G3BP单克隆抗体制备及G3BP在肿瘤组织中表达的检测

目的为了研究G3BP(Ras-GAP SH3-binding protein)的功能及作用机制,采用原核表达G3BP蛋白诱导免疫,制备抗G3BP单克隆抗体,并检测G3BP在临床常见肿瘤中的表达情况。方法采用原核表达载体pGEX-5X1,通过IPTG诱导,使用大肠杆菌BL21,高质量表达GST—G3BP融合蛋白。将纯化后的原核表达蛋白注射BAILB／c小鼠诱导产生免疫应答,采用经典杂交瘤技术制备单克隆抗体,并应用酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白免疫印迹和免疫组织化学染色ABC法进行抗体鉴定和肿瘤检测。结果筛选出分泌抗G3BP抗体的单克隆杂交瘤细胞,免疫球蛋白亚类鉴定为IgG1,蛋白免疫印迹及抗原竞争抑制实验表明该抗体是特异性抗G3BP抗体。石蜡切片免疫组织化学法检测临床标本,在肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌等临床肿瘤活检标本中检出G3BP表达明显增高。在乳腺癌临床组织标本中,G3BP表达水平与c-erbB2表达正相关,与淋巴结转移正相关。结论成功制备了抗人G3BP单克隆抗体,所得到的特异性G3BP单克隆抗体能够应用于ELISA、Western蛋白免疫印迹以及免疫组织化学染色对不同样本的G3BP表达水平进行检测。G3BP在肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中表达明显增高。G3BP有可能作为肿瘤标志物辅助对乳腺癌预后的判断。     

人TEM7膜外段单克隆抗体的制备及其在不同来源肿瘤组织中的定位研究

目的　利用制备的抗人肿瘤血管内皮标志物 7(TEM7)单克隆抗体通过免疫组织化学的方法 ,检测TEM7蛋白在不同来源的肿瘤组织中的定位 ,为以TEM7为靶标的肿瘤血管导向治疗提供必要的理论基础。方法　利用PCR的方法 ,将TEM7膜外段重组到原核表达载体pET 32b中 ,在大肠杆菌中表达 ,蛋白经离子吸附层析纯化后免疫雌性BALB/c小鼠 ,传统的杂交瘤融合技术制备鼠抗人TEM7膜外段单克隆抗体。以酶联免疫吸附实验 (ELISA)、Westernblot筛选及鉴定分泌特异性抗人TEM7膜外段单克隆抗体的杂交瘤细胞株。最后采用免疫组织化学ABC的方法 ,分别对不同来源的70例肿瘤组织及癌旁正常组织进行了TEM7蛋白定位的研究。结果　制备了抗人TEM7单克隆抗体 ,经过Westernblot鉴定具有高度的特异性。对肿瘤及癌旁正常组织免疫组织化学ABC染色的结果可见TEM7蛋白定位于 :大肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌和前列腺癌的血管内皮细胞 ;大肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌和肝细胞癌的肿瘤细胞 ;大肠癌、胃癌和乳腺癌的血管平滑肌细胞 ;胃癌的胃壁平滑肌细胞 ;肝细胞癌的胆管上皮细胞。结论　成功制备了特异性抗人TEM7膜外段的单克隆抗体 ;TEM7在肿瘤组织中并非特异性地表达于肿瘤血管内皮细胞 ,还可见于肿瘤组织的癌细胞、血管平滑     

人端粒酶hTERT抗体制备、鉴定及在肿瘤检测中的应用

目的：人端粒酶蛋白亚基（hTERT）单克隆抗体制备及肿瘤检测应用。方法：利用多肽固相合成法（Fmoc法）合成hTERT抗原多肽,免疫BALB／c小鼠,以杂交瘤法制备单克隆抗体。应用ELISA,Western blot和免疫组织化学ABC法进行鉴定和肿瘤检测。结果：经合成得到hTERT抗原多肽hTERT9,免疫小鼠及细胞融合后得到抗hTERT9杂交瘤细胞;经３次有限稀释法及ELISA筛选获得抗hTERT9单克隆抗体的杂交瘤细胞H4、G8和A11;H4、G8为IgM类,而A11为IgG1。半抗原竞争性抑制实验证明为hTERT9特异性单克隆抗体;相对亲和力实验发现G8株亲和力较H4株和A11株强。用H4及G8株单克隆抗体检测HeLa、293细胞,免疫印迹有特异相对分子质量≈123000hTERT条带,免疫组织化学显示为细胞核着色,而正常细胞2BS无阳性反应。免疫组织化学方法检测人癌组织、癌前病变、良性病变hTERT表达发现：人肿瘤组织细胞阳性率为80．31％（102／127）,且大多为中度阳性和强阳性;癌前病变中,hTERT有17．5％（7／40）弱阳性;良性肿瘤均为阴性。统计学分析表明：hTERT在癌组织的表达显著高于癌前及良性病变（P＜0．01）。结论：通过固相合成hTERT抗原多肽和杂交瘤技术成功制备抗人端粒酶蛋白亚基hTERT单克隆抗体,并能运用于免疫印迹、免疫组织化学对癌细胞及组织的hTERT表达检测。     

人肿瘤转移抑制基因1转染对人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生物学行为的影响

目的研究人肿瘤转移抑制基因1（TMSG-1）转染引起人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生物学行为的改变及对肿瘤转移表型的影响。方法构建TMSG-1全长编码序列真核表达载体,稳定转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞系,G418筛选挑取TMSG-1过表达阳性克隆。通过MTT比色实验、软琼脂集落形成实验检测体外细胞生长能力;Matrige1穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力。TMSG-1瞬时转染24、48h,分别用Annexin-V碘化丙啶（PI）双标流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况。结果从稳定转染TMSG-1的MDA-MB-231细胞中挑取3个TMSG-1-FLAG融合蛋白表达量较高的阳性克隆株用于下游生物学行为实验。M1Tr比色实验及软琼脂集落形成实验结果显示,TMSG-1正义转染各组（S1、S2、S3）细胞增殖速度及克隆形成数与未转染组及转染空载体组相比均明显减低（P〈0．05）;Matrigel穿膜实验显示,正义转染各组的穿膜细胞数[（72．3±8．1）个、（85．0±4．2）个、（73．5±7．8）个]与未转染组[（187．5±2．1）个]和转染空载体组[（162。3±6．8）个]相比均明显减少（P〈0．01）。TMSG．1瞬时转染MDA．MB-231细胞,转染24和48h均可引起细胞凋亡率的增加（P〈0．05）。结论TMSG．1表达上调可使人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外生长速度、锚着不依赖性生长能力及侵袭能力明显降低,细胞凋亡增加。该实验为TMSG-1是一个新发现的肿瘤转移抑制基因提供了证据。     

人精子细胞膜结合型透明质酸酶在乳腺癌的表达及临床病理意义

目的 研究人精子细胞膜结合型透明质酸酶(PH20)在人原发、转移乳腺癌中的蛋白及mRNA表达,探讨其在肿瘤转移中的作用。方法 合成两个高抗原性人PH20多肽,免疫于兔皮下,检测、鉴定、纯化抗PH20抗体。应用免疫组织化学抗生物素蛋白-生物素复合物(ABC)法检测53例乳腺癌原发及淋巴结转移灶PH20的表达;Western印迹法检测5例新鲜乳腺癌组织PH20的表达。合成两条PH20寡核苷酸探针,应用原位杂交检测乳腺组织芯片,包括28例乳腺癌组织,5例乳腺癌旁组织,15例正常乳腺组织。结果 PH20免疫组织化学示：正常乳腺组织无表达(0／3),53例乳腺癌中31例呈阳性表达(58．4％),其中乳腺癌不伴有淋巴结转移阳性率48．2％,乳腺癌伴有淋巴结转移原发癌70．8％,转移癌83．3％。Western印迹法示5例乳腺癌均有PH20相应阳性条带的表达。寡核苷酸探针原位杂交显示75％(21／28)乳腺癌中有PH20 mRNA表达。17例正常乳腺组织中2例乳腺小叶呈弱阳性表达。结论 PH20的表达似乎与乳腺癌的浸润转移行为呈正相关,提示透明质酸酶可能消化乳腺癌周围组织,并释放纤维母细胞生长因子-2而促进其肿瘤生长和转移。     

非小细胞肺癌中LASS2/TMSG1的表达及其临床意义

目的探讨LASS2/TMSG1在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及与临床病理特征、预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测NSCLC和癌旁正常组织中LASS2/TMSG1蛋白的表达,分析其表达与NSCLC临床病理特征的关系,并进行术后随访。结果LASS2/TMSG1蛋白在NSCLC组织中的表达(21/87,24.13%)明显低于正常肺组织(15/25,60.00%)。LASS2/TMSG1在NSCLC组织中的表达与肿瘤分化、淋巴结转移呈负相关(P<0.05),且LASS2/TMSG1阳性患者的总生存期及无瘤生存期均明显高于LASS2/TMSG1阴性患者(P<0.05)。多因素Cox分析显示,LASS2/TMSG1是NSCLC患者的独立预后因素。结论LASS2/TMSG1可能抑制肺癌的发生、分化及转移,有望成为肺癌患者的预后指标之一。     

ELISA和ABC免疫组化染色法在肿瘤McAbs筛选中的比较研究

本文比较分析了ELISA和ABC两种方法在肿瘤McAbS筛选应用中的一些利弊关系。结果表明,ELISA测出为阳性并与结肠癌细胞系反应的99.5％(198/199)孔杂交瘤细胞所分泌的抗体,经ABC法染色后是不与其癌组织反应的,其中只有0.5％(1/199)孔细胞的抗体才是这两种方法同时均能测得为阳性和是有意义的。而ABC法不仅可检出ELISA阳性的抗体,而且亦能检出ELISA漏筛为性阴、最终是有意义的理想抗体。     

hK6单克隆抗体制备及在胃和乳房肿瘤组织中的初步应用

目的:原核表达人组织激肽释放酶6(human kallikrein 6,hK6),采用杂交瘤技术制备其单克隆抗体,建立免疫组织化学方法,检测hK6在胃癌、乳腺癌组织中的表达情况.方法:通过原核表达hK6融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备特异性单克隆抗体,并用间接ELISA、SDS-PAGE及Western-blot鉴定抗体,protein A agarose亲和层析柱纯化抗体,并以此抗体建立免疫组织化学方法检测人胃癌、乳腺癌组织中hK6表达情况.结果:成功筛选出4株高分泌型特异性杂交瘤细胞株,其制备抗体可与hK6融合蛋白发生特异性结合;免疫组织学显示,hK6主要分布在胃癌细胞胞浆中,成阳性表达,而在癌旁胃黏膜中成阴性表达;在乳腺癌组织中定位于胞浆,成弱阳性表达,癌旁组织成阴性表达.结论:成功制备了高纯度、特异性的抗hK6单克隆抗体;该抗体为深入研究hK6功能和建立高特异性、高敏感性检测组织和体液中hK6的方法奠定基础.     

锌指蛋白KOX12单克隆抗体的制备及在肿瘤组织中的表达

目的：制备重组锌指蛋白KOX12（肿瘤相关蛋白）,并制备其特异性的单克隆抗体,用免疫组化观察它在肿瘤组织中的表达。方法：通过逆转录-酶链聚合反应（RT-PCR）得到KOX12 cDNA片段,构建真核表达质粒和原核表达质粒,在大肠杆菌M15和293T细胞中进行表达。以KOX12蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,用聚乙二醇（PEG）融合法进行细胞融合制备产生抗KOX12单克隆抗体的杂交瘤细胞株;该抗体用免疫组化法对结肠癌、肺癌组织进行染色。结果：构建了含KOX12的真核细胞和原核细胞的表达质粒,并表达及纯化了KOX12重组蛋白,建立了产生抗KOX12单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C8,酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质免疫印迹试验（Western blot）显示6C8对KOX12有高度的特异性,免疫组化染色结果提示在结肠癌组织和肺癌组织切片中有少数细胞呈阳性反应。结论：6C8单克隆抗体是锌指蛋白KOX12特异的单克隆抗体,该抗体为IgG1型、k链亚类免疫球蛋白。在肺癌组织及对肠癌组织中有阳性细胞可见。该文为KOX12蛋白的研究工作创造了一个平台,为肿瘤的防治提供了一条新的可能途径。     

抗结肠肿瘤相关抗原单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗结肠肿瘤相关抗原的单克隆抗体(mAb)并对其进行初步的鉴定及功能研究。方法:将结肠癌细胞系或磨碎的结肠癌组织免疫小鼠,按常规方法进行细胞融合,采用活细胞周围花环形成的方法进行阳性克隆的筛选。用间接免疫荧光染色和流式细胞术分析及酶免疫组织化学的方法进行初步鉴定,并用抗体介导的补体依赖的细胞毒试验(CDC)进行初步的功能研究。结果:获得了2株分泌抗结肠肿瘤相关抗原mAb杂交瘤细胞株3A12和6A8。流式细胞仪检测,2株杂交瘤分泌的抗体均能在结肠癌细胞系中均为阳性。普通石蜡切片及组织芯片的免疫酶组织化学染色结果,显示2株mAb均在结肠肿瘤组织中有较高的阳性率。2株mAb分别与靶细胞及补体作用后,对于靶细胞的杀伤率分别为98.1%和42.4%。结论:成功地制备了2株识别结肠癌细胞表面抗原的mAb,在结肠癌的诊断和治疗中可能具有潜在的应用价值。     

肿瘤转移抑制相关基因TMSG-1核仁定位信号序列的鉴定

目的 鉴定肿瘤转移抑制相关基因TMSG-1蛋白中潜在的特异性定位信号序列并探索其亚细胞定位机制.方法 聚合酶链反应(PCR)扩增TMSG-1开放读码框全长及不同长度的截断片段,定向克隆于绿色荧光蛋白(GFP)表达质粒pEGFP-N1;各融合蛋白表达质粒转染人胚肾细胞系HEK293细胞;转染48 h后提取细胞总蛋白进行GFP的Western blot检测或用冷丙酮固定细胞后激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位.结果 GFP分别融合TMSG-1全长蛋白(aa1-380)及其截断片段T1(aa1-70)、T2(aa1-128)、T3(aa129-380)、T4(aa71-128)、T5(aa71-179)和T6(aa71-380),Western blot检测结果显示成功表达了各融合蛋白.激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位显示融合蛋白T4(aa71-128)主要定位于细胞核内的核仁部位,融合蛋白T6(aa71-380)以细胞核内弥散分布为主,而TMSG-1全长融合蛋白及融合蛋白T1、T2、T3、T5则定位于胞质.进一步的序列缺失去除T4( aa71-128)羧基末端10个氨基酸得到截断片段T4Δ119-128,T4Δ119-128融合的GFP仍位于细胞核,但核仁内的绿色荧光信号明显减弱.结论 肿瘤转移抑制相关基因TMSG-1存在潜在的核仁定位信号,位于aa119-128(RRRRNQDRPS),这一发现为深入研究TMSG-1的亚细胞定位及相关功能奠定了基础.     

Characterization of a human-human hybridoma antibody, C-OU1, directed against a colon tumor-associated antigen.

The human hybridoma cell line, B9165, was obtained after fusion of lymphocytes from lymph nodes draining the tumor region in a patient with adenocarcinoma of the colon with the human B-lymphoblastoid cell line WI-L2-729-HF2 (729-HF2). B9165 secretes the human monoclonal antibody, C-OU1 (IgM, kappa). Immunocytochemical and immunohistochemical analysis showed that the antibody bound to a differentiation antigen. Electron microscopy of colonic adenocarcinoma cells, intact tumor and colonic epithelium by the immunogold technique demonstrated that the C-OU1 antibody reacted with a molecule associated with areas of disruption of the intermediate filaments in the cytoplasm of the tumor cells. No reaction was seen with intermediate filaments in normal colonic epithelium. The molecular weight of the antigen was shown to be 43 Kda by SDS-PAGE and Western blotting of tumor extracts, and isoelectric focusing of sonicated extracts demonstrated reaction with molecular species of pI 5.4-6.2. These findings suggest that the C-OU1 antigen is a modified cytokeratin 18. The B9165 cell line has proved to be quite stable, and the antibody is of potential clinical value. Its usefulness for localizing tumors in patients is being investigated.     

骨桥蛋白单克隆抗体的制备及其特异性分析

为了研制骨桥蛋白(OPN)特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性。本研究在毕赤酵母中表达具有良好免疫原性的重组人OPN蛋白的基础上,用重组人骨桥蛋白(rhOPN)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选杂交瘤细胞,并结合免疫印迹对抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制试验对单克隆抗体识别的抗原位点进行分析。结果共获得4株能够识别OPN不同抗原位点的mAb,亚类测定显示,3株为IgG1,1株为IgG2a。这些mAb能与重组人OPN特异性结合。本研究的四株抗体中,只有4G2B5能够检出与肿瘤转移密切相关的OPN-c的条带,预示该抗体可用于判断肿瘤预后和高转移肿瘤的临床检测。本研究成功获得了针对骨桥蛋白的特异性mAb,同时为进一步研究OPN蛋白的结构和功能提供了重要工具。     

抗伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立抗伏马菌素B1（FB1）的单克隆杂交瘤细胞株,制备抗FB1的单克隆抗体（McAb）。方法采用FB1-KLH偶联物小剂量长周期免疫BALB/c小鼠后,采用细胞融合方法获得分泌抗FB1的杂交瘤细胞株,采用多次亚克隆的方法建立了4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株。腹水诱生法获得大量McAb,采用抗体亚类测定试剂盒鉴定抗体的亚类,SDS-PAGE测定抗体分子量,McAb的特异性和灵敏度用间接竞争抑制ELISA。结果免疫小鼠血清检测结果显示经过5次免疫后血清的效价稳定在1×10-6,经过4次亚克隆后建立4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株,获得腹水,纯化抗体,抗体亚类属于IgG2a类,轻链为κ,轻链和重链的相对分子质量分别是55000和32000,ELISA检测抗体特异性显示可与FB1发生特异性反应,采用此抗体建立间接竞争抑制ELISA方法的线性范围在2～500ng/ml。结论制备了特异性和灵敏度较高的抗FB1单克隆抗体,为建立伏马菌素免疫学检测方法打下良好基础。     

Integrin alpha2beta1 recognizes laminin-2 and induces C-erb B2 tyrosine phosphorylation in metastatic human melanoma cells

Previous studies have shown that tumor cells with metastatic propensity secrete more of the laminin alpha2 chain than non-metastatic tumor cells do, and that laminin-2, which contains the alpha2 chain, promotes cell adhesion better than laminin-1 (Jenq et al. (1994). Differentiation, 58, 29-36). The current studies were designed to determine whether a correlation exists between the expression of the laminin-2 isoform and the metastatic phenotype in melanoma cells. We found that expression of the laminin-2 isoform was upregulated in the metastatic melanoma cell lines tested. Cell attachment studies showed that metastatic melanoma cells attached more efficiently to laminin-2 substrates. Studies on integrin expression revealed that the presence of alpha2beta1 integrin correlated with expression of the laminin-2 isoform in metastatic melanoma cells; anti-integrin alpha2 antibody prevented cell attachment to laminin-2 substrates. The data suggest that the alpha2beta1 integrin is the receptor mediating cell attachment to the laminin-2 isoform. This interaction, mediated by the alpha2beta1 integrin, stimulates secretion of the 72 kD type IV collagenase and induces a specific 185 kD protein tyrosine phosphorylation. The 185 kD tyrosine-phosphorylated protein was identified as the p185/C-erb B2 oncoprotein by immunoprecipitation. These studies suggest that upregulation of expression of the laminin-2 chain correlates with the metastatic phenotype of melanoma cells and provides evidence that the specific p185/C-erb B2 tyrosine phosphorylation may be involved in integrin-mediated signaling during tumor cell invasion and metastasis.     

The use of a tumor metastasis targeting peptide to deliver doxorubicin-containing liposomes to highly metastatic cancer

Tumor metastasis is responsible for 90% of cancer-associated deaths and highly metastatic cancers are more prone to form metastasis foci and acquire the drug resistance. Here, a nanocarrier system (TMT-LS) has been constructed by modification of stealth liposomes with a metastatic cancer specific peptide, using the unmodified stealth liposomes (LS) as the control. The active targeted nanocarriers presented satisfactory particle size (about 100?nm) and drug release characteristics in?vitro. Highly metastatic cancer cells (MDA-MB-435S and MDA-MB-231) and non-metastatic cancer cells (MCF-7) were applied as?tumor cell models. The highly metastatic cancer cells were found to endocytose more TMT-LS in a faster?way than TS, through a receptor-mediated pathway proved by specific receptor inhibition. Co-localization technique indicated the integrity of nanocarriers in cytoplasm. The significant targeting of TMT-LS to highly metastatic tumors was demonstrated in?vivo and ex?vivo in an orthotopic model as well as in a double tumor-bearing animal model with both metastatic and non-metastatic tumors in the same mouse. Importantly, the active targeted drug delivery system was found to penetrate deeper into tumor mass and have a longer retention within the malignant tissue. Further, TMT-LS greatly facilitated the efficacy of doxorubicin loaded in terms of inhibiting xenograft tumor growth and inducing cancer cell apoptosis, with only minor side effects. Together, the specific nanocarriers hold great potential in the development of nanomedicine for diagnosis and therapy of metastatic tumor.     

抗人内皮细胞特异性分子-1单克隆抗体的研制和初步鉴定

运用B淋巴细胞杂交瘤技术 ,以人内皮细胞特异性分子 1(ESM 1)蛋白为抗原 ,经PEG融合 ,有限稀释法筛选 ,获得了 7株稳定分泌抗人ESM 1的杂交瘤细胞株 ,其中 3A7细胞株特异性尤为显著 ,效价高达 1∶6 0 0 0。所分泌抗体亚型为IgG2b ,Westernblot结果表明对内皮细胞中的ESM 1蛋白及细胞培养上清中的ESM 1均可特异性识别。并观察到ESM 1主要分布在内皮细胞的细胞胞质伴胞核中。在肾组织中 ,ESM 1定位于血管内皮细胞 ,且肾癌标本中ESM 1阳性表达显著高于正常肾组织。免疫组化结果表明所获单抗具有一定的特异性和实用性。