莱菔硫烷对过氧化氢诱导牛眼小梁细胞氧化应激损伤的保护作用

背景 研究表明小梁网组织的氧化应激损伤是开角型青光眼的基本病理过程之一,莱菔硫烷(SFN)可通过激活Nrf2/ARE通路发挥其抗氧化应激作用,但其是否可对氧化应激损伤的小梁细胞发挥作用目前尚不清楚. 目的 探讨SFN对H2O2诱导的牛眼小梁细胞氧化应激损伤的防护作用. 方法 采用组织块培养法对新鲜摘取的黑牛眼球小梁组织进行小梁细胞原代培养,将第3代牛小梁细胞以1x 103/孔的细胞密度接种于96孔板中培养24 h后将细胞分为4个组,空白对照组加入100μl无血清培养基,H2O2组细胞在空白对照组的基础上加入100 μl终浓度为100 μmol/L H2O2建立细胞氧化应激损伤模型,SFN组在培养液中加入100μl终浓度为10μmol/L SFN,而SFN+H2O2组在SFN组的基础上加入100 μmol/L H2O2,细胞培养后6h采用CCK-8法检测各组牛眼小梁细胞活力,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率.结果 传至第3代的细胞呈梭形,形状和大小较均一,细胞质丰富,可见色素颗粒,核仁大.H2O2组和SFN+H2O2组相对细胞活力分别为空白对照组的(67.00±1.27)％和(80.00±6.25)％,其中SFN+H2O2组相对细胞活力低于空白对照组和SFN组,但明显高于H2O2组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).空白对照组、H2O2组、SFN组和SFN+H2O2组细胞凋亡率分别为(11.33±0.77)％、(32.31±1.03)％、(10.44±0.68)％和(17.68±0.21)％,各组间总体比较差异均有统计学意义(F-539.96,P＜0.01),其中SFN+H2O2组细胞凋亡率明显低于H2O2组但高于空白对照组和SFN组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 SFN可以增强H2O2诱导的牛眼小梁细胞的抗氧化应激能力,减轻氧化应激对牛眼小梁细胞的损伤.     

血小板源性生长因子-α受体沉默对人晶状体上皮细胞增生的抑制作用

背景 血小板源性生长因子(PDGF)可以影响人晶状体上皮细胞(LECs)的增生过程,而LECs可终生表达PDGF-α受体(PDGFR-α),PDGFR-α活化后与PDGF结合能促进细胞的DNA合成.反义寡核苷酸(ASODN)技术沉默PDGFR-α基因表达可抑制增生性玻璃体视网膜病变(PVR)过程中视网膜色素上皮(RPE)细胞的增生,并诱导细胞凋亡,但通过该技术是否能够抑制LECs的增生鲜见报道. 目的 研究PDGFR-α沉默对LECs增生的影响,为防治晶状体后囊膜混浊(PCO)提供实验依据.方法 用含胎牛血清的改良型α-MEM培养液体外培养人LECs系SRA01/04细胞株并传代,转染前1d用无抗生素的培养基培养细胞至30％ ～ 50％融合后将细胞以5×104个/孔的密度接种于6孔板,接种24 h后采用脂质体进行LECs转染,按照转染物的不同分为空白对照组(不加PDGFR-α ASODN的空白脂质体)、PDGFR-α错义寡核苷酸(MSODN)组(含PDGFR-α ASODN和脂质体)、0.5μmol/L PDGFR-α ASODN组(含0.5 μmol/L PDGFR-αASODN和脂质体)和1.0μmol/L PDGFR-α ASODN组(含1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN和脂质体).转染24 h后倒置显微镜下观察各组人LECs的形态学变化,采用逆转录PCR(RT-PCR)法检测各组LECs中PDGFR-αmRNA的表达;用MTT比色法检测各组细胞的增生(A490)值,计算转染物对LECs的抑制率;采用流式细胞仪分析各组LECs的细胞周期. 结果 转染后24 h,空白对照组及PDGFR-α MSODN组LECs生长良好,细胞呈多边形,数目多;而PDGFR-α ASODN组细胞呈圆形,细胞数目明显减少.RT-PCR检测表明,空白对照组及PDGFR-α MSODN组PDGFR-α mRNA在LECs中的表达较强,而在PDGFR-α ASODN组中的表达强度明显减弱,以1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN组更为明显.空白对照组、PDGFR-α MSODN组、0.5μmol/L PDGFR-αASODN组及1.0μmol/L PDGFR-α ASODN组的A490值分别为0.661±0.036、0.655 ±40.016、0.529±0.030和0.441 ±0.039,其中0.5μmol/L PDGFR-α ASODN组及1.0μmol/L PDGFR-α ASODN组的A490值明显低于空白对照组和PDGFR-α MSODN组,总体比较差异有统计学意义(F=34.08,P＜0.01).空白对照组、PDGFR-αMSODN组、0.5 μmol/L PDGFR-α ASODN组及1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN组G1期细胞百分数分别为(47.73±1.18)％、(49.48±1.09)％、(53.31±1.30)％和(59.98±0.95)％,总体比较差异有统计学意义(F=68.41,P＜0.01),其中0.5 μmoL/L PDGFR-αASODN组及1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN组G1期细胞百分数明显高于空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 PDGFR-α沉默能抑制人LECs的增生.     

甘糖酯对囊袋法培养的兔晶状体上皮细胞增生的抑制作用

目的应用甘糖酯（PGMS）抑制囊袋法培养的兔晶状体上皮细胞（LECs）的增生和移行能力,探讨其对后发性白内障的预防和治疗作用。方法健康纯种白兔30只模拟白内障囊外摘出术（ECCE）建立兔LECs体外培养的囊袋模型,将制备好的囊袋浸泡于不同质量浓度的PGMS中分别作用不同时间。实验组分别用0.2、0.4、0.8g/LPGMS浸泡晶状体囊袋,作用时间分别为2、5、10min,空白对照组晶状体囊袋不用PGMS浸泡。囊袋置于含质量分数5%胎牛血清的DMEM培养液中培养。7d后以囊膜细胞覆盖率作为评价指标,观察兔LECs增生、移行情况;应用苏木精-伊红染色法进行组织病理学检查,观察LECs的形态及其与晶状体囊袋的结合情况;透射电镜下观察后囊膜上LECs的超微结构。结果对照组在培养的第3天可见LECs呈铺路石样生长,第7天后囊膜LECs的覆盖率达100%;各实验组LECs的覆盖率较对照组明显下降（P〈0.05）。实验组随着PGMS质量浓度的增加和作用时间的延长,细胞增生、移行的速度明显减慢,其中质量浓度为0.8g/L,作用时间5min和10min组显著抑制兔LECs生长,与对照组和0.2g/LPGMS培养组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。病理组织学检测表明0.4g/L及0.8g/LPGMS作用2min组晶状体后囊膜LECs数目较对照组和0.2g/LPGMS组明显减少,细胞与囊膜连接不紧密。透射电镜下可见对照组和0.2g/LPGMS组LECs结构完整;0.4g/L及0.8g/LPGMS组可见细胞内有较多溶酶体,细胞质空泡样变性等退行性改变。结论 PGMS对囊袋培养的兔LECs的增生、移行的抑制作用呈质量浓度及时间依赖性。     

后囊膜混浊的体外上皮-间质转化模型的建立

背景 上皮-间质转化(EMT)是导致后囊膜混浊(PCO)的主要发病机制之一,研究LECs的EMT过程对PCO的防治具有重要意义,但目前缺乏研究EMT的PCO体外细胞模型. 目的 建立新的人晶状体囊外摘出术PCO的体外囊袋培养模型,探讨PCO形成过程中LECs EMT的发生情况.方法 利用健康供体的40只尸眼行体外模拟的白内障摘出术,游离晶状体囊袋后用昆虫针固定于培养皿,置于含体积分数10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养4周,分别于培养后0、3、7、14和28 d在光学显微镜下观察培养囊袋中LECs的生长情况;收集0、3、7和28 d的囊袋组织制备组织病理学切片,采用苏木精-伊红染色法检测囊袋上LECs的细胞形态;采用免疫组织化学染色法检测EMT标志物α-SMA、E-cadherin和Vimentin蛋白在囊袋上LECs中的表达和定位;采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测不同时间点囊袋上LECs中α-SMA、E-cadherin和Vimentin mRNA及其蛋白的表达变化. 结果 未进行培养的囊袋后囊膜上未发现LECs生长,囊袋培养后3d可见后囊膜周边出现LECs并逐渐向中央区增生,培养后7 d LECs完全覆盖后囊膜,略呈铺路石样外观并出现皱褶,此后随着培养时间的延长皱褶的数量增多并伸长,囊袋张力增强.免疫组织化学染色结果显示,随培养时间的延长,囊袋上LECs中E-cadherin的表达强度逐渐下降,而α-SMA和Vimentin的表达强度逐渐增强.实时荧光定量PCR检测表明,培养后0、3、7、14和28 d囊袋上LECs中E-cadherin mRNA的相对表达量分别为3.35±0.13、1.47±0.20、1.13±0.14、1.00±0.85和0.23±0.03,Vimentin mRNA的相对表达量分别为1.00±0.73、1.05±0.14、2.24±0.43、2.84±0.34和8.570±0.40,α-SMA mRNA的相对表达量分别为1.00±0.06、2.68±0.28、4.24±0.05、2.05±0.90和15.30±0.19,总体比较差异均有统计学意义(E-cadherin mRNA:F=23.430,P=0.000;Vimentin mRNA:F=8.915,P=0.002;α-SMA mRNA:F=103.500,P=0.000),其中培养后28 d囊袋上LECs中E-cadherin mRNA的相对表达量最低,而Vimentin mRNA和α-SMA mRNA的相对表达量均最高,差异均有统计学意义(均P＜0.01).Western blot检测结果表明,培养后0、3和28 d囊袋上LECs中E-cadherhin蛋白表达的灰度值分别为1.443±0.017、1.023±0.003和0.568±0.018,Vimentin蛋白表达的灰度值分别为0.565±0.012,1.156±0.007和1.241 ±0.009,α-SMA蛋白表达的灰度值分别为0.195±0.045,0.693±0.036和1.501±0.005,总体比较差异均有统计学意义(E-cadherhin:F=2 787.000,P=0.000:Vimentin:F=4 488.000,P=0.000;α-SMA:F=1 173.000,P=0.000),其中培养后3、28 d LECs中E-cadherhin蛋白表达明显低于0d,而Vimentin和α-SMA蛋白表达明显高于0d,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究中的新囊袋模型进行LECs体外培养能模拟体内白内障术后晶状体后囊LECs的EMT自然过程,是探讨PCO发生机制和方法新的体外细胞模型.     

自噬抑制剂3-MA对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

背景糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病常见的并发症之一,视网膜色素上皮(RPE)细胞作为视网膜重要的组成细胞在DR的发生和发展中至关重要. 目的 探讨自噬抑制剂3-MA对高糖培养的人RPE细胞(hRPECs)增生的影响.方法 将体外培养的hRPECs分为对照组、高糖组和3-MA+高糖组,对照组细胞用含5 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基进行培养,高糖组采用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培养基进行培养,干预组细胞先在DMEM/F12培养基中添加10 mmol/L的3-MA处理1h后,再添加30 mmol/L葡萄糖溶液进行培养.将培养的细胞以1×105/孔的密度接种于24孔细胞培养板中,待细胞80％融合后用含体积分数0.5％胎牛血清的培养基继续孵育24 h,使细胞周期同步化.倒置光学显微镜和透射电子显微镜下观察各组jRPECs的形态及超微结构;采用CCK-8法检测各组hRPECs的增生率;采用Western blot法检测各组hRPECs中自噬相关基因微管相关蛋白轻链3B(LC3B)蛋白的表达.结果 对照组细胞生长状态良好,细胞排列整齐;高糖组细胞体积稍增大,细胞数量明显多于对照组,而3-MA+高糖组细胞形态不规则,排列紊乱.透射电子显微镜下可见对照组细胞核呈圆形或卵圆形,亚细胞器形态均正常,未发现自噬小体;高糖组细胞中可见自噬溶酶体,而3-MA+高糖组可见自噬小体.对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞的增生率分别为(100.0±2.0)％、(116.9±5.2)%和(103.7±4.7)％,总体比较差异有统计学意义(F=13.526,P=0.006),高糖组的细胞增生率明显高于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),3-MA+高糖组与对照组间细胞增生率的差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组比较,高糖组细胞中LC3B-Ⅰ蛋白表达减弱,LC3B-Ⅱ蛋白表达增强,而3-MA+高糖组细胞中LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ蛋白的表达强度与对照组接近.对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值分别为0.131±0.065、2.504±0.097和0.274±0.007,组间总体比较差异有统计学意义(F=1 694.676,P=0.000),高糖组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值明显高于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),3-MA+高糖组与对照组间细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ值的差异无统计学意义(P＞0.05).结论 高糖可激活自噬过程并促进hRPECs增生,而自噬抑制剂3-MA在一定程度上抑制自噬进程,从而发挥抑制细胞增生的作用.     

多聚赖氨酸-乙二胺四乙酸交联物抑制兔晶状体上皮细胞生长的研究

背景后囊膜混浊（PCO）是现代白内障囊外摘出术后引起视力下降的主要原因。研究证实多聚赖氨酸-乙二胺四乙酸（EDTA）交联物（PLE）能够降低兔PCO的发生率。目的研究PLE对体外培养的兔晶状体上皮细胞（LECs）生长的抑制作用及有效药物浓度。方法取3月龄新西兰白兔晶状体前囊膜进行体外植块培养获得兔LECs并进行传代,取第2～3代传代培养的LECs消化后按1×10^5个／ml密度接种于96孔培养板中。在培养皿中加入12．5、25．0、50．0、100．0μmol／L的PLE,培养皿中加入DMSO培养液作为对照组。PLE作用48h用MTT比色法测定PLE对兔LECs增生的抑制作用并计算各浓度PLE组的吸光度（A490）值及其抑制率。结果≤25．0μmol／LPLE组可见细胞生长及形态改变不明显。≥50．0μmol／LPLE各组可见细胞生长及形态有明显改变,增生缓慢,生长差,数量减少,贴壁能力减弱。12．5、25．0、50．0、100．0μmol／L的PLE组LECs的A490值分别为0．278±0．013、0．266±0．028、0．260±O．022和0．247±0．012,均明显低于DMSO对照组的O．311±0．038（P=0．035、0．011、0．009、0．013）,且呈明显的剂量一效应依赖关系。12．5、25．0、50．0、100．0μmol／LPLE组对兔LECs的抑制率分别为10．61％、14．47％、16．40％和20．58％。结论PLE可以浓度依赖的方式抑制兔LECs的生长,可为临床筛选出防治PCO的药物提供依据。     

核心蛋白多糖对兔晶状体上皮细胞增生的抑制作用

背景 研究发现,白内障囊外摘出术后组织修复反应可诱导房水中活性转化生长因子β(TGF-β)的增加,残留的晶状体上皮细胞(LECs)移行、分化,细胞外基质沉积,引起上皮-间质转化,导致后囊膜混浊(PCO)的发生.寻求有效的抑制LECs增生的药物对于临床上防治PCO的发生具有重要意义. 目的 探讨核心蛋白多糖( decorin)对兔LECs增生的抑制作用及其剂量-效应与时间-效应的关系. 方法 兔LECs细胞株进行培养和传代,将处于指数生长期的细胞以8×106个/L密度接种于96孔板,将0.1、1.0、10.0 mg/Ldecorin分别加入培养基中培养24、48、72 h,加入体积分数0.1％ DMSO培养的细胞为阳性对照组,常规培养基培养的细胞为空白对照组.MTT比色法分别测定不同质量浓度的decorin作用于LECs不同时间后的细胞生长抑制率;采用流式细胞技术测定各组细胞的细胞周期,用ELISA法检测各组培养液上清中TGF-β的水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定TGF-βmRNA在LECs中的表达,免疫细胞化学法观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达.结果 ELISA检测结果表明,各组培养基上清液中TGF-β表达量的差异有统计学意义(F=39.24,P=0.03),不同质量浓度组TGF-β水平均明显低于空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),1.0 mg/L、10.0 mg/L decorin组TGF-β水平均明显低于0.1 mg/L decorin组(P＜0.05).MTT比色法结果显示,≥1.0 mg/L decorin组LECs增生的抑制率明显高于空白对照组,各质量浓度decorin组药物作用48 h和72 h后LECs增生的抑制率明显高于24 h的值,药物作用72 h后LECs增生的抑制率明显高于48 h的值,差异均有统计学意义(P＜0.05),各质量浓度decorin组G0/G1期LECs所占比例均较空白对照组明显增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR检测显示,TGF-β mRNA的表达随着decorin质量浓度的升高而降低.免疫组织化学染色表明,10.0 mg/L decorin组α-SMA在LECs中的表达明显弱于空白对照组. 结论 Decorin可以抑制LECs的增生,也可以诱导LECs凋亡,其效应呈明显的剂量和时间依赖性,有望成为最具潜力的防治PCO的药物之一.     

过氧化氢诱导的急性氧化应激对人晶状体上皮细胞形态、生存率及衰老标记蛋白30(SMP30)表达的影响

目的 探讨过氧化氢诱导的急性氧化应激对人晶状体上皮细胞形态、生存率及衰老标记蛋白30(senescence marker protein30,SMP30)表达的影响.方法 采用不同浓度过氧化氢(0μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1)处理人晶状体上皮细胞24 h,建立不同浓度急性氧化应激模型,通过光镜观察、MTT分析细胞形态、生存率,Western blot检测SMP30蛋白的表达情况.结果 不同浓度过氧化氢处理细胞24 h后,100 μmol·L-1处理组和200 μmol·L-1处理组细胞密度、生长活力下降,细胞形态改变,开始出现变圆变大的细胞,胞体拉长,边界不清;300 μmol·L-1处理组细胞密度明显降低,细胞出现破碎,溃解.随着过氧化氢浓度的增高,细胞生存率逐渐下降,各处理组与对照组(Oμmol·L-)间相比,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).在对照组及100 μmol·L-1处理组、200 μmol·L-1处理组晶状体上皮细胞SMP30蛋白相对表达量分别为0.273±0.055、0.464±0.058、0.442±0.050,100 μmol·L-1处理组、200 μmol·L-处理组SMP30蛋白的表达均较对照组提高,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05),100 μmol·L-1处理组和200 μmol·L-1处理组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在急性氧化应激状态下人晶状体上皮细胞形态改变,生存率下降,SMP30蛋白表达上调,SMP30蛋白可能参与晶状体上皮细胞急性氧化应激损伤过程.     

槲皮素对高压氧诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用

背景 氧化应激诱导的晶状体上皮细胞( LECs)凋亡与c-Jun氨基末端激酶(JNK)细胞信号通路有关;槲皮素能抑制JNK细胞信号通路并且有显著的抗氧化作用,但其对高压氧诱导的人LECs损伤有无保护作用有待研究. 目的 研究高压氧诱导人LECs凋亡的作用及槲皮素对高压氧处理的人LECs的保护作用,探讨JNK细胞信号通路在上述过程中的作用.方法 人LECs细胞系SRA01/04在MEM培养基中进行培养,传至第3代进行实验.实验细胞分为空白对照组、高压氧组(体积分数99％ O2+体积分数1％ CO2)、高压氧+SP600125组和高压氧+槲皮素组,实验前2h分别在后2个组人LECs培养基中加入20μmol/L JNK2特异性抑制剂(SP600125)或1μmol/L槲皮素预孵育,除空白对照组外,其他3个组于588 kPa高压氧舱处理6h后收集人LECs.应用MTT法检测各组人LECs的细胞活力,以570 nm处吸光度(A)值表示.用流式细胞仪以Annexin V-FITC试剂盒检测人LECs处理后各组细胞的凋亡率,通过Western blot法检测各组人LECs中JNK/p-JNK、c-Jun/p-c-Jun、caspase-3、caspase-9的蛋白表达情况. 结果 实验6h后,高压氧组、高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs活力分别为0.450±0.083、0.654±0.079、0.649±0.090,明显低于空白对照组(0.835±0.082),差异均有统计学意义(P=0.001);高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs活力明显高于高压氧组(P=0.003、0.002).高压氧组、高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs凋亡数分别为19.77±1.44、8.45±0.93、7.79±0.78,明显高于空白对照组的3.17±0.74,差异有统计学意义(P=0.000);高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs细胞凋亡数明显少于高压氧组,差异均有统计学意义(P=0.000).同时,高压氧组人LECs中p-JNK、p-c-Jun、caspase-3和caspase-9蛋白的表达量明显高于空白对照组,差异均有统计学意义(P=0.000),而高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs中p-JNK、p-c-Jun、caspase-3和caspase-9蛋白的表达量明显低于高压氧组,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 JNK细胞信号通路在高压氧诱导的人LECs凋亡发生发展中起重要作用,SP600125和低浓度的槲皮素能抑制JNK细胞通路和细胞内源性凋亡途径,减轻高压氧引起的人LECs损伤.     

微小RNA-133b对紫外线诱导的晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用及其调控机制

背景 研究证实紫外线B照射是白内障发生的主要原因之一,其机制与晶状体上皮细胞(LECs)凋亡有关.微小RNA-133b(miR-133b)参与氧化应激诱导的LECs凋亡的调控过程,但其是否参与紫外线诱导白内障的发病过程及其机制尚未阐明. 目的 观察miR-133b对紫外线诱导白内障LECs凋亡的抑制作用及其调控机制.方法 将20只8周龄SPF级C57 BL/6小鼠采用随机数字表法分为白内障模型组和正常对照组,其中白内障模型组小鼠用波长302 nm的紫外线直接照射眼部5 min,照射强度为300 W/cm2,每天照射1次,共照射1周;正常对照组小鼠不给于任何干预.于末次照射后24 h处死各组小鼠并摘出10只眼球以制备全眼球切片.取人LECs细胞系(SRA01/04)紫外线照射25 min,并继续培养4h作为紫外线照射组,正常对照组细胞不作任何干预.取紫外线照射模型组细胞接种于96孔板并分为miR-133b模拟物组、模拟物阴性对照组、miR-133b抑制物组和抑制物对照组,分别用lipofectamine2000联合50 nmol/L miR-133b模拟物、miR-133b模拟物对照剂、100 nmol/L miR-133b抑制物或miR-133b抑制物对照剂瞬时转染细胞.采用实时荧光定量PCR法检测小鼠晶状体组织和不同转染组入LECs中miR-133b mRNA及其预测靶基因BCL2L2mRNA的表达以评估转染效率;采用TUNEL凋亡检测试剂盒检测小鼠晶状体组织中LECs和不同转染组人LECs的凋亡情况.结果 正常对照组小鼠晶状体前囊膜LECs排列规则,未发现TUNEL染色阳性细胞,白内障模型组小鼠LECs排列稀疏,可见凋亡细胞呈红色荧光.紫外线照射组细胞凋亡率为(43.90±9.30)％,明显高于正常对照组的(1.08±0.49)％,差异有统计学意义(t=-7.963,P=0.015).白内障模型组小鼠晶状体组织和紫外线照射组细胞中miR-133b mRNA的相对表达量分别低于正常对照组小鼠和正常人LECs,差异均有统计学意义(t=-2.958,P=0.042;t=-6.195,P=0.003).白内障模型组小鼠晶状体组织和紫外线照射组细胞中BCL2L2 mRNA的相对表达量分别高于正常对照组小鼠和正常人LECs,差异均有统计学意义(t=3.761,P=0.020;t 12.437,P=0.000).miR-133b模拟物组人LECs中miR-133b mRNA的相对表达量明显高于miR-133b模拟物对照组,而BCL2L2 mRNA的相对表达量明显低于miR-133b模拟物对照组,差异均有统计学意义(t=10.883、-5 927.617,均P＜0.01);miR-133b抑制物组人LECs中miR-133b mRNA的相对表达量明显低于miR-133b抑制物对照组,而BCL2L2 mRNA的相对表达量明显高于miR-133b抑制物对照组,差异均有统计学意义(t=-1 606.622、17.556,均P＜0.01).miR-133b模拟物组LECs凋亡率明显低于miR-133b模拟物对照组[(17.55±4.24)％与(43.62±9.19)％],miR-133b抑制物组LECs凋亡率为(78.23±12.42)％,明显高于miR-133h抑制物对照组的(48.01±9.68)％,差异均有统计学意义(t=-4.462,P=0.011;t=3.324,P=0.029).结论 miR-133b可防止紫外线照射所致的白内障的形成,其机制可能与靶向负性调控BCL2L2基因从而调控LECs的凋亡过程有关.     

密闭囊袋冲洗系统模拟抑制人晶状体上皮细胞的研究

目的 利用密闭囊袋冲洗系统和人后发性白内障(PCO)囊袋模型,研究三氧化二砷(As2O3)在短时间内对PCO的防治作用.方法 实验研究.严格将时间控制在2 min时,在细胞培养条件下,四甲基偶氮唑盐比色法观察As2O3对人晶状体上皮细胞(LEC)系FHL124细胞的抑制作用;乳酸脱氢酶释放实验观察As2O3对FHL124细胞的损伤作用;荧光显微镜动态检测细胞内Ca2+浓度的变化.建立人PCO囊袋模型,应用密闭囊袋冲洗系统观察As2O3对原代人LEC的作用.浓度反应曲线用Hill公式求IC50值.所有实验数据结果用均数±标准差表示,采用SPSS 13.0软件处理,组间差异用单因素方差分析,组间两两比较用Dunnett检验.结果 As2O3在作用仅2 min的情况下,就可以抑制人LEC和清除残留于囊袋内的人原代LEC.As2O3(10、30、100、300、1000 μmol/L)对FHL124细胞的作用呈剂量依赖性,100 μmol/L以上浓度的As2O3对FHL124细胞具有明显的毒性作用.与对照组比较,差异有统计学意义(t=5.217,P＜0.01),半效抑制量(IC50)=130 μmol/L.乳酸脱氢酶检测显示,As2O3可影响细胞膜结构的完整性.细胞内动态Ca2+检测显示,As2O3对细胞内Ca2+作用呈剂量依赖性.高浓度As203可引起细胞内Ca2+库释放,同时抑制细胞的Ca2+内流,最终导致细胞内Ca2+稳态的破坏而引起细胞的死亡.1×104 μmol/L As2O3作用2 min后,使Ca2+内流的幅值及速度分别降低了(43.24±2.98)%(t=3.134,P＜0.01)和(46.27±6.01)%(t=3.521,P＜0.01).人PCO囊袋模型显示,联合应用As2O3和密闭囊袋冲洗系统可以在2 min内清除残留于囊袋内的原代人LEC.结论 As2O3可以在短时间内彻底清除白内障手术中存留于囊袋内的人LEC,与密闭囊袋冲洗系统结合可能抑制PCO的发生.     

腺病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶／丙氧鸟苷系统抑制晶状体后囊膜混浊的研究

背景晶状体后囊膜混浊（PCO）目前尚无有效的防治途径。目的研究腺病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）／丙氧鸟苷（GCV）系统对PCO的抑制作用。方法选取新西兰白兔12只,用电脑随机选号法随机分为BSS＋BSS组、BSS＋GCV组、HSV-tk＋BSS组及HSV-tk＋GCV组,每组3只。兔眼行晶状体超声乳化摘出术,术中依据分组情况分别在晶状体囊袋中注入0．1mlBSS或携带有HSV-tk基因的腺病毒载体,术后12h分别在BSS＋BSS组和HSV-tk＋BSS组兔眼前房注入0．1mlBSS,BSS＋GCV组及HSV-tk＋GCV组以同样的方法注入GCV,每日1次,共3次。术后裂隙灯下观察眼前节情况,PCO分级按照Couderc的方法。术后4周摘除兔眼,采用Miyake-Apple法观察PCO情况,显微镜下取出晶状体囊袋后以电子天平称出整个囊袋湿质量,并行晶状体囊袋的组织学检查。结果术后1～3d各组均可见角膜轻度水肿与房水混浊,2周内基本恢复正常。术后4周,HSV-tk＋GCV组PCO明显轻于其他3组,差异均有统计学意义（H=2．647、H=2．939、H=2．884,P〈O．05）,而BSS＋BSS组、BSS＋GCV组、HSV-tk＋BSS组组间的差异均无统计学意义（H=0．631、H=0．924、H=0．589,P〉0．05）。Miyake-Apple法观察显示,HSV-tk＋GCV组PCO面积与密度小于其他3组,晶状体囊袋湿质量也明显轻于其他3组,差异均有统计学意义（q=9．93、q=10．15、q=10．07,P〈O．05）,BSS＋BSS组、BSS＋GCV组、HSV-tk＋BSS组组间差异均无统计学意义（q=0．22、q=0．07、q=015,P〉0．05）。囊袋组织学检查提示HSV-tk＋GCV组可见少量赤道部晶状体上皮细胞（LECs）增生并向后囊膜迁移,在囊袋外周形成稀薄的soemmering环,在中央部无细胞和皮质,或仅形成单细胞层纤维膜。BSS＋BSS组、BSS＋GCV组、HSV—tk＋BSS组可见大量赤道部LECs增生和迁移,在囊袋外周部soemmering环稠厚,在中央部形成多细胞层纤维膜。结论腺病毒载体介导的HSV-tk／GCV系统能有效抑制PCO。     

PI3K抑制剂LY294002对人晶状体上皮细胞中S期激酶相关蛋白2表达的影响

目的探讨PI3K抑制剂LY294002对体外培养的人晶状体上皮细胞（LECs）增生和细胞周期S期激酶相关蛋白2（Skp2）表达的影响。方法 MTT比色法检测25μmol/L的LY294002处理人LECs细胞株SRA01/04后12h和24h细胞的增生情况;流式细胞仪检测LY294002作用24h后细胞周期的分布情况;Westernblot和real-timePCR法分别测定LY294002处理24h后细胞中Skp2及其mRNA的表达情况。结果 25μmol/L的LY294002作用于SRA01/04细胞0～24h,SRA01/04细胞的增生受抑制,且作用24h时对SRA01/04细胞的抑制作用最明显。LY294002组中处于G1期和S期的细胞占总细胞数的百分率分别为（66.15±2.63）%和（27.34±6.58）%,对照组为（56.73±1.35）%和（37.32±5.54）%,LY294002组细胞Skp2及其mRNA的表达量明显减少。结论 PI3K抑制剂LY294002可抑制人LECs的增生,使部分细胞停滞于细胞周期的G1期,LY294002抑制人LECs的增生可能与Skp2的表达下调有关。     

Smac对人晶状体上皮细胞增生的抑制作用及促凋亡作用

背景 晶状体后囊膜混浊(PCO)是囊外白内障摘出术后的主要并发症,其发病机制与晶状体上皮细胞(LECs)的增生、移行和上皮-间质转化(EMT)有关,探讨相关的预防和靶向治疗措施至关重要.目的 探讨Smac对人LECs增生和凋亡的作用及防治PCO的生物学作用. 方法 对HLE-B3细胞株及Smac过表达人LECs株进行培养,将培养的HLE-B3细胞分为PBS组、空质粒转染组和siRNA-Smac3转染组,分别将PBS、空质粒载体和带有增强型绿色荧光蛋白(GFP)的siRNA-Smac3质粒转染细胞24 h,计算siRNA-Smac3质粒转染率.在细胞培养液中分别添加不同质量浓度(5、10、20和50 μg/ml)TGF-β2或200 μmol/LH2O2以建立PCO模型或氧化应激凋亡模型.将细胞分为PBS组、TGF-β2组和Smac过表达+TGF-β2组,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞增生活力;将细胞分为PBS组、H2O2组和siRNA-Smac+H2O2组,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;分别采用实时定量PCR和Western blot法检测培养的细胞中Smac、caspase-3及增生细胞核抗原(PCNA)mRNA及蛋白的相对表达量. 结果 siRNA-Smac3质粒转染细胞后GFP阳性细胞达80％以上,荧光定量PCR筛选出最佳干扰质粒为siRNA-Smac3.siRNA-Smac3转染组GFP阳性细胞率为(72.32±2.31)％,明显高于空质粒载体组的(4.91±0.24)％,差异有统计学意义(t=116.342,P＜O.001).LECs中Smac mRNA相对表达量为35.21±4.11,高于空质粒载体组的15.24±2.48,差异有统计学意义(t=215.47,P＜0.05).20 μg/ml TGF-β2作用后PBS组、TGF-β2组和Smac过表达+TGF-β2组的细胞增生率分别为(98.4±1.7)％、(98.9±0.1)％和(64.2±3.1)％,Smac过表达+TGF-β2组明显低于TGF-β2组,差异有统计学意义(P＜0.05).PBS组、H2O2组和siRNA-Smac+H2 O2组细胞凋亡率分别为(2.9±1.2)％、(45.1±4.5)％和(27.5±1.8)％,siRNA-Smac+H2 O2组细胞凋亡率明显低于H2O2组,差异有统计学意义(P＜0.05).荧光定量PCR结果显示,PBS组、H2 O2组和siRNA-Smac+ H2 O2组caspase-3 mRNA相对表达量分别为0.321±0.103、0.715±0.112和0.479±0.209,siRNA-Smac+H2O2组细胞中caspase-3 mRNA相对表达量明显低于H2 O2组,差异有统计学意义(P＜0.05);PBS组、TGF-β2组和Smac过表达+TGF-β2组细胞中PCNA mRNA相对表达量分别为0.299±0.013、0.645±0.102和0.490±0.209,与TGF-β2组比较,Smac过表达+TGF-β2组细胞中PCNA mRNA相对表达量明显下降,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot结果显示,caspase-3蛋白在siRNA-Smac+H2O2组和H2O2组相对表达量为0.712±0.012和0.973±0.051,siRNA-Smac+ H2 O2组细胞中caspase-3蛋白的相对表达量明显低于H2O2组,差异有统计学意义(t=132.52,P＜0.05);PCNA在Smac过表达+TGF-β2组和TGF-β2组,相对表达量为0.782±0.212,相对表达量为1.126±0.251,Smac+TGF-β2组PCNA蛋白相对表达量显著低于TGF-β2组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Smac基因抑制人LECs株HLE-B3细胞系的增生并促进细胞的凋亡,其可能用于防治PCO.     

去整合素kistrin对兔眼晶状体后囊Ⅳ型胶原表达的影响

背景 白内障囊外摘出术后残留的晶状体上皮细胞(LECs)增生是后囊膜胶原产生进而形成后发性白内障的生物学基础,去整合素可与细胞外基质(ECM)竞争结合整合素分子,理论上可以防治后发性白内障的形成,但其具体的作用机制有待进一步研究. 目的 研究去整合素kistrin对兔眼晶状体后囊Ⅳ型胶原表达的影响.方法24只新西兰大白兔按照随机数字表法分为kistrin注射组及生理盐水对照组,每组12只.两组兔均行右眼透明晶状体囊外摘出术,建立兔晶状体后囊膜混浊(PCO)模型,术毕kistrin注射组囊袋内注入80 mg/L kistrin 0.2 ml,生理盐水对照组注入等量生理盐水.术后1、3、5、7、14 d,在裂隙灯下观察实验动物晶状体PCO情况,并按照Odrich法进行分级.术后14d及3个月分别处死两组兔各6只,取出晶状体进行常规石蜡切片,行苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察晶状体病理改变;行Masson染色观察晶状体囊袋内胶原纤维增生情况,免疫组织化学法检测兔晶状体后囊Ⅳ型胶原的表达. 结果 术后14 d,生理盐水对照组与kistrin注射组各级PCO的眼数差异无统计学意义(P=0.093),术后1、2、3个月,生理盐水对照组形成2～3级PCO的眼数明显多于kistrin注射组,差异均有统计学意义(P=0.041、0.014、0.022).晶状体组织学检查表明,术后14 d生理盐水对照组LECs层数明显多于kistrin注射组,瞳孔区后囊膜可见单层细胞黏附,kistrin注射组后囊则保持光滑,术后3个月可见生理盐水对照组晶状体后囊的LECs转化为纤维细胞,kistrin注射组较少见.Masson染色显示术后3个月生理盐水对照组晶状体前囊膜撕囊口处与后囊膜之间胶原纤维的蓝绿色染色明显多于kistrin注射组.免疫组织化学染色表明,术后14 d及30 d,生理盐水对照组晶状体后囊膜Ⅳ型胶原的灰度值均明显低于kistrin注射组,差异均有统计学意义(P=0.000、0.001). 结论 去整合素kistrin能够抑制兔眼晶状体囊外摘出术术后晶状体后囊LECs和Ⅳ型胶原增生.     

多西他赛对人晶状体上皮细胞的抑制作用

背景一些已知的抑制人晶状体上皮细胞（LECs）增生的药物由于严重的不良反应限制了其临床应用，寻找高效、安全的抑制LECs增生的药物是防治晶状体后囊膜混浊（PCO）的研究热点。目的探讨多西他赛对LECs增生的影响，并与盐酸表柔比星、盐酸吡柔比星和雷替曲塞的作用进行比较。方法对永生系人LECs细胞株SRAOI／04进行培养及传代，将不同浓度的多西他赛、盐酸表柔比星、盐酸吡柔比星和雷替曲塞加入LECs中分别作用24、48、72h，以MTT法评价不同浓度的多两他赛对人LECs增牛的抑制作用并与其他药物进行比较。用流式细胞术分析不同浓度的多西他赛作用48h后对LECs细胞周期的影响，采片jAnnexinV-FITC／PI标记法和蛋白印迹分析法评估不同浓度的多西他赛作用48h后LECs细胞bcl-2蛋白的表达和凋亡情况。结果8～519pmol／L多西他赛组LECs的增生率为100％，LECs形态正常，而66nmol／L多西他赛组干预48h和72h后LECs的增生率分别为34．7％和27．4％，LECs形态出现异常。23．22～523．56μmol／L雷替曲塞对人LECs的增生无明显抑制作用。多西他赛作用48h和72h时，半数抑制量（IC50）明显低于盐酸吡柔比星和盐酸表柔比星。多西他赛作用LECs48h后，随着多西他赛浓度的增高，处于G2／M期的LECs百分数明显增加，各组的总体差异有统计学意义（F=2633．05，P〈0．01）；8．3nmol／L和266nmol／L多西他赛浓度组干预48h后，LECs的凋亡率分别为22．4％和27．9％，较细胞对照组升高，差异均有统计学意义（χ2=20．00，P〈0．01；χ2=42．68，P〈0．01）。Westernblot检测表明不同浓度多西他赛干预后bcl-2蛋白在LECs中的表达条带均较对照组淡，8．3nmol／L多西他赛组bcl-2蛋白表达降低更为明显。结论多西他赛、盐酸表柔比星和盐酸吡柔比星均可抑制人LECs的增生，而雷替曲塞对人LECs的增生无明显的抑制作用。多西他赛对LECs增生的抑制作用强于其他药物，其作用强度呈浓度和时间依赖性。