周期性机械应力诱导的自噬抑制caspase通路依赖的成肌细胞凋亡

目的 观察大鼠成肌细胞（L6 myoblast,L6）在周期性机械应力作用下细胞凋亡与自噬的水平变化,探讨机械应力诱导的细胞自噬对凋亡的作用。方法 构建大鼠成肌细胞力学刺激模型,加载参数为细胞拉伸形变率15%,加力周期包括 3 s 拉伸及 3 s 舒张,加力时间为 6、12、24 h,以不加力0 h组为对照组。通过Hoechst染色及AnnexinV-FITC/PI染色观察各组细胞凋亡情况;通过MDC染色及透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）评价各组细胞自噬变化;应用 Western 免疫印迹检测各组凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax及自噬相关蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、P62表达变化。加入自噬抑制剂3-MA后重复实验,检测各组细胞凋亡情况。采用 SPSS 17.0 软件包对数据进行统计学分析。结果 Hoechst染色及AnnexinV-FITC/PI流式结果表明,大鼠成肌细胞在周期性应力诱导下发生凋亡,24 h 时达到凋亡最大值。Western 免疫印迹结果显示,凋亡相关蛋白表达水平随加力时间延长而逐渐升高, caspase抑制剂z-VAD-fmk有效抑制应力诱导的细胞凋亡。MDC染色及TEM扫描电镜显示,大鼠成肌细胞在周期性应力诱导下发生自噬,24 h细胞自噬达到最大值。Western 免疫印迹结果显示,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ随加力时间延长而升高,P62的表达随着加力时间延长而降低。加入自噬抑制剂3-MA后重复试验,发现应力诱导的成肌细胞凋亡被明显抑制。结论 周期性机械应力诱导大鼠成肌细胞发生自噬与caspase通路依赖的细胞凋亡,细胞自噬作为一种代偿机制,保护性地抑制应力诱导的细胞凋亡。     

钙调神经磷酸酶-T细胞核因子信号通路在应力诱导成肌细胞凋亡中的作用

目的 探讨钙调神经磷酸酶（CaN）-T细胞核因子（NFAT）信号通路在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用。方法 构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型,利用多通道应力加载系统对细胞加载不同时间的周期性张应力,加入CaN的特异性抑制剂环孢素（CsA）作为对比。采用Hoechst 33258染色法和流式细胞术检测成肌细胞凋亡情况,实时聚合酶链式反应检测CaN和NFAT mRNA的表达情况,蛋白质印迹法检测NFAT3的蛋白含量。结果 随加力时间的延长,细胞凋亡逐渐增加,CaN亚基CnA、CnB及NFAT3的mRNA表达及NFAT3蛋白含量逐渐升高;加入 CsA后,细胞凋亡减少,CnA、NFAT3的mRNA表达及NFAT3的蛋白含量明显减少。结论 周期性张应力可以诱导成肌细胞发生凋亡;CaN-NFAT信号通路可能参与了周期性张应力诱导的成肌细胞凋亡。     

内质网应激关键因子PREK在应力加载下成肌细胞凋亡中的作用及机制

目的 研究周期性张应力对L6大鼠成肌细胞凋亡的影响,探讨蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)在这一过程中的作用及机制。方法 构建L6细胞力学刺激模型,加载参数为细胞拉伸形变率15%,频率10个循环/min,每循环包括3 s拉伸及3 s舒张,加力时间为2、6、12、24 h,以不加力组为对照组。应用DAPI染色观察各组细胞凋亡情况;应用实时荧光定量PCR检测各组PERK、CHOP mRNA的表达;应用Western免疫印迹检测各组PERK、p-PERK的表达变化。加入PERK抑制剂后重复实验,检测各组细胞凋亡情况,PERK、CHOP mRNA 的表达变化及p-PERK的蛋白表达变化。采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。结果 DAPI染色显示,L6大鼠成肌细胞在周期性应力诱导下发生凋亡,24 h时达到凋亡最大值。PERK被抑制后,加力组的细胞凋亡程度与对照组无显著差别。RT-PCR 结果显示,随着加力时间的延长,CHOP mRNA 的表达逐渐增加;PERK mRNA 表达无差异。Western免疫印迹结果显示,p-PERK蛋白表达水平随加力时间延长而逐渐升高,总蛋白PERK的表达无明显变化;加入PERK抑制剂后,CHOP的mRNA表达与对照组无显著差异,p-PERK蛋白表达与对照组无显著差异。结论 内质网应激关键因子PERK参与了周期性应力条件下的成肌细胞凋亡,其作用机制可能与PERK磷酸化有关。     

牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖及相关因子表达的影响

目的:观察牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖、炎性因子及Hedgehog通路基因的表达影响,探讨牵张力对软骨细胞的调控。方法:体外培养软骨细胞并鉴定。用Flexcell 4000TM加力板对细胞施加0.5 Hz,0%、3%和15%的牵张应变,作用4 h后检测细胞增殖情况,对比PCNA、Caspase-3、COL II、IL-1β、TNF-α及Hedgehog通路基因Ihh、Ptc和Smo的表达变化。结果:与对照组相比,3%组细胞增殖速度增加,PCNA、COLII、Ihh、Ptc和Smo的mRNA表达增加,15%组Caspase-3、IL-1β和TNF-α表达增加,而PCNA、Smo表达降低。与3%组相比,15%组细胞增殖速度降低,PCNA、COL II、Ihh和Smo表达降低,而Caspase-3、IL-1β表达增高。结论:不同强度牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖活性及炎性因子表达作用不同。Hedgehog通路对牵张力敏感,可能参与了力学刺激对软骨细胞的调控。     

周期性张应力对人牙周膜细胞生物学活性的影响

目的:探讨周期性张应力对体外培养的人牙周膜细胞生物活性的影响。方法:对体外培养的人牙周膜细胞施加不同大小的周期性牵张力(6%、12%、20%细胞表面拉伸率),24h后检测其对细胞的总蛋白合成、ALP活性、Col-Ⅰ和OCN分泌的影响。实验结果用SPSS 13.0进行统计分析。结果:较小的牵张力对人牙周膜细胞生物活性无显著影响,随力值的增大,牵张力能够呈强度依赖性抑制人牙周膜细胞的活性,减少总蛋白合成及ALP活性,抑制Col-Ⅰ及OCN的分泌。结论:周期性张应力可以抑制人牙周膜细胞的生物学活性,并呈强度依赖性。     

Caspase信号转导通路在高糖引发牙周膜细胞凋亡中的作用

目的:探讨Caspase信号转导通路在高糖引发牙周膜细胞凋亡中的作用。方法:本实验采用含有不同葡萄糖浓度的培养基培养人牙周膜细胞,作用24小时后,立即使用流式细胞仪对各组凋亡细胞进行计数,并对各组细胞Caspase-3蛋白含量的变化进行检测,采用Caspase-3特异性抑制剂z-DEVD-fmk为对照。结果:高糖可以导致牙周膜细胞凋亡,并呈浓度依赖性,Caspase-3特异性抑制剂z-DEVD-fmk能够部分抑制高糖引起的牙周膜细胞凋亡。结论:高糖引发牙周膜细胞凋亡是由Caspase信号转导通路介导的。     

机械牵张力诱导成骨细胞骨保护素及其配体表达的信号转导途径初探

目的：研究机械牵张力诱导成骨细胞OPG/RANKL表达变化的信号转导途径。方法：在MC3T3-E1细胞加力前半小时加入放线菌酮、吲哚美辛、染料木黄酮、PD098059等抑制剂,通过自制的多通道细胞牵张应力加载系统对细胞施加18%的机械牵张力,细胞的加载作用时间为24h。用RT-PCR方法检测细胞受力前后OPG/RANKL mRNA表达的变化,并进行统计分析。结果：吲哚美辛及染料木黄酮可抑制机械牵张力诱导的MC3T3-E1细胞OPG mRNA表达增加;PD098059可抑制机械牵张力诱导的MC3T3-E1细胞RANKL mRNA表达减少。结论：机械牵张力诱导的OPG表达增加可能是通过环氧合酶或者前列腺素合成途径,也可能是通过酪氨酸磷酸化途径,机械牵张力诱导RANKL表达的减少可能是通过ERK-MAPK途径。     

细胞外信号调节蛋白激酶1/2在介导周期性牵张力对牙周膜细胞成骨分化中的作用

目的 研究周期性牵张力刺激下细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）1/2对牙周膜细胞成骨分化的分子调控机制。方法 组织块法培养人牙周膜细胞。采用多通道应力加载系统对细胞施加频率0.5 Hz、振幅10%的周期性牵张力（加力时间1、3、6、12、24 h）,以不加力的细胞作为对照,并分别在加力前应用ERK1/2通路特异性抑制剂U0126以及对细胞转染ERK1/2显性负相变异体（DN-ERK1/2）。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）及蛋白质印迹法研究人牙周膜细胞的基因蛋白水平变化。结果 加力后人牙周膜细胞的p-ERK1/2蛋白水平及骨钙蛋白（OCN） mRNA、骨涎蛋白（BSP）mRNA水平均显著升高,Runt相关基因（Runx）2 mRNA及蛋白水平在加力3、6 h均显著升高。加入抑制剂U0126或细胞转染DN-ERK1/2后,Runx2、OCN、BSP mRNA水平以及Runx2、p-ERK1/2蛋白水平均降低。结论 ERK1/2是周期性牵张力刺激下牙周膜细胞成骨分化的重要分子途径,力学刺激下激活的ERK1/2可能通过提高Runx2蛋白的表达水平而参与成骨基因OCN和BSP的转录表达。     

高强度周期性牵张应力促进体外培养成肌细胞凋亡的机制探讨

目的：探讨高强度应力作用下体外培养成肌细胞凋亡的分子机制。方法：采用Flexercell Strain Unit系统对体外培养成肌细胞施加牵张应力,通过DNA ladder实验观察细胞凋亡情况。Western Blot检测磷酸化和总体JNK1的水平,通过NFkappa B报告系统检测其活性。通过JNK1的RNAi实验观察抑制JNK1后,是否补救被抑制的NFkappa B活性。结果：10%表面拉伸幅度的牵张应力作用24 h后,细胞形态梭形稍变长,且排列方向有一致性的趋势,DNA ladder实验证实15%以上较高强度应力引起C2C12细胞凋亡,高强度应力条件下成肌细胞凋亡过程中,JNK1通路被激活,抑制JNK1的活化,补救被抑制的NFkappa B活性。结论：高强度周期性牵张应力促进体外培养成肌细胞凋亡是通过激活JNK1通路而抑制NFkappa B活性实现的。     

周期性牵张力对骨髓破骨细胞MMP-3 mRNA表达的影响

目的 :研究周期性牵张力对成熟破骨细胞MMP 3mRNA表达的影响 ,探讨机械张力与破骨细胞骨基质作用的关系。方法 :实验组从骨髓破骨细胞体外诱导培养的第 7天施加 6周 /min ,弹性基底膜发生 12%形变率的周期性牵张力 ,2 4h后 ,应用原位杂交染色技术检测多核破骨细胞内MMP 3mRNA表达变化情况。结果 :实验组施加周期性牵张力 2 4h后 ,多核破骨细胞MMP 3mRNA阳性信号在所观察视野内染色强度明显增强。结论 :体外周期性牵张力可刺激成熟破骨细胞MMP 3mRNA的表达 ,MMP 3在骨组织应力改建过程中发挥着重要作用。     

槟榔碱诱导口腔角质形成细胞凋亡研究

目的:了解槟榔碱(arecoline)对体外培养的人口腔黏膜角质形成细胞(keratinocyte,KC)凋亡的影响。方法:不同浓度的槟榔碱以及在不同时间处理体外培养的KC,在荧光显微镜下观察KC凋亡形态学改变并计算凋亡百分率,用比色法检测Caspase-3活性的改变。结果:1)槟榔碱能以一定时间和浓度依赖方式诱导培养的KC发生凋亡,其细胞凋亡率较正常对照组明显增高(P<0.05)。2)槟榔碱作用KC,其Caspase-3活性较正常对照组明显增高(P<0.05)。结论:槟榔碱可诱导KC凋亡,Caspase-3可能参与了这一细胞凋亡过程的调控。KC凋亡异常可能是口腔黏膜下纤维性变的重要发病机理之一。     

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目的 研究大鼠面神经总干离断伤后神经元的形态学改变及对TUNEL、Fas和Caspase-3、Caspase-8表达的影响。方法 2009年1 — 8月于中国医科大学实验技术中心手术制作大鼠右侧面神经总干切断伤模型,左侧为正常对照。伤后各时间点,通过HE染色观测面神经核神经元的形态学变化;TUNEL检测细胞凋亡;免疫组化检测Fas和Caspase-3、Caspase-8表达的变化。结果 伤后3 d开始面神经元存活率逐渐下降,28 d时存活率达最低;伤后第7d开始可见TUNEL阳性表达,14 d时数量达高峰;伤后1 d时,Fas表达增高,于7 d时达高峰。伤后3 d时,Caspase-3、Caspase-8表达增高, 14 d时达高峰。结论 面神经总干离断伤可引起面神经元凋亡;Fas和Caspase-3、Caspase-8参与面神经总干离断伤后诱导其神经元凋亡过程的调控。     

Compressive force induces osteoblast apoptosis via caspase-8

Periodontal remodeling during orthodontic tooth movement is a result of mechanical stresses. The application of excessive orthodontic force induces cell death. However, the nature of compressive force-induced cell death is unclear. We examined whether the in vitro application of continuous compressive force would induce apoptosis in human osteoblast-like cells (MG-63 cells), and investigated the mechanism by which apoptosis was initiated. The cells became aligned irregularly, and cell viability decreased, indicating that the compressive force caused cell death. According to the TUNEL analysis, the number of apoptotic cells increased significantly in a time-and force-dependent manner. Caspase-3 activity increased with the magnitude of the compressive force, and this effect was reduced significantly by a caspase-8 inhibitor, whereas a caspase-9 inhibitor had no such effect. We conclude that the in vitro application of compressive force can induce apoptosis in MG-63 cells through the activation of caspase-3 via the caspase-8 signaling cascade.     

Involvement of caspases in apoptotic cell death of murine macrophages infected with Actinobacillus actinomycetemcomitans

Infection of murine macrophages in vitro with periodontopathic bacterium Actinobacillus actinomycetemcomitans induces apoptotic cell death. In this study, we investigated the involvement of caspases in apoptotic cell death of A. actinomycetemcomitans-infected macrophages. Two peptide inhibitors of caspases, benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (OMe)-fluoromethyl ketone (Z-VAD-FMK) and benzyloxycarbonyl-Asp-Glu-Val-Asp (OMe)-fluoromethyl ketone (Z-DEVD-FMK), inhibited apoptotic cell death of murine macrophage cell line J774.1 infected with A. actinomycetemcomitans. During the process of apoptosis, interleukin-1beta (IL-1beta) was detected in the culture supernatants of J774.1 cells. IL-1beta secretion was blocked by the caspase-1 inhibitor, Z-VAD-FMK, indicating that caspase-1 is involved in not only the induction of apoptosis but also the IL-1beta secretion from A. actinomycetemcomitans-infected J774.1 cells. Immunoblot analysis revealed that the infection of A. actinomycetemcomitans to J774.1 cells induced the cleavage of retinoblastoma protein (Rb), suggesting that caspase-3 was activated by A. actinomycetemcomitans infection. The cytosol from A. actinomycetemcomitans-infected J774.1 cells induced Rb proteolysis in vitro, which was inhibited by the caspase-3 inhibitor, Z-DEVD-FMK. Furthermore, caspase-3-like activity was markedly increased in J774.1 cells infected with A.actinomycetemcomitans between 12 h and 24 h, which was subsequently inhibited by the addition of caspase-3 inhibitor, Z-DEVD-FMK. These findings indicate that caspase-3 induces apoptosis in J774.1 cells infected with A. actinomycetemcomitans. Taken together, these results suggest that caspase-1 and caspase-3 are involved in the induction of apoptosis in A. actinomycetemcomitans-infected macrophages.     

脱落酸对Tca8113细胞诱导分化影响的体外实验

目的探讨植物激素中脱落酸（ABA）对人舌鳞癌Tca8113细胞的诱导分化作用。方法采用脱落酸处理Tca8113细胞,观察Tca8113细胞生长和形态变化,SABC免疫组化检测细胞表面分化标志物Involucrin、RARβ及原位杂交检测Caspase- 3 mRNA的表达变化,并比较细胞表面分化标志物的表达水平与Caspase- 3 mRNA表达两者间相关性。结果Tca8113细胞经ABA作用后,细胞生长抑制明显（P<0.05）,Tca8113细胞表现出向正常细胞转化的趋势。脱落酸作用24 h时细胞Involucrin、RARβ蛋白以及Caspase- 3 mRNA表达均增高,不同浓度实验组中其表达存在显著性差异（P<0.05）。1×10-2mmol/L ABA作用12 h和24 h时,Involucrin、RARβ和Caspase- 3 mRNA表达之间呈正相关（P<0.05）。结论脱落酸可通过提高Involucrin、RARβ表达水平,激活Caspase- 3 mRNA的表达,从而促进肿瘤细胞分化及凋亡。     

Involvement of HSP90 in Anti-Fas-induced Apoptosis Signaling in the Human Salivary Gland Adenocarcinoma Cell Line HSG

It has been reported that heat shock protein (HSP) 90 is involved in the regulation of signaling cascades including those resulting in cell proliferation and apoptosis. However, little is known about how HSP90 affects apoptosis signaling.In this study, using a specific inhibitor of HSP90, geldanamycin (GDM), we investigated the relationship between HSP90 and anti-Fas antibody-induced apoptosis in HSG cells and concomitantly examined the apoptosis-inducing ability of GDM. We also sought to identify the target proteins of HSP90. When HSG cells were treated with GDM, a time-dependent increase in cell death was found. From the morphological features, the positive TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) staining, and the cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), we concluded that the induced cell death was apoptotic. The pretreatment with GDM prior to that with anti-Fas antibody (CH-11) significantly increased the cell death as compared with that obtained with GDM or CH-11 alone. Further, prolonged incubation with GDM prominently enhanced the cell death. The induced cell death was also apoptotic. The transfection of HSG cells with recombinant HSP90α significantly inhibited the CH-11- and GDM-induced apoptosis. From the inhibition and overexpression experiments on HSP90 using GDM treatment and transfection with HSP90, respectively, we showed that HSP90 has an anti-apoptotic activity toward HSG cells. Immunoprecipitation with anti-human HSP90 antibody and subsequent Western blotting analysis of the precipitates detected bands for Caspase-8 and FADD-like ICE inhibitory protein (FLIP), which is known to regulate Fas cascade. Therefore, Caspase-8 and FLIP were shown to be target proteins of HSP90. These results suggest that HSP90 inhibits apoptosis by associating with Caspase-8 and FLIP and negatively regulating their functions.