的 探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法,为下一步获得兔 HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础.方法 首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12.5 kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS-rHPRT质粒.然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒,通过PCR的方法获得两个不同的带有50 bp HPRT 基因同源序列的IRES-eGFPCre-Frt/Neo/Frt同源重组片段,最终构建 HPRT 基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体.结果 PCR、限制性内切酶及DNA序列测定,表明载体构建成功.结论 成功快速地构建了HPRT 基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体.同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究.     

西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因5'侧序列通用表达载体的构建

目的: 检测β-酪蛋白基因5′侧序列的启动BglⅡ效果及构建真核表达载体pcDNA3.1-65.方法: 采用SalⅠ和BamHⅠ对pMD-T/65双酶切,得到6465 bp的β-酪蛋白基因5′侧序列;将启动子片段插入到XhoⅠ和BglⅡ双酶切后的pGL3-Basic载体里;获得重组报告基因载体pGL3-B65.瞬时转染西农萨能奶山羊原代培养的乳腺上皮细胞,检测β-酪蛋白基因5′侧序列的启动效果.将β-酪蛋白基因5′侧序列插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的XhoⅠ和BamHⅠ位点之间,从而获得载体pcDNA3.1-65.结果: 长度为6465 bp的β-酪蛋白基因5′侧序列能有效地启动荧光素酶报告基因,并正确构建了真核表达载体pcDNA3.1-65.结论: 克隆的β-酪蛋白基因5′侧序列在转录水平上具有生物学功能,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了坚实的基础.     

Raji 细胞基因组文库的构建与筛选

目的:构建Raji细胞基因组文库,用EBV DNA探针对文库进行筛选.方法:Raji细胞基因组DNA经Bam HI酶切消化后,低熔点琼脂糖回收9～23 kb的酶切DNA片段,通过匹配黏性末端与磷酸化的Lambda DASH Ⅱ Bam HI酶切载体臂连接,在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体,测定原始文库与扩增文库的滴度,用同位素标记的EBV DNA探针对Raji细胞基因组文库进行筛选.结果:Raji细胞原始文库与扩增文库的滴度分别为1.8×105和2.8×108 pfu/mL.文库经筛选获得4个阳性克隆,随机挑取1个阳性克隆稀释后铺平板作进一步杂交鉴定,发现所有噬菌斑均有杂交信号,证明该克隆确为阳性克隆.抽提该阳性克隆DNA,进行BarnHI酶切鉴定,证实插入片段的长度为8.5 kb.经测序、BLAST序列比对,结果显示插入片段一侧为EBV Bam HI W片段,另一侧与人类15号染色体RP11-665A22克隆高度同源.结论:Raji细胞基因组文库的成功构建,为进一步克隆包含EBV整合位点的细胞基因组序列、探讨EBV整合参与肿瘤发生发展的分子机制奠定了基础.     

金黄色葡萄球菌酚溶调控蛋白α小肽敲除对自溶素AtlA蛋白表达的影响

目的 利用同源重组技术构建金黄色葡萄球菌Newman psmα基因缺失突变株,探究psmα缺失对金黄色葡萄球菌蛋白表达的影响.方法 分别扩增psmα基因的上下游同源臂,根据同源重组原理,构建pBT2基因打靶载体,利用同源重组技术,构建psmα缺失的Newman突变株.并对野生株和突变株培养上清蛋白进行研究.结果 突变株培养上清中一个相对分子质量约为135×103的蛋白表达水平较野生株明显减少甚至缺失;质谱分析提示该蛋白为金黄色葡萄球菌atlA基因编码的双功能自溶素前体蛋白(AtlA蛋白);实时荧光定量PCR结果显示psmα基因敲除株atlA基因的转录水平较野生株显著降低.结论 psmα缺失后能够降低atlA基因的转录表达水平.     

低氧诱导因子-1α条件性敲除载体的构建

目的通过建立低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)条件性敲除载体,并在体外验证引入的LoxP介导的同源重组等情况,为最终建立HIF-1α条件性敲除小鼠模型奠定基础.方法以含有neo、tk基因的pLoxPneo载体为基本骨架,用涵盖3、4、5、6号外显子的HIF-1α基因组片段(7.6kb)为构建载体的同源DNA片段,通过引入LoxP等步骤,最终建立旨在条件性敲除HIF-1α第5号外显子的条件性敲除载体.结果经酶切,测序和在体外细菌中用cre介导的重组等方法证明成功地构建了HIF-1α的条件性敲除载体.结论成功地构建了HIF-1α的条件性敲除载体,为今后进一步获得HIF-1α条件性敲除小鼠打下了基础.     

携带人TGF-β1腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人转化生长因子β1(hTGF-β1)的腺病毒载体(Adeno-hTGF-β1),为hTGF-β1基因转染骨髓间质干细胞(BMSCs)的研究奠定基础.方法 应用基因重组技术构建hTGF-β1腺病毒表达载体,分别用限制性内切酶酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene 6介导腺病毒DNA转染293细胞.结果 重组hTGF-β1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoⅠ酶切后,得到14.5、8.1、4.2、4.0、2.5、1.4、0.6 kb片段.与空白腺病毒相比,5.6 kb的片段已被置换成4.2 kb和4.0 kb片段;经PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切后,得到32.6 kb和2.6 kb含目的基因片段,片段大小无误,表明重组Adeno-hTGF-β1腺病毒表达系统构建成功.以重组Adeno-hTGF-β1DNA为模板的PCR产物中出现1.35 kb hTGF-β1目的基因片段,表明hTGF-β1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中.重组hTGF-β1腺病毒表达载体通过Fugene 6 介导转染293 包装细胞出现细胞病变效应(CPE).采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒,证实扩增出247 bp的hTGF-β1目的基因片断和312 bp的腺病毒骨架基因片断.结论 携带人hTGF-β1的腺病毒载体的构建成功,并能在293细胞包装,为hTGF-β1基因转染的BMSCs在软骨组织工程中的应用奠定了基础.     

利用PCR产物快速构建免HPRT基因无启动子打靶载体

目的探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法,为下一步获得兔HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础。方法首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT）基因BAC克隆（LBNL1-304M19）的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12．5kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS—rHPRT质粒。然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒,通过PCR的方法获得两个不同的带有50bp HPRT基因同源序列的IRES-eGFPCre—Frt／Neo／Frt同源重组片段,最终构建HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。结果PCR、限制性内切酶及DNA序列测定,表明载体构建成功。结论成功快速地构建了HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究。     

骨骼肌特异性表达猪FSⅠ-Ⅰ转基因猪胚胎成纤维细胞克隆的构建与鉴定

目的：构建骨骼肌特异性表达猪FSⅠ-Ⅰ真核表达载体,转染猪胚胎成纤维细胞并筛选整合有FSⅠ-Ⅰ基因的细胞克隆,为研究FSⅠ-Ⅰ对猪骨骼肌的影响奠定基础。方法：通过RT-PCR方法从猪骨骼肌中扩增FS A（包含FS N端和结构域FSⅠ）和结构域FSⅠ;利用PCR方法分别从鼠基因组、人血液基因组和pcDNA3.1（+）载体上扩增出MCK增强子、ACTA 1启动子和BGHpolyA。将上述4个片段分别连接到真核表达载体pGKneotpAlox2上,构建骨骼肌特异性表达FSⅠ-Ⅰ（包含FS N端和2个连续FSⅠ结构域）的载体pGK-MCK-ACTA 1-FSⅠ-Ⅰ-BGHpolyA;用FuGENE
R　HD转染猪胚胎成纤维细胞,经药物G418筛选和PCR鉴定阳性克隆。 结果：成功构建骨骼肌特异性表达猪FSⅠ-Ⅰ的表达载体pGK-MCK-ACTA1 promoter-FSⅠ-Ⅰ-BGHpolyA,并成功整合到猪胚胎成纤维细胞的基因组中,获得了整合有目的基因FSⅠ-Ⅰ的猪胚胎成纤维细胞克隆。结论：获得了骨骼肌特异性表达猪FSⅠ-Ⅰ的猪胚胎成纤维细胞克隆,为通过核移植方法获得表达FSⅠ-Ⅰ转基因猪提供了供体细胞。     

CRISPR-Cas9基因编辑报道系统应用于AAVS1安全港的定点整合

摘要:目的 利用ZFN 与 TALEN 基因编辑以及同源重组技术将 Cas9表达框、基因编辑效率荧光报道系统以及真 核细胞筛选标记的 DNA 超长片段定点插入 HEK-293T 细胞基因组 AAVS1安全港,建立可用于衡量 CRISPR-Cas9基 因编辑的稳定 细 胞 株。方 法 利 用 分 子 克 隆 技 术 构 建 AAVS1-all-in-one-CRISPR 质 粒。利 用 脂 质 体 将 识 别 并 切 割 AAVS1基因组序列的ZFN 和 TALEN 质粒以及 AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒共转染入 HEK-293T细胞。使用嘌呤 霉素筛选获得单克隆细胞后,利用杀稻瘟菌素S筛选、红色荧光检测、Cas9 Westernblot以及基因组 PCR 鉴定等方法获 得 CRISPR-Cas9基因编辑报道系统完整整合入 AAVS1安全港的稳定细胞株。继而,将 EGFP修复模板单链 DNA 及 EGFPsgRNA 瞬时转染入这些稳定细胞株,对失去荧光的 EGFP进行基因编辑,恢复其发光功能,并通过荧光检测技术 验证基因编辑结果。结果 成功获得3株同时具有嘌呤霉素和杀稻瘟菌素 S抗性以及表达红色荧光蛋白的单克隆细 胞,Westernblot证实其成功表达 Cas9蛋白,基因组 PCR 鉴定目的基因成功整合入基因组 AAVS1位点。经 EGFP基 因编辑后,细胞恢复绿色荧光。结论 利用 ZFN 与 TALEN 将完整的 CRISPR-Cas9基因编辑报道系统成功整合入 HEK-293T细胞基因组的 AAVS1安全港,整合 DNA 片段长度达11.5kb,并利用 Cas9成功编辑 EGFP报道基因。     

伤寒沙门菌fljB∶∶lacZ变异株的制备

目的:为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fljB的表达调节机制,建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)插入变异株。方法:采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接KpnⅠ和SalⅠ的特异性引物,用PCR扩增获得fljB基因的上、下游同源性DNA片段,并与用KpnⅠ和SalⅠ酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体(pSV-β-galactosidase vector)的片段定向连接,将连接片段克隆至自杀质粒pGMB151,再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌,在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果:经筛选获得阳性克隆,经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763 bp被3550 bp的lacZ片段替代。结论:成功构建伤寒沙门菌flj∶∶lacZ突变株,为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。