miR-26a对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及机制研究

目的 分析miR26a在葡萄膜黑色素瘤中的表达及对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响.方法 对葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5、M23及正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19行RT-PCR实验,检测3种细胞系中miR-26a的相对表达差异;将葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5分成miR-26a模拟物组和NC组,分别转染miR-26a mimics和对照序列scramble,用CCK-8实验和流式细胞术分别检测两组细胞增殖和凋亡;采用细胞划痕实验及Transwell实验分别检测两组细胞的迁移和侵袭能力;采用Western blot检测其下游蛋白组蛋白甲基化转移酶果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)的表达水平.结果 葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5中miR-26a相对表达量为0.250±0.029,细胞系M23中为0.350±0.017,正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19中miR-26a相对表达量为1.0,在细胞系SP6.5及M23中miR-26a的相对表达量均低于正常葡萄膜上皮细胞系ARPE-19中miR-26a的相对表达量(均为P＜0.001).miR-26a模拟物组在培养72 h、96 h、120 h OD450值(0.69 ±0.09、1.23 ±0.15、2.12±0.23)均显著低于NC组(1.39±0.11、2.35 ±0.25、3.53±0.27),差异均有统计学意义(均为P＜0.05).miR-26a模拟物组细胞凋亡率(15.60±2.30)％高于NC组(5.00±0.70)％(P＜0.01);miR-26a模拟物组划痕愈合率(23.7±2.1)％低于NC组(68.9 ±5.1)％(P＜0.01);侵袭细胞数(45.1±3.9)个低于NC组(115.3±8.9)个(P＜0.O1).miR-26a模拟物组EZH2蛋白相对表达量(0.39±0.09)低于NC组(1.0;P＜0.01).结论 miR-26a在葡萄膜黑色素瘤中低表达,过表达miR-26a显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖,促进凋亡,并抑制迁移和侵袭,其可能是通过下调EZH2的表达来发挥作用的.     

miR-194在葡萄膜黑色素瘤细胞系中的表达及对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

目的　探讨miR-194在葡萄膜黑色素瘤细胞系中的表达及对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法　RT-PCR检测miR-194在正常视网膜上皮细胞系ARPE-19及葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5、M23及OM431中的表达。取SP6.5、M23及OM431细胞分成两组,miR-194过表达组（miR-194组）及阴性对照组（NC组）,经Lipofectamine^TM 2000分别转染miR-194 mimic及阴性对照序列scramble。CCK-8实验及流式细胞仪分别测定细胞增殖和凋亡能力,细胞划痕及Transwell实验分别测定细胞迁移和侵袭能力。Western blot测定叉头盒蛋白A1（forkhead box,FOXOA1)、多聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase,PARP)蛋白表达。结果　正常视网膜上皮细胞系ARPE-19中miR-194的相对表达量为1.03±0.04,葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5、M23及OM431相对表达量分别为0.25±0.02、0.37±0.02及0.47±0.03,葡萄膜黑色素瘤细胞系SP6.5、M23及OM431中miR-194相对表达量低于正常视网膜上皮细胞系ARPE-19(均为P<0.001 )。转染0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后,miR-194组和 NC组A值分别为:0.23±0.02、0.21±0.03（t=0.960,P=0.391）,0.38±0.02、0.37±0.03（t=0.480,P=0.656）,0.75±0.04、0.78±0.06（t=-0.720,P=0.511）,0.87±0.09、1.59±0.12（t=-8.313,P=0.001）,1.53±0.14、3.05±0.22（t=-10.096,P=0.000）;流式细胞仪检测结果显示:miR-194组细胞凋亡率为23.30%±2.10%,NC组为2.47%±0.30%,miR-194组细胞凋亡率高于NC组（t=17.007,P=0.000）。细胞划痕实验结果显示:miR-194组细胞划痕愈合率为25.3%±3.5%,NC组为72.9%±6.4%,miR-194组细胞划痕愈合率低于NC组（t=-11.302,P=0.000）;Transwell实验结果显示:200倍视野下,miR-194组侵袭细胞数为（188.6±20.7）个,NC组为（352.9±32.8）个,miR-194组侵袭细胞数少于NC组（t=-7.337,P=0.001）。miR-194组FOX A1蛋白相对表达量为0.29±0.03,NC组为1.03±0.06,miR-194组FOX A1蛋白相对表达量低于NC组（t=-19.106,P=0.000）;miR-194组裂解型PARP蛋白相对表达量为2.87±0.24,NC组为1.03±0.06,miR-194组裂解型PARP蛋白相对表达量高于NC组（t=12.882,P=0.000）。结论　miR-194在葡萄膜黑色素瘤细胞系中低表达,上调miR-194表达可抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖,促进凋亡,抑制迁移和侵袭,其机制可能与下调FOX A1及上调裂解型PARP蛋白表达有关。     

miRNA-19对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其机制研究

目的 探讨miR-19在葡萄膜黑色素瘤(UM)细胞中的表达及其对UM细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其作用机制.方法 qRT-PCR检测正常视网膜上皮细胞系ARPE-19和UM细胞系 SP6.5、M23中 miR-19的表达.将 M23细胞分为 miR-19 inhibitor 组(转染 miR-19-inhibit...     

SIRT1对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的表观遗传调控

目的: 探讨沉默信息调节蛋白1(SIRT1)对人葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响。方法: 实验研究。通过定量PCR和Western blot法检测SIRT1在葡萄膜黑色素瘤细胞(M23和SP6.5)和正常人葡萄膜黑色素细胞(DM78、UM95和UM96)中的表达。在葡萄膜黑色素瘤细胞(M23、SP6.5)中, 用EX527抑制SIRT1活性, 以溶剂DMSO作为阴性对照组;用SIRT1小干扰RNA(siSIRT1)转染细胞抑制SIRT1表达, 以无义小干扰RNA(NC)转染作为阴性对照组。细胞增殖实验(MTS)、流式细胞术、平板克隆形成实验分别检测细胞活性、细胞周期以及细胞克隆形成能力。裸鼠眼内成瘤实验检测葡萄膜黑色素瘤细胞眼内成瘤能力。Western blot法检测增殖相关蛋白。组间数据均采用独立样本t检验进行比较。结果: 与葡萄膜黑色素细胞相比, 葡萄膜黑色素瘤细胞(M23、SP6.5)中SIRT1 mRNA(t=17.08, P<0.001;t=13.24, P<0.001)和蛋白(t=6.26, P=0.008)表达水平显著升高。MTS结果显示, EX527抑制M23和...     

SIRT1对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的表观遗传调控

目的：探讨沉默信息调节蛋白1（SIRT1）对人葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响。方法：实验研究。通 过定量PCR和Western blot法检测SIRT1在葡萄膜黑色素瘤细胞（M23和SP6.5）和正常人葡萄膜黑色 素细胞（DM78、UM95和UM96）中的表达。在葡萄膜黑色素瘤细胞（M23、SP6.5）中，用EX527抑 制SIRT1活性，以溶剂DMSO作为阴性对照组；用SIRT1小干扰RNA（siSIRT1）转染细胞抑制SIRT1 表达，以无义小干扰RNA（NC）转染作为阴性对照组。细胞增殖实验（MTS）、流式细胞术、平板 克隆形成实验分别检测细胞活性、细胞周期以及细胞克隆形成能力。裸鼠眼内成瘤实验检测葡萄 膜黑色素瘤细胞眼内成瘤能力。Western blot法检测增殖相关蛋白。组间数据均采用独立样本t检验 进行比较。结果：与葡萄膜黑色素细胞相比，葡萄膜黑色素瘤细胞（M23、SP6.5）中SIRT1 mRNA （t=17.08，P<0.001；t=13.24，P<0.001）和蛋白（t=6.26，P=0.008）表达水平显著升高。MTS结果显示， EX527抑制M23和SP6.5细胞活性，并呈药物浓度依赖性；与NC转染组相比，siSIRT1转染组细胞 活性显著减弱（t=5.94，P<0.001；t=10.73，P<0.001）。与溶剂DMSO组相比，EX527处理组（t=5.10， P=0.047；t=7.57，P=0.002）和SIRT1 siRNA转染组（t=6.41，P=0.003；t=6.10，P=0.004）中处于G1期 的细胞比例均显著升高。另外，M23和SP6.5细胞EX527处理组（t=5.04，P=0.001；t=5.93，P<0.001） 和siSIRT1转染组（t=11.44，P<0.001；t=8.24，P<0.001）克隆形成数量显著降低。在裸鼠眼内成瘤实 验中，与NC组相比，siSIRT1转染组眼内瘤体大小显著变小（t=5.50，P<0.001）。Western blot结果显 示，与DMSO处理组相比，EX527处理组中P21（t=4.63，P=0.010；t=7.90，P=0.001）表达升高，E2F1 （t=12.10，P=0.003；t=5.96，P=0.004）、CYCLIND2（t=36.28，P<0.001；t=16.58，P<0.001）、p-RB（t=17.55， P<0.001；t=21.34，P<0.001）表达降低，p-AKT表达下调。与NC转染组相比，siSIRT1转染组中， P21（t=5.88，P=0.004；t=10.51，P<0.001）表达升高，E2F1（t=4.60，P=0.01；t=4.89，P=0.008）、 CYCLIND2（t=5.13，P=0.007；t=5.63，P=0.005）、p-RB（t=4.45，P=0.011；t=6.53，P=0.003）表达水 平降低，p-AKT（t=9.61，P<0.001；t=6.44，P=0.003）表达下调。结论：抑制SIRT1活性或表达可以明 显抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖，提示SIRT1可以作为治疗葡萄膜黑色素瘤的一个新靶标。     

microRNA-127抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的表观遗传调控研究

目的：研究microRNA-127（miR-127）在人葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达水平及其对细胞增殖的影响。方法：实验研究。通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测miR-127在葡萄膜黑色素瘤细胞M23和SP6.5与正常葡萄膜黑色素细胞UM95中的表达水平。细胞实验通过阳离子脂质体介导的方法将miR-127和阴性对照（NC）转染入M23和SP6.5中,并应用细胞增殖实验法（MTS法）和流式细胞技术分别检测细胞增殖能力和细胞周期,采用Western Blot法检测转染miR-127后细胞周期相关蛋白的表达。另外,通过RT-qPCR检测用表观药物5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-Aza-dC）和（或）曲古抑菌素A（TSA）处理后的M23和SP6.5细胞内miR-127的表达水平。MiR-127的表达量及细胞实验各参数在2组间比较采用独立样本t检验。结果：miR-127在M23和SP6.5中的表达水平低于UM95（t=72.2、591.5,P<0.001）。MTS结果显示,在M23和SP6.5细胞中,转染miR-127组相对细胞数目较NC组的100%分别减少至（62.3±4.2）%和（65.4±2.3）%,差异具有统计学意义（t=12.7、21.6,P<0.001）。流式细胞技术分析显示,转染miR-127组处于G0/G1期的M23和SP6.5细胞数量比例明显高于NC组（t=-6.7,P=0.003;t=-9.9,P<0.001）,同时处于S期的M23和SP6.5细胞数量比例明显低于NC组（t=8.6,P=0.001;t=12.7,P<0.001）。Western Blot结果表明miR-127可明显降低M23和SP6.5细胞内磷酸化Rb 蛋白的表达水平（t=22.2、15.6,P<0.001）。此外,miR-127在M23和SP6.5细胞中的表达可被5-Aza-dC和TSA诱导上调（P<0.05）。结论：miR-127通过抑制细胞周期而抑制人葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖,并可被DNA甲基化和组蛋白乙酰化表观遗传机制调控。     

视网膜色素上皮细胞 LncRNA MEG3在不同葡萄糖浓度下的表达情况及对VEGF和 TGF-β1表达的影响

目的　探讨长链非编码RNA母系表达基因3（LncRNA MEG3）在不同浓度葡萄糖下表达情况及对血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。 方法　按照不同浓度d-葡萄糖培养ARPE-19细胞,随机分为5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、30 mmol·L^-1d-葡萄糖组。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测各组ARPE-19细胞LncRNA MEG3、VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平。ARPE-19细胞转染PCDNA-MEG3及PCDNA-NC质粒,建立LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞及转染空质粒的ARPE-19细胞。以含30 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM分别培养以下各组ARPE-19细胞:LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞(O组);转染空质粒的ARPE-19细胞（NC组）;加入PBS的正常ARPE-19细胞(G组);同时以含5 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM培养正常ARPE-19细胞（C组）;以上各组细胞培养24 h后,采用RT-qPCR法及Western blot法检测各组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白的相对表达水平。 结果　与5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组和30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与G组和NC组比较,O组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白相对表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论　高糖下调ARPE-19细胞LncRNA MEG3的表达,上调VEGF和 TGF-β1的表达。LncRNA MEG3过表达降低高糖诱导的VEGF和 TGF-β1表达的升高。LncRNA MEG3可能通过抑制VEGF和 TGF-β1的表达调节糖尿病视网膜病变的发展。     

miR-135a/b靶向SIRT1调控葡萄膜黑色素瘤细胞的迁移

目的：研究microRNA-135a/b（miR-135a/b）对葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞迁移能力的调控作用及其机制。方法：实验研究。采用定量RT-PCR检测UM标本和癌旁组织中miR-135a/b的表达水平。将miRNA模拟物转染入UM细胞（M23和SP6.5）过表达miR-135a/b，转染无义序列作为对照组（NC）。利用小RNA干扰技术和慢病毒过表达载体感染技术分别下调和上调细胞中SIRT1蛋白表达水平，分别以无义小干扰RNA（siNC）和插入无义序列的慢病毒载体（Lv-NC）作为阴性对照。采用划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移能力。双萤光素酶报告实验用于鉴定miR-135a/b的靶基因。Western blot检测SIRT1蛋白的表达水平。采用独立样本t检验进行数据分析。结果：定量RT-PCR结果显示miR-135a/b在UM组织较癌旁组织的表达水平明显下调（miR-135a：t=6.38，P=0.003；miR-135b：t=23.26，P<0.001）。划痕实验和Transwell实验结果显示，与NC组相比，miR-135a/b过表达M23和SP6.5细胞迁移距离减小（miR-135a：t=36.01、8.98，均P<0.01；miR-135b：t=27.53、10.51，均P<0.01）且迁移细胞数量减少（miR-135a：t=7.04、7.02，均P<0.01；miR-135b：t=5.01、7.32，均P<0.01）。双萤光素酶实验证实，miR-135a/b能够明显抑制SIRT1野生组萤光素酶的荧光值（miR-135a：t=2.88，P=0.028；miR-135b：t=4.99，P=0.003）；Western blot结果表明，与NC组相比，过表达miR-135a/b的M23和SP6.5细胞中SIRT1的蛋白水平下调（miR-135a：t=9.93、4.13，均P<0.01；miR-135b：t=4.66、6.20，均P<0.01）。siSIRT1转染后划痕实验和Transwell实验结果显示，与siRNC组相比，M23和SP6.5细胞中下调SIRT1蛋白水平后细胞的迁移距离减小（siSIRT1-I：t=13.88、11.78，均P<0.01；siSIRT1-II：t=31.20、6.27，均P<0.01）且迁移细胞数量减少（siSIRT1-I：t=7.57、4.66，均P<0.01；siSIRT1-II：t=5.58、3.25，均P<0.05）。M23和SP6.5细胞中上调SIRT1蛋白水平同时过表达miR-135a/b，Transwell实验结果显示，细胞的迁移数量较仅过表达miR-135a/b升高（miR-135a+Lv-SIRT1：t=4.10、2.75，均P<0.05；miR-135b+Lv-SIRT1：t=2.99、2.49，均P<0.05）。结论：miR-135a/b在UM中明显下调且通过靶向结合SIRT1 mRNA 3'非翻译区抑制UM细胞的迁移，提示miR-135a/b-SIRT1信号轴在UM发展中发挥重要作用。     

DZNep靶向EZH2抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖

目的：探讨EZH2抑制剂3-deazaneplanocin A（DZNep）对人葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的影响。方法：实验研究。先采用Western blot法检测EZH2在正常葡萄膜黑色素细胞（UM95、UM96）和葡萄膜黑色素瘤细胞（M23、SP6.5）中的表达，然后在M23和SP6.5细胞的培养基中加入DZNep进行处理，作为实验组；以溶剂DMSO处理作为阴性对照组。采用MTS、平板克隆形成、EdU实验以及流式细胞 术分别检测细胞存活、克隆形成能力、细胞增殖以及细胞周期。Western blot技术检测DZNep对细胞中H3K27me3修饰水平，细胞周期相关蛋白以及ERK信号通路的影响。组间数据均采用独立样本t 检验进行比较。结果：EZH2在M23和SP6.5细胞中的表达水平与在UM95细胞中的表达相比显著升高（t=25.050，P=0.002；t=14.220，P=0.005）。MTS结果显示，DZNep显著抑制M23和SP6.5细胞的活性，呈浓度和作用时间依赖性。与阴性对照组相比，实验组中M23和SP6.5细胞的克隆形成数量 显著降低（t=3.364，P=0.015；t=6.997，P<0.001），并且反映细胞增殖的EdU标记细胞比例明显减少 （t=5.117，P=0.002；t=3.399，P=0.015）。流式细胞术检测结果显示，与阴性对照组相比，实验组中 M23和SP6.5细胞处于G1期的细胞比例均显著升高（t=6.199，P=0.003；t=3.729，P=0.020）。Western blot检测结果显示，与阴性对照组相比，实验组M23和SP6.5细胞中的EZH2（t=5.214，P=0.035； t=13.530，P=0.005）、p-Rb（t=4.551，P=0.045；t=4.655，P=0.043）、E2F1（t=8.090，P=0.015；t=9.313， P=0.011）以及p-ERK（t=4.819，P=0.040；t=8.951，P=0.012）表达均有降低，H3K27me3修饰水平显 著下降（t=5.257，P=0.034；t=5.697，P=0.030）。结论：DZNep能够抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖，具有治疗葡萄膜黑色素瘤的应用前景。     

长链非编码RNA（lncRNA）核仁小RNA宿主基因7（SNHG7）对葡萄膜黑色素瘤癌细胞增殖和侵袭力的影响

目的　探讨长链非编码RNA（lncRNA）核仁小RNA宿主基因7（SNHG7）对葡萄膜黑色素瘤癌细胞增殖和侵袭力的影响。方法　选取2011年8月至2019年8月在我院行手术治疗的葡萄膜黑色素瘤患者71例71眼作为葡萄膜黑色素瘤组,另选取因外伤摘除且葡萄膜完整、眼球正常的患者40例40眼作为正常组。两组患者性别、年龄、患眼眼别差异均无统计学意义（均为P>0.05）。采用实时荧光定量PCR检测两组患者眼球组织中SNHG7表达。取M23细胞进行培养,将对数生长期细胞分成3组,SNHG7干扰组:转染SNHG7干扰序列;阴性对照组:转染阴性对照序列;空白组:不作任何处理。采用实时荧光定量PCR检测各组细胞中SNHG7表达,CCK-8法检测转染后细胞增殖活性,Transwell法检测细胞侵袭力。结果　葡萄膜黑色素瘤组患者眼球组织中SNHG7的相对表达量为2.05±0.16,正常组患者眼球组织中SNHG7的相对表达量为1.01±0.07,两组差异有统计学意义（t=39.461,P<0.001）。葡萄膜黑色素瘤组在发生巩膜浸润和眼外生长的患者眼球组织中SNHG7相对表达量均较无巩膜浸润和无眼外生长的患者高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。转染后继续培养48 h,SNHG7干扰组细胞SNHG7相对表达量（0.27±0.09）明显低于阴性对照组（1.01±0.07）和空白组（1.03±0.09）（均为P<0.001）。与阴性对照组和空白组相比,SNHG7干扰组细胞转染后24 h、48 h、72 h和96 h时光密度均降低,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。转染后48 h,SNHG7干扰组侵袭细胞数［（89.77±9.82）个］显著低于阴性对照组［（133.14±7.54）个］和空白组［（137.09±10.05）个］（均为P<0.001）。结论　葡萄膜黑色素瘤患者眼球组织中SNHG7呈高表达,且SNHG7高表达与肿瘤组织巩膜浸润和眼外生长有关,下调SNHG7基因表达可阻碍M23细胞增殖和侵袭。     

MicroRNA-199a-3p对脉络膜黑色素瘤细胞增殖的抑制作用

目的：探讨MicroRNA-199a-3p（miR-199a-3p）对脉络膜黑色素瘤细胞OCM290增殖的影响及机制。 方法：实验研究。首先采用Real-time PCR技术检测miR-199a-3p在正常的脉络膜黑色素细胞UM96和肿瘤细胞OCM290中的表达情况;其次采用阳离子脂质体Lipofectamine介导的转染方法,将miR- 199a-3p转染入体外培养的人脉络膜黑色素瘤细胞OCM290中过表达作为实验组,将随机序列寡核苷酸链转染入OCM290细胞作为阴性对照组;然后在转染的基础上运用细胞增殖实验法（MTS法）、克隆形成实验检测细胞增殖和生长能力。流式细胞术检测细胞周期。Western blot法检测与细胞周期相关的信号蛋白如CDK2、CDK4、E2F1等的表达。组间数据比较采用独立样本t检验。结果：miR-199a-3p在UM96中高表达,而在OCM290中表达明显下调（t=13.2,P<0.001）。OCM290细胞转染 miR-199a-3p后,MTS结果显示实验组细胞数为对照组的（23.8±1.7）%,细胞增殖明显被抑制（t=78.1,P<0.001);细胞克隆数减少;细胞周期滞留在G1期（t=-8.5,P=0.001）;Western blot法检测发现miR-199a-3p能下调OCM290中CDK2、CDK4、E2F1等的表达水平（t=10.3,P=0.001;t=9.9,P=0.001; t=10.4,P<0.001）。结论：miR-199a-3p通过下调调控细胞周期进程的关键蛋白,影响细胞周期的进程,从而抑制脉络膜黑色素瘤细胞的增殖。     

骨桥蛋白在不同侵袭转移潜能葡萄膜黑色素瘤中的表达及意义

背景 骨桥蛋白(OPN)在多种转移性肿瘤组织中表达增高,但在葡萄膜黑色素瘤(UM)中的表达与临床病理特征及侵袭转移是否相关尚不清楚. 目的 研究UM组织及不同转移潜能人UM细胞系MUM-2B、C918和OCM-1A中OPN的表达情况,分析OPN的组织及细胞系表达水平与UM患者临床病理特征与转移预后之间的关系.方法 收集2004年1月至2007年12月在北京同仁医院行眼球摘除手术并已经病理证实为脉络膜黑色素瘤组织的标本共50例,应用免疫组织化学法检测石蜡标本中OPN的表达,分析其与临床资料的相关性.应用定量聚合酶链反应(Q-PCR)技术检测不同侵袭性转移潜能的人UM细胞系中OPN mRNA的表达情况.结果 50例UM组织中发生肝转移者13例,其中10例OPN表达阳性,未发生肝转移的37例中14例OPN表达阳性;上皮型与非上皮型脉络膜黑色素瘤OPN表达阳性者分别为11/15和13/35;肿瘤累及睫状体和未累及者OPN表达阳性者分别为20/30和4/20;上述指标的比较差异均有统计学意义(X2=5.888、5.510、10.470,P＜0.05).患者不同性别、年龄、眼别、肿瘤最大基底径以及是否侵犯巩膜导管间OPN表达阳性例数的比较差异均无统计学意义(P=0.536、0.256、0.802、0.848、0.555).转移潜能细胞系由高到低依次为MUM-2B、C918、OCM-1A,其OPN mRNA相对表达量分别为1.00±0.04、0.91±0.03、0.08±0.01,差异有统计学意义(F=33.135,P＜0.05),MUM-2B、C918中OPN mRNA的表达水平较OCM-1A中明显增高,差异均有统计学意义(P=0.00),而MUM-2B、C918中OPN mRNA的表达水平差异无统计学意义(P=0.804).结论 OPN与UM侵袭能力及转移潜能密切相关,发生转移的UM组织及高侵袭转移性细胞系中OPN表达水平明显升高,提示OPN可能作为预测UM侵袭能力、转移潜能以及患者预后的指标.     

Wnt3a诱导人晶状体上皮细胞细胞外基质合成和胶原凝胶收缩的机制研究

背景 晶状体上皮细胞(LECs)的细胞外基质(ECM)的产生、异常沉积和收缩是PCO发生的重要病理机制.Wnt3a蛋白参与机体组织上皮细胞ECM的产生和纤维化过程,但Wnt3a对晶状体组织中上皮间质转化(EMT)相伴行的ECM的产生和收缩的影响尚不清楚. 目的 研究Wnt3a对体外培养的人LECsECM合成的影响,并探讨其介导胶原凝胶收缩的相关分子机制. 方法 用脂质体介导转染技术将Wnt3acDNA表达载体瞬时转染人LECs系SRA01/04细胞作为Wnt3a转染组,对照组转染pcDNA3-HA表达载体.细胞转染后48 h,采用Western blot法测定各组细胞中Wnt3a、ECM主要成分Ⅰ型胶原纤维(Col-Ⅰ),Ⅳ型胶原纤维(Col-Ⅳ)和整合素β1(integrin β1)的表达;采用免疫荧光法检测α-SMA、细胞纤维状肌动蛋白(F-actin)在胞中的表达和分布.将SRA01/04细胞与Ⅰ型胶原凝胶混合,观察胶原收缩情况.结果 Wnt3a转染48 h,SRA01/04细胞内Wnt3a蛋白相对表达量(相对灰度值)明显升高,对照组细胞和Wnt3a转染组细胞中Wnt3a蛋白表达量分别为0.290±0.066和0.703±0.105,差异有统计学意义(t=5.782,P＜0.01).Western blot法检测显示,Wnt3a转染组SR A01/04细胞中的Col-Ⅰ和integrin β1蛋白的相对表达量分别为0.697±0.021和0.875±0.055,明显高于对照组的0.370±0.020和0.580±0.030,差异均有统计学意义(t=19.600、8.156,均P＜0.01),Wnt3a转染组Col-Ⅳ蛋白相对表达量为0.430±0.020,高于对照组的0.383±0.031,但差异无统计学意义(t=2.514,P＞0.05).免疫荧光检测显示,对照组细胞中F-actin和α-SMA蛋白主要表达于细胞膜,而Wnt3a转染组细胞中F-actin和α-SMA蛋白表达于细胞膜、细胞质和细胞核周围,阳性染色程度较对照组明显增强.Col-Ⅰ凝胶收缩试验结果显示,细胞与Col-Ⅰ胶原凝胶混合后24 h凝胶收缩面积比率明显低于混合后8h(64.1％±2.3％与98.9％±1.0％),Wnt3a转染组凝胶收缩面积比率明显低于对照组(64.1％±2.3％与93.9％±3.1％),差异均有统计学意义(均P＜0.01). 结论 Wnt3a过表达可诱导SRA01/04细胞ECM合成和细胞骨架重建,促进细胞收缩.     

高压力培养下角膜内皮细胞凋亡的启动机制

目的 探讨高压力培养下角膜内皮细胞凋亡的启动机制.方法 原代兔角膜内皮细胞经免疫组织化学鉴定后,在50mmHg(1 kPa =7.5 mmHg)压力条件下,培养lh、2h、24 h,另设正常压力(15 mmHg)作为正常压力组,培养24 h.第一代兔角膜内皮细胞融合达70％～80％后,细胞在加压前lh分别使用浓度均为10-6 mol·L-l抗Caspase-8和抗Caspase-9预处理,然后置于压力装置中,压力设定为50 mmHg,培养24h后检测蛋白Bcl-2和P53表达,并且以无抑制剂处理的50 mmHg压力培养的细胞为对照组.各组培养的细胞均经Western blot检测Bcl-2和P53的表达.免疫荧光染色检测兔角膜内皮细胞胞浆细胞色素C的含量.结果 50 mmHg压力组角膜内皮细胞,加压lh、2h、24 h P53的表达量分别为0.651±0.007、0.805±0.006、0.839±0.011,较正常压力组(0.033±0.004)升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.01);50 mmHg压力组随着加压时间的延长,角膜内皮细胞中P53蛋白表达量逐渐增加,各时间两两比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.01).50 mmHg压力组中加压lh、2h、24 h Bcl-2的表达量分别为0.590±0.009、0.724±0.005、0.314±0.016,较正常压力组(0.081±0.013)反应性升高,差异均有统计学意义(均为P＜0.01);50 mmHg压力组各时间两两比较差异均有统计学意义(均为P＜0.01).实验发现正常压力组培养24h后,细胞核呈蓝色,胞浆中无细胞色素C释放;50 mmHg压力组培养lh可见部分细胞胞浆呈红色,提示细胞色素C释放进入到胞浆内,随着加压时间延长荧光强度增加,加压24 h见胞浆内出现广泛红色强荧光.抗Caspase-9和抗Caspase-8预处理组的角膜内皮细胞P53表达量分别为0.535±0.007、0.703±0.010,较对照组(0.727±0.021)下调,差异均有统计学意义(均为P＜0.0I);抗Caspase-9和抗Caspase-8预处理组中Bcl-2的表达量呈抑制性下降,分别为0.312±0.003、0.442±0.011,较对照组(0.501±0.011)下降,差异均有统计学意义(均为P＜0.01).抗Caspase-9预处理组的角膜内皮细胞P53和Bcl-2表达量较抗Caspase-8预处理组下降,差异亦均有统计学意义(均为P＜0.01),表明抗Caspase-9对高压下角膜内皮细胞凋亡的抑制作用更显著.结论 Caspase-9抑制剂可有效阻断高压力对角膜内皮细胞的促凋亡作用,高压力对角膜内皮细胞的损伤主要是触发了线粒体细胞色素C的释放,激活了Caspase-9参与的内源性酶联反应性凋亡途径.     

缺氧诱导下人微血管内皮细胞的活化与腺苷水平的关系

背景 目前普遍认为视网膜局部缺氧状态是诱导视网膜新生血管形成的主要原因之一,其发病机制研究是国内外的研究热点.研究证实缺氧刺激下多种转录因子活性增加可促进微血管内皮细胞活化,导致新生血管形成,其中除血管内皮生长因子外,腺苷促血管生成作用也逐渐受到关注. 目的 研究缺氧诱导下微血管内皮细胞的活化过程与腺苷水平之间的关系,探讨腺苷微环境对血管生成的促进作用. 方法 对人微血管内皮细胞株(HMEC-1)进行体外培养,将培养的细胞分为常氧组和缺氧组,常氧组细胞置于5％CO2的细胞培养箱内培养,缺氧组细胞置于体积分数1％O2、94％N2和5％C02的细胞培养箱内培养.采用CCK8法和EDU法检测各组细胞增生的吸光度(A值)和增生比例;采用Transwell小室法检测各组迁移细胞数与侵袭细胞数;采用Western blot法检测细胞中CD39和CD73蛋白的相对表达水平,采用免疫荧光法检测细胞中CD39和CD73的表达;采用高效液相仪检测各组细胞中的腺苷浓度.结果 常氧组和缺氧组培养后12h细胞增生值(A值)分别为0.715±0.067和0.821±0.056,培养后24h A值分别为0.946±0.028和0.998±0.028,缺氧组12 h组和24 h组细胞增生值均高于常氧组,差异有统计学意义(t12h=3.805、t24h=3.222,均P＜0.01);缺氧组细胞培养后24 h细胞增生比例明显高于常氧组,差异均有统计学意义(t=-6.868,P＜0.01).常氧组和缺氧组细胞培养24 h迁移细胞数分别为185.3±10.594和300.7±22.853,侵袭细胞数分别为74.2±10.741和107.5±7.007,缺氧组迁移和侵袭细胞数均明显多于常氧组,差异均有统计学意义(t=-12.124、-6.367,均P＜0.01).缺氧组细胞培养后12 h和24 h细胞中CD39和CD73蛋白的相对表达水平明显高于常氧组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).缺氧组细胞培养后2h、6h、12 h、24 h和36 h细胞内腺苷浓度逐渐增加,培养后36 h达峰,此后开始逐渐下降.各时间点缺氧组细胞中腺苷浓度均明显高于常氧组,差异均有统计学意义(t2h=2.469,P=0.017;t6h=5.442,P＜0.001;t12h=3.841,P＜0.001;t24h=4.458,P＜0.001;t36h=2.757,P=0.008;t48h=3.319,P=0.002).结论 与常氧环境比较,缺氧条件下培养的HMEC-1增生速度更快,迁移和侵袭能力更强,同时细胞中腺苷生成关键酶CD39和CD73蛋白的表达明显上调,腺苷浓度明显升高.提示缺氧条件下腺苷明显促进HMEC的活化过程.     

基因沉默解离素-金属蛋白酶17(ADAM17)对高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞通透性、增殖、迁移以及蛋白表达的影响

目的 探讨基因沉默解离素-金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase 17,ADAM17)对高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cells,HRMECs)通透性、增殖、迁移以及蛋白表达的影响.方法 将HRMECs分为4组:正常组(5 mmol·L-1 D-葡萄糖)、高糖组(25 mmol·L-1 D-葡萄糖)、NC(siRNA阴性对照)+高糖组和si-ADAM17(ADAM17 siRNA)+高糖组.ADAM17表达采用实时定量PCR和蛋白印迹法检测;辣根过氧化酶法检测HRMECs通透性;CCK-8和BrdU检测细胞增殖;Transwell检测细胞迁移;蛋白印迹法检测p-EGFR、p-ERK和MMP9表达水平.结果 与正常组相比,高糖组ADAM17蛋白表达水平显著升高(P＜0.01),NC+高糖组与高糖组相比无明显差异(P＞0.05);与NC+高糖组比较,siADAM17+高糖组ADAM17蛋白表达水平显著下调(P＜0.05).沉默ADAM17可降低高糖环境下HRMECs的通透性.沉默ADAM17可抑制高糖介导的细胞增殖.Transwell实验结果显示,各组相对迁移的细胞数分别为高糖组(157.00±7.93)个、NC+高糖组(169.00±10.12)个、siADAM17+高糖组(121.00±9.28)个、正常组(110.00±8.25)个.沉默ADAM17可抑制高糖介导的细胞迁移.siADAM17+高糖组较NC+高糖组p-EGFR、p-ERK和MMP9蛋白表达显著减少(均为P＜0.01).结论 基因沉默ADAM17可能通过EGFR、ERK、MMP9通路降低高糖诱导的细胞通透性并抑制细胞增殖和迁移.