微囊包裹成年猪胰岛细胞体外培养的研究

该实验采用机械法分离制备成年猪胰岛细胞，用海藻酸钠－多聚赖氨酸－海藻酸钠微囊（Ａ－Ｐ－Ａ微囊）包裹猪胰岛细胞，检测其体外培养时胰岛素分泌能力及胰岛素刺激释放试验。结果表明，与未微囊化猪胰岛细胞体外培养结果比较，微囊化与未微囊化猪胰岛细胞一样均具有良好的生物学活性。胰岛细胞在微囊内生长良好，并不断分泌胰岛素，微囊对胰岛素有良好的通透性。微囊包裹成年猪胰岛细胞将可能是临床胰岛异种移植的一较好供体来源。     

微囊化新生猪胰岛细胞异种移植生物相容性和疗效的研究

目的:研究微囊化新生猪胰岛细胞异种移植影响生物相容性的因素以及对1型糖尿病的疗效。方法:注射链脲霉素诱发糖尿病大鼠模型后,将不同组微囊化新生猪胰岛细胞、未微囊化新生猪胰岛细胞及空微囊,经腹腔植入1型糖尿病大鼠体内,移植后不应用任何免疫抑制剂,测量移植后大鼠血糖、体重、胰岛素C肽的变化。结果:移植后6~8周实验组、对照组3糖尿病大鼠血糖、体重逐渐恢复正常水平;移植后实验组、对照组1、2、3血清C肽水平升高,对葡萄糖刺激实验反应明显;胰岛素释放试验显示葡萄糖可刺激胰岛细胞释放胰岛素实验组与对照组比较有统计学意义(p0.01)。结论:微囊周围细胞过度增生是导致移植物功能丧失的主要原因;微囊化新生猪胰岛细胞可以纠正糖尿病大鼠高血糖状态,在体内可以生长、分化,并增加胰岛素分泌水平。     

成年猪胰岛细胞的分离纯化及其微囊包裹

目的:探索成年猪胰岛细胞分离纯化的有效方法,获取具有免疫隔离作用的小微囊化胰岛细胞。方法:①用胶原酶灌注,人工、静态的方法分离成年猪胰腺;用Ficoll400不连续密度梯度离心纯化猪胰岛,从形态和功能学(体外培养)鉴别分离细胞的活力。②用自制的静电微囊发生装置、采用纯化的海藻酸钠和多聚赖氨酸材料制备小微囊化胰岛细胞,并鉴别微囊胰岛的活力和微囊膜的通透性。结果:①每只猪胰腺可获得(292647±79909)个胰岛,纯化前胰岛产量为(5360±1779)IEQ/g胰腺组织,纯化后产量(3239±1116)IEQ/g胰腺组织,胰岛纯度为90%。胰岛组织学结构完整,体外培养胰岛素分泌良好,葡萄糖刺激释放反应明显,显示了良好的细胞活力。②微囊化胰岛细胞圆形,直径315-350μm,表面光滑,大小相对均一,其内可见1-2个胰岛团。微囊胰岛也具良好活力,微囊膜通透性良好。结论:①本方法分离成年猪胰岛能获得较高数量和具有良好活力的猪胰岛细胞。②自制的静电微囊发生装置能制成具有生物活性的大小相对均一,圆形,表面光滑的小APA微囊化胰岛细胞(直径315-350μm),为进行肝内微囊化胰岛移植提供了可能。     

微囊包膜猪胰岛移植治疗糖尿病大鼠获得成功

胰岛移植治疗胰岛素依赖型糖尿病,其疗效不够满意的主要原因是:受者产生排异反应及移植的是胰腺组织碎片而非纯化胰岛。 重庆医科大学人工细胞研究室舒昌达教授等在糖尿病小鼠腹腔内移植免疫隔离膜包裹大鼠胰岛(中华内分泌代谢杂志(1991;7(2):101)工作的基础上;发现微囊包膜猪胰岛在体外培养时,能稳定地分泌胰岛素,故将微囊包膜纯化初生猪胰岛移植至糖尿病大鼠腹腔内,进行异种胰岛移植研究。     

琼脂糖微囊化猪胰岛移植治疗糖尿病的实验研究

对微囊化猪胰岛的体外、体内功能进行研究。方法采用经胰导管连续灌注胶原酶技术分离和纯化猪胰岛。国产琼脂糖作为制备微包囊的免疫隔离材料，用“相分离”方法包被成年猪胰岛。２１只糖尿病大鼠用于实验，对照组６只，移植组１５只。其中６只腹腔内植入微囊化胰岛，６只腹腔内植入未包囊胰岛，３只肾包膜下植入未包囊胰岛。数据做组间比较，用ｔ检验。结果微囊化胰岛在１个月的培养期间可持续分泌胰岛素。囊内细胞生长良好，微囊没有溶解和破碎。培养２天的微囊化胰岛对高糖与茶碱刺激有明显反应，胰岛素释放量分别为低糖的１．８３倍和２．２８倍（Ｐ＜０．０１）。对６只糖尿病大鼠施行腹腔内植入微囊化胰岛手术，２０００～３０００个／只。不用任何免疫抑制剂。移植后第４天血糖明显下降，第７天时血糖降至正常范围，维持３０天。结论琼脂糖微囊具有较好的免疫隔离作用。     

微囊化新生猪胰岛移植治疗Ⅰ型糖尿病的研究

新生猪胰腺经胶原酶消化，分离纯化得纯净胰岛。用ＢａＣｌ＿２交联一步法微囊技术包裹该胰岛，所得微囊直径５００～７００μｍ，每个微囊含１～３个胰岛。移植治疗Ⅰ型糖尿病５例，每例移植胰岛数为１３±２万，术后不使用免疫抑制剂。受体血糖移植前为１８．２±３．７４ｍｍｏｌ／Ｌ，用药后降至８．１４±２．０６ｍｍｏｌ／Ｌ，血清Ｃ肽由１１３．５±５８ｐｍｏｌ／Ｌ升至２４７±８３ｐｍｏｌ／Ｌ。外源胰岛素用量显著减少，从移植前的６４±１５．４８Ｕ／ｄ减至２７．２±９．４４Ｕ／ｄ。提示采用微囊化新生猪胰岛异种移植，能有效地纠正患者高血糖，显著减少胰岛素用量。证明海藻酸钠微囊具有良好的免疫隔离作用和生物膜性能，可有效地避免免疫排斥反应。     

壳聚糖/海藻酸钠微胶囊包埋大鼠胰岛异种腹腔移植的实验研究

目的 探讨用壳聚糖代替聚赖氨酸,制备包埋大鼠胰岛的壳聚糖/海藻酸钠(ACA)微胶囊进行异种胰岛移植的可行性.方法 SD大鼠胰腺原位消化法分离纯化胰岛,气流吹喷制作海藻酸钠/壳聚糖/海藻酸钠(ACA)微囊化大鼠胰岛,比较微囊化与未微囊化胰岛的胰岛素释放情况、在异种受体腹腔内存活情况及糖尿病小鼠模型血糖逆转情况.结果 实验组与对照组的胰岛素释放试验差异无显著性(P＞0.05);实验组糖尿病小鼠模型血糖正常持续时间为23～65 d(平均48 d),对照组为3～6 d(平均5 d),两组差异有显著性(P＜0.05);小鼠腹腔灌洗分离ACA微囊化大鼠胰岛,发现微囊膜完整,囊壁无纤维化,胰岛存活良好.结论 ACA微胶囊具有良好的免疫隔离作用,胰岛素释放正常并可使异种胰岛移植物存活时间明显延长.     

微囊化大鼠胰岛细胞的冷冻保存

目的探讨海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸微囊在胰岛细胞冷冻保存过程中的作用。方法将分离纯化后的大鼠胰岛细胞分为微囊化组和游离组。经冷冻保存1月后在RPMI 1640中培养过夜,分别测定两组的胰岛细胞回收率、胰岛细胞直径并进行胰岛素刺激释放试验。结果微囊组胰岛细胞回收率为98．2％±1．4％,较游离组71．6％±2．9％显著提高 (P<0．05)。在高糖(16．7 mmol／L)刺激下,微囊组胰岛素分泌量较游离组高(22．6±1．8 mU/Lvs 11．7±1．5 mU/L,P<0．05)。在含有茶碱的高糖溶液中,微囊组的刺激指数为游离组的3倍。结论海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸微囊可显著提高胰岛细胞冷冻保存后的回收率,并改善胰岛细胞的功能。     

经肝动脉移植微囊化新生猪胰岛细胞治疗糖尿病的实验研究

目的：探讨经肝动脉移植微囊化新生猪胰岛细胞后，移植物生理功能以及副反应的特点。方法：化学药物诱导制作犬的糖尿病模型后，将分离、纯化及微囊化的新生猪胰岛细胞经肝动脉移植入糖尿病犬的肝内，测定移植前后糖尿病犬的胰岛素用量、血糖水平以及葡萄糖刺激血清C肽、肝功能及CD4／CD8的变化，并于移植6月后对移植受体肝、胰进行病理学检查。结果：移植后模型犬血糖逐步下降至正常水平，胰岛素用量减少，移植6月后2犬停用胰岛素，并维持血糖正常达180d之久；移植后肝检查无明显变化，胰腺检查见凋亡胰岛无再生现象。结论：微囊化的新生猪胰岛细胞经肝动脉移植入糖尿病犬的肝内，能纠正异种动物犬糖尿病模型的高血糖状态，不发生明显副作用。     

微囊包膜胰岛移植研究 Ⅲ 微囊包膜大鼠胰岛体外培养研究

本文研究人工膜包裹大鼠胰岛在体外培养时胰岛的形态学及其分泌胰岛素情况.在培养48h后,培养液中胰岛素含量为172.7±72.5μU/ml至190±83.gμU/ml,而形态学检查显示胰岛细胞增生.研究结果表明包膜材料及微囊制备操作过程对胰岛细胞的生长及分泌功能无影响     

改良的新生猪胰岛细胞体外培养

介绍一种通过细胞分离及体外培养获得大量新生猪胰岛细胞团的方法。新生猪胰腺经 0 .5～ 1mg .ml- 1的V型胶原酶消化 8～ 1 2min ,再经体外培养 7d ,可获大量纯化的胰岛细胞团。同时 ,新生猪胰岛内的B细胞不仅胰岛素分泌功能良好 ,而且其超微结构正常。提示新生猪胰岛细胞可作为异种移植治疗 1型糖尿病重要的供体来源。     

改良的新生猪胰岛细胞体外培养

介绍一种通过细胞分离及体外培养获得大量新生猪胰岛细胞团的方法，新生猪胰腺经0．5－1mg.ml^-1的V型胶原酶消化8－12min，再经体外培养7d，可获大量纯化的胰岛细胞团，同时，新生猪胰岛内的B细胞不仅胰岛素分泌功能良好，而且其超微结构正常，提示新生猪胰岛细胞可作为异种移植治疗1型糖尿病重要的供体来源。     

促红细胞生成素对新生猪胰岛细胞 增殖分化和凋亡的影响

［摘要］目的：研究促红细胞生成素在体外对新生猪胰岛细胞增殖分化和凋亡的影响。方法：采用胶原酶消化和组织培养方法分离纯化新生猪胰岛细胞,检测其纯度和活性,再分为实验组和对照组。实验组培养基中添加促红细胞生成素（10.0 μmol/L）,对照组不添加促红细胞生成素,培养5 d后行低糖和高糖刺激胰岛素释放试验;并行细胞计数及MTT比色法测细胞增殖活性;流式细胞仪和EB/AO染色荧光检测细胞凋亡百分率,流式细胞仪分析细胞周期,RT-PCR法检测胰岛细胞胰岛素促进因子-1(PDX-1),葡萄糖转运载体2（GlUT-2）,bcl-2,bax,caspase-3 mRNA的表达。结果：促红细胞生成素干预后新生猪胰岛细胞不改变形态和功能,对葡萄糖刺激胰岛素分泌的反应正常;细胞计数示实验组新生猪胰岛细胞数目均比对照组增多（P＜0.05）;随着培养时间延长,实验组和对照组吸光度值均呈上升趋势,且实验组的吸光度值均高于对照组（P＜0.05）,实验组PDX-1 mRNA表达稍有上调（P＜0.05）,而GlUT-2 mRNA表达无明显差别（P=0.34）。流式细胞仪和EB/AO染色荧光检测实验组的凋亡百分率均较对照组降低（P＜0.01）。RT-PCR示实验组bcl-2 mRNA较对照组上调,而bax和 caspase-3 mRNA明显下调（P＜0.01）。结论：促红细胞生成素在体外能促进新生猪胰岛细胞的增殖分化,对形态和功能无影响。促红细胞生成素对新生猪胰岛细胞有抗凋亡保护作用,可能是通过上调bcl-2 mRNA的表达,下调bax, caspase-3 mRNA的表达来实现的。     

胰腺干细胞和胰岛细胞在糖尿病 大鼠治疗中的疗效观察

目的 探讨大鼠胰腺干细胞与胰岛细胞移植在大鼠糖尿病治疗中的疗效。方法 通过链脲菌 素复制1 型糖尿病大鼠模型并随机分为胰岛细胞组和胰腺干细胞组。用胶原酶V 分别消化新生和成年大鼠 胰腺,Percoll 梯度离心分离胰岛细胞和胰腺干细胞。采用Bonner-Weir 法诱导胰腺干细胞分化,DTZ 染色 检测移植物纯度,AO/PI 检测移植物活性。分别记录手术前后大鼠血糖水平、胰岛素水平及移植物存活时 间;高糖刺激实验和腹腔糖耐量评价移植物功能;取各组大鼠移植部位标本行HE 染色和免疫组织化学染 色,观察组织形态学变化。结果 胰岛细胞组和胰腺干细胞组血糖分别在术后3 和5 d 恢复正常（P <0.05）, 两组大鼠术后不同时间点的血糖有差异（P <0.05）,胰腺干细胞组的降糖能力强于胰岛细胞组（P <0.05）。 两组大鼠移植后7 d 血清胰岛素水平均较术前升高（P <0.05）。高糖刺激实验表明,各组移植后15 和65 d 高糖刺激后的C 肽水平较刺激前升高（P <0.05）,胰岛细胞组移植后65 d 高糖刺激后C 肽水平低于胰腺 干细胞组（P <0.05）,胰岛素和C 肽水平监测结果表明胰腺干细胞组移植物胰岛素分泌维持时间长于胰岛 细胞组。移植后腹腔糖耐量实验结果表明移植物均功能良好。胰岛细胞组和胰腺干细胞组移植物的中位 存活时间分别为73 和88 d,Kaplan-Meier 曲线分析提示胰腺干细胞组移植物生存时间较胰岛细胞组延长 （P <0.05）。HE 染色提示肝脏门静脉移植区域可见新生血管包绕的胰岛细胞团,免疫组织化学染色证实细 胞团胰岛素阳性。结论 胰腺干细胞分化后经门静脉移植能安全有效地发挥降糖作用,疗效优于胰岛细胞 移植。     

柯萨奇B4病毒感染对人胚胰岛的影响

目的：研究柯萨奇B₄病毒感染对人胚胰岛的影响。方法：采用中国流行的柯萨奇B₄病毒感染体外培养的人胚胰岛细胞,电镜观察其形态变化,并进行糖刺激的胰岛素释放量试验。结果：病毒可直接攻击胰岛,突破胰岛胞膜,侵犯胰岛β细胞,可在β细胞内繁殖,使β细胞脱颗粒。糖刺激的胰岛素释放量在感染后24 h增加,以后呈逐渐降低趋势。感染组在感染24 h时低糖及高糖刺激的胰岛素释放量分别为（64.50±9.20）mU•L^-1,（87.85±8.50）mU•L^-1,均高于对照组（P<0.05）。48 h~6 d高糖及低糖刺激的胰岛素释放量均显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）。结论：柯萨奇B₄病毒可在体外感染人胚胰岛细胞,并损害胰岛β细胞合成胰岛素的功能。     

胰淀素致大鼠胰岛细胞功能损伤的实验研究

OBJECTIVE: To investigate the effect of amylin on the functions of pancreatic islet cells in vitro. METHODS: In vitro cultured pancreatic islet cells from neonatal rats were used for studying the effects of amylin at different concentrations on insulin secretion, and DNA content and insulin contents in the cells. RESULTS: Insulin secretion was significantly inhibited when amylin concentration was higher than 10 micromol/L (P < 0.01). After incubation with 10 micromol/L amylin for 2 h, insulin secretion of islet cells was dose-dependently inhibited by to 16.7 mmol/L glucose stimulation (P < 0.01). The DNA and insulin contents in the cells rose significantly when amylin concentration was higher than 10 micromol/L as compared with the control group (P < 0.01). CONCLUSION: Amylin at concentrations higher than 10 micromol/L can remarkably inhibit insulin secretion and release induced by 16.7 mmol/L glucose stimulation.     

胰岛β细胞胰岛素抵抗的研究进展

胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能缺陷为2型糖尿病发病的重要机制。研究证实,胰岛β细胞同外周组织一样存在胰岛素抵抗,即胰岛β细胞胰岛素抵抗。胰岛β细胞胰岛素抵抗使胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷在胰岛细胞水平发生直接的关联,信号转导通路中InsR、IRS-1/-2与β细胞功能密切相关,这可能与高游离脂肪酸血症、氧化应激、炎性反应有关。胰岛β细胞胰岛素抵抗的研究对拓宽胰岛素抵抗视野和对2型糖尿病机制的再认识及糖尿病防治都将产生深远的影响。     

Effects of cyclosporine A on insulin content and insulin release in neonatal rat islet cell monolayer cultures]

We investigated the effects of cyclosporine A (CsA) on insulin content and insulin release in neonatal rat islet cell monolayer cultures. Insulin content in 5.5-day-old monolayers was not affected after 12-hour incubation in the medium containing 16.7 mmol/L glucose plus 0.1 or 100 micrograms/ml CsA and 5.6 mmol/L glucose plus 10 micrograms/ml CsA. Insulin release in 7.5-day-old monolayers was inhibited after 12-hour incubation in the medium containing 5.6 or 16.7 mmol/L glucose plus 0.01-100 micrograms/ml CsA in a dose-responsive manner. At 16.7 mmol/L glucose, CsA less than or equal to 0.1 microgram/ml did not affect insulin release, while CsA greater than or equal to 1.0 microgram/ml significantly inhibited insulin release and the inhibitory effect did not return to normal after a 16-hour incubation in CsA-free medium. At 5.6 mmol/L glucose, CsA 1.0 microgram/ml did not affect insulin release. CsA 100 micrograms/ml inhibited insulin release less than it did at 16.7 mmol/L glucose. These experimental data demonstrated that high doses of CsA have inhibitory effects on insulin release in islet monolayer cultures.     

人胎胰岛细胞的分离培养及其意义

目的 初步探索人胎胰岛细胞的分离培养方法,以期深入研究胰岛细胞的凋亡机制及开展人胰岛细胞移植。方法 采用机械分离、体外胶原酶消化,并通过组织块联合培养、转皿、时间消化差法获取人胎胰岛细胞,观察胰岛细胞生长及开展人胰岛素释放情况。结果 双硫腙（Dithizone）染色显示胰岛纯度约80％～90％,细胞培养至7～9d为其对数生长期,培养至11d可测到胰岛素释放高峰,培养至15d仍具有一定的生物活性。结论 机械分离消化、转皿、时间消化差法可获得生物活性较好的胰岛细胞,为深入探讨胰岛细胞凋亡、胰岛细胞移植提供细胞基础。     

云南小耳猪胰岛细胞移植治疗糖尿病恒河猴免疫方案探讨

目的 探讨云南小耳猪胰岛细胞移植治疗糖尿病恒河猴的免疫抑制方案,观察其有效性及安全性.方法 云南小耳猪胰岛细胞移植在糖尿病恒河猴肝内,移植后选择联合使用西罗莫司、他可莫司及吗替麦考酚酯的免疫抑制方案,监测移植前后胰岛素用量、血糖以及血清猪C肽水平和肝肾功能的变化,评价免疫方案对猪-猴异种胰岛细胞的保护作用.结果 受体猴外源性胰岛素用量较术前明显减少（P＜0.05）;C肽水平较术前升高（P＜0.05）;无栓塞、感染、出血,肝肾功能无明显异常改变.结论 联合使用西罗莫司、他可莫司及吗替麦考酚酯的方案可满足云南小耳猪-恒河猴异种胰岛细胞移植实验研究的需要,无明显副作用.