NADPH氧化酶在rd小鼠遗传性视网膜变性中的活化表达

背景研究表明,小胶质细胞中烟酰胺二磷酸腺苷（NADPH）氧化酶的活化在中枢神经系统神经元损伤及神经变性疾病中发挥重要作用。已有研究证实NADPH氧化酶在rd小鼠视锥细胞退行性改变中的作用,但关于其在rd小鼠视网膜变性早期视杆细胞病变过程中的作用研究较少。目的研究NADPH氧化酶在rd小鼠感光细胞凋亡过程中的活化表达,探讨其在遗传性视网膜变性中的致病作用。方法取出生后8、10、12、14、16、18d的rd小鼠各18只,过量麻醉法处死后提取视网膜总RNA和总蛋白,并制备视网膜切片,分别用实时荧光定量PCR及Western blot法测定在rd小鼠感光细胞凋亡过程中视网膜中NADPH氧化酶亚单位gp91phox mRNA及蛋白的定量表达变化;采用免疫组织化学及gp91phox和CD11b免疫荧光双染法确定gp91phox在不同鼠龄rd小鼠视网膜中的表达及定位,并与其近交系C57BL／6N小鼠进行比较。结果实时荧光定量PCR研究证实,C57BL／6N小鼠视网膜中未见gp91phox mRNA的表达,而生后8d的rd小鼠视网膜中即有少量gp91phox mRNA的表达,随着鼠龄的增加,gp91phox mRNA表达量（gp91phox mRNA／β-actin）逐渐增加,生后14d达到高峰。不同鼠龄rd小鼠视网膜中gp91phox mRNA表达量差异有统计学意义（F=17．81,P=0．00）;生后10、12、14、16、18d的Td小鼠视网膜中gp91phox mRNA表达量均明显高于出生后8d小鼠,差异均有统计学意义（均P〈0．05）,以出生后14d表达量最高,为1．136±0．370。随着小鼠鼠龄的增加,视网膜中gp91phox蛋白表达量（A值）与其基因表达变化趋势一致,不同鼠龄及C57BL／6N对照小鼠间视网膜中gp91phox蛋白表达的差异有统计学意义（F=354．00,P〈0．01）,不同鼠龄rd小鼠出生后视网膜中gp91phox蛋白表达量均明显高于C57BL／6N对照小鼠,差异均有统计学意义（均P〈0．05）。免疫组织化学法检测表明,rd小鼠出生后10d视网膜内层gp91phox阳性细胞开始增多,出生后14d达到高峰,外核层也可见到gp91phox阳性细胞。免疫荧光双染结果显示,gp91phox与小胶质细胞标志物CD11b共表达,呈现橙色荧光。结论NADPH氧化酶在rd小鼠视网膜中的表达随着鼠龄的增长而增多,其表达与小胶质细胞活化及感光细胞的凋亡相平行,提示NADPH氧化酶可能在小胶质细胞活化导致的感光细胞凋亡中发挥致病作用。     

视网膜色素变性Rd1小鼠眼球中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达

目的　探讨增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）在Rd1小鼠视网膜上的表达情况。方法　取出生后14 d、21 d、28 d的Rd1小鼠和C57BL/6J小鼠各5只,摘出眼球进行HE染色,观察视网膜形态学结构变化;免疫组织化学染色与实时荧光定量PCR检测PCNA蛋白和基因在不同鼠龄小鼠中的表达。结果　HE染色结果显示:PCNA蛋白均在两种小鼠视网膜神经节细胞中表达;C57BL/6J小鼠视网膜结构完整;与C57BL/6J小鼠相比,Rd1小鼠视网膜发育随着鼠龄的增加,发生进行性退化。免疫组织化学染色结果显示:PCNA蛋白表达仅局限于视网膜神经节细胞,免疫阳性信号出现在第14天和第21天,而在第28天未检测到。PCR 实验结果显示:与C57BL/6J小鼠相比较,鼠龄21 d时Rd1小鼠PCNA基因表达水平增高,是C57BL/6J小鼠的2.23倍;鼠龄14 d和28 d时 Rd1小鼠PCNA基因表达均低于C57BL/6J小鼠（均为P<0.05）。结论　PCNA基因参与了Rd1小鼠视网膜发育退化过程。     

糖尿病小鼠视网膜中JNK3 mRNA表达的动态变化

背景 糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病常见的眼部并发症,其发病机制与多种因素有关,c-jun N末端激酶（JNK）作为一种凋亡基因,在糖尿病的病理过程中发挥着重要作用,其研究已成为近些年的热点之一,而JNK3作为JNK的亚基因之一,在DR中的研究目前较少.目的 定量检测JNK3在糖尿病小鼠视网膜中的表达,探讨JNK3在DR中的作用.方法 选取SPF级6～8周龄C57BL/6雄性小鼠48只,适应性喂养1周后按照随机数字表法分为糖尿病组和正常对照组.30只糖尿病组小鼠用一次性腹腔内注射柠檬酸钠缓冲液溶解的质量分数1％链脲佐菌素（STZ）的方法诱导糖尿病模型,18只对照组小鼠腹腔内注射等容量柠檬酸钠缓冲液.分别于造模后2、4、8周摘除小鼠左眼眼球,提取视网膜组织,采用实时定量PCR法检测JNK3 mRNA在小鼠视网膜中表达的动态变化.结果 造模后2、4、8周,糖尿病组小鼠血糖水平明显高于正常对照组,差异均有统计学意义（t=-5.675、-5.498、-5.347,P＜0.01）.糖尿病组和正常对照组在造模后不同时间点小鼠视网膜中JNK3 mRNA相对表达量（A值）的差异均有统计学意义（F分组=102.345,P＜0.05;F时间 =131.679,P＜0.05）;其中造模后4周和8周糖尿病组小鼠视网膜中JNK3 mRNA相对表达量分别为3.21±0.14和5.43±0.37,均明显高于正常对照组的2.54 ±0.42和2.26±0.67,差异均有统计学意义（t=4.073、23.399,P＜0.05）;糖尿病组内比较可见,造模后8周小鼠视网膜中JNK3 mRNA相对表达量明显高于2周和4周值,差异均有统计学意义（t=10.756、16.857,P＜0.05）.结论 JNK3在糖尿病小鼠视网膜中表达量上调,其早期表达量随时间延长而增加.JNK3可能参与早期DR的发生和发展.     

阿魏酸对视网膜色素变性小鼠血浆内皮素-1表达的影响

目的　研究不同浓度阿魏酸作用下,出生后不同时期的视网膜色素变性（ｒｅｔｉｎｉｔｉｓｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ,ＲＰ）动物模型（ｒｄ小鼠）血浆中内皮素－１（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ－１,ＥＴ－１）动态表达特征,探讨阿魏酸对ｒｄ小鼠表达ＥＴ－１的作用特点。方法　取新出生的ｒｄ小鼠９０只及Ｃ５７／ＢＬ６小鼠１８只,按照阿魏酸灌胃浓度的不同分成４组,０．２５ｇ? Ｌ－１组、０．５０ｇ? Ｌ－１组、０．７５ｇ?Ｌ－１组、１．００ｇ?Ｌ－１组,每组再按照给药时间分为２周组、３周组、４周组,以上１２组为药物处理组,每组各６只。相同周龄的ｒｄ小鼠各６只不作处理作为病变对照组,相同周龄的Ｃ５７／ＢＬ６小鼠各６只作为正常对照组。ＥＬＩＳＡ法检测血浆ＥＴ－１浓度。结果　２周组、３周组、４周组病变对照组小鼠ＥＴ－１浓度均高于正常对照组,尤其３周组、４周组与正常对照组相比差异有统计学意义（Ｐ＝０．０２４、０．０１０）。经阿魏酸治疗后２周时,０．５０ｇ?Ｌ－１组、０．７５ｇ?Ｌ－１组ＥＴ－１水平低于病变对照组,但差异无统计学意义;３周时,０．２５ｇ?Ｌ－１组、０．５０ｇ?Ｌ－１组、０．７５ｇ?Ｌ－１组ＥＴ－１水平低于病变对照组,其中０．５０ｇ?Ｌ－１组差异有统计学意义（Ｐ＝０．０３４）;４周时,０．２５ｇ?Ｌ－１组、０．５０ｇ?Ｌ－１组、０．７５ｇ?Ｌ－１组ＥＴ－１水平低于病变对照组,差异均有统计学意义（Ｐ＝０．０１１、０．０２７、０．０２１）。各浓度治疗组中,仅１．００ｇ?Ｌ－１组治疗３周和４周时与正常对照组相比差异有统计学意义（Ｐ＝０．０１３、０．００９）。结论　ｒｄ小鼠在病变过程中,血浆ＥＴ－１水平明显升高,可能与ＲＰ的发生发展有关。在不同浓度阿魏酸治疗下,ｒｄ小鼠ＥＴ－１水平不同程度下降,其中０．５０ｇ?Ｌ－１、０．７５ｇ?Ｌ－１治疗效果最明显。     

rd小鼠遗传性视网膜变性中内质网应激蛋白的激活

目的 探讨rd小鼠遗传性视网膜变性光感受器细胞变性凋亡中内质网应激反应蛋白的表达变化.方法 实验研究.取出生后8、10、12、14、24 d的rd小鼠和同年龄段的正常对照C3B小鼠.免疫印迹法检验视网膜中GRP78/BiP、半胱天冬酶-12酶原(procaspase-12)和活性caspase-12、p-PERK、p-eIF2a蛋白表达变化.免疫荧光染色共聚焦显微镜观测GRP78/BiP、caspase-12、p-PERK和p-eIF2a的表达部位及表达量的变化.用SPSS单因素方差分析对数据进行统计学分析,以P＜0.01为差异有统计学意义.结果 伴随rd小鼠遗传性视网膜变性过程免疫印迹结果显示GRP78/Bip、半胱天冬酶-12酶原和活性caspase-12、p-PERK、p-eIF2a蛋白的表达上调,与正常对照组之间的差异具有统计学意义(F=65.82,55.76,152.29,50.54,20.91;P＜0.05);免疫荧光染色结果显示GRP78/Bip、easpase-12、p-PERK和p-eIF2a主要表达于视网膜光感受器细胞的内节和光感受器细胞核中.结论 在rd小鼠遗传性视网膜变性光感受器细胞变性凋亡中,内质网应激反应蛋白的激活对于光感受器细胞的凋亡具有重要作用.应用内质网应激反应调节剂可能对此类疾病起到有效治疗作甩.     

蓝光照射对小鼠视网膜形态和功能的损伤作用

目的通过观察蓝光照射对C57BL/6J小鼠视网膜形态和功能的影响,探讨非渗出性年龄相关性黄斑变性(AMD)的模型。方法采用投币法将20只8周龄清洁级C57BL/6J雄性小鼠随机分为正常对照组和蓝光照射组。蓝光照射组小鼠暗适应24 h后暴露于10000 lx蓝光下5 d,正常对照组小鼠按12 h/12 h正常光照/黑暗的周期饲养于正常光照环境5 d。采用光相干断层扫描成像(OCT)活体检查各组小鼠视网膜厚度变化,采用视网膜电图(ERG)检查各组小鼠视网膜功能变化。于光照结束后24 h采用颈椎脱臼法处死小鼠并制备眼球壁标本,采用免疫荧光染色法测定小鼠视网膜中视紫红质(Rho)、紧密连接蛋白(ZO-1)和β-catenin蛋白表达。结果蓝光照射组小鼠视网膜上部和下部距视盘200、400、600、800和1000μm处视网膜外核层厚度均较正常对照组变薄,差异均有统计学意义(均P<0.05)。蓝光照射组小鼠暗适应和明适应b波振幅分别为(305.50±41.52)μV和(119.50±6.67)μV,分别低于正常对照组的(415.50±28.77)μV和(139.75±8.26)μV,差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常对照组小鼠RPE细胞呈正六边形,视网膜各层形态规则,Rho、ZO-1和β-catenin荧光较强;蓝光照射组小鼠RPE细胞形态不规则,ZO-1染色减弱或消失,β-catenin染色和Rho蛋白荧光强度减弱。结论蓝光照射小鼠视网膜变薄,视网膜功能减弱。     

VEGFR-1和VEGFR-2在氧诱导视网膜病变小鼠视网膜中表达的变化

背景 早产儿视网膜病变(ROP)是氧动力学异常导致严重视网膜血管病变的致盲眼病.血管内皮生长因子(VEGF)在ROP发病机制中发挥重要作用,但VEGF受体(VEGFR)在ROP发病中的作用研究较少. 目的 研究不同鼠龄氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜中VEGFR-1和VEGFR-2的表达变化.方法 将60只SPF级出生后7 d(P7)的C57BL/6J小鼠与哺乳母鼠一起在体积分数(75±2)％O2条件下饲养5d,建立OIR小鼠模型(OIR组),以60只正常环境饲养的同品系同龄小鼠作为正常对照组.分别于P8、P11、P12、P13、P14、P18鼠龄时摘取2个组小鼠双侧眼球,制备视网膜切片,采用苏木精-伊红染色法检测小鼠视网膜血管的发育情况;采用实时荧光定量PCR法检测不同鼠龄小鼠视网膜中VEGFR-1和VEGFR-2 mRNA的相对表达水平;采用免疫组织化学法观察小鼠视网膜中VEGFR-1和VEGFR-2蛋白的表达.结果 组织病理学结果显示,OIR组P13、P14、P18小鼠有较多的血管内皮细胞核突破内界膜,光学显微镜下内界膜下的细胞增生,排列紊乱,视网膜表面或视网膜前有新生血管芽,但正常对照组各鼠龄小鼠视网膜结构正常.OIR组P12、P13、P14和P18小鼠视网膜中VEGFR-1 mRNA的平均相对表达水明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(P=0.046、0.000、0.000、0.042);OIR组P8、P11、P12、P13、P14和P18小鼠视网膜中VEGFR-2mRNA的平均相对表达水平明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P＜O.01).两个组间P8、P11、P12、P13、P14、P18小鼠视网膜中VEGFR-1蛋白阳性表达强度的差异均无统计学意义(M=50.00、36.00、41.00、31.00、28.00、36.00,均P＞0.05);正常对照组与OIR组间P8和P11小鼠视网膜中VEGFR-2蛋白阳性反应强度的差异无统计学意义(均P＞0.05),正常对照组P12、P13小鼠视网膜中VEGFR-2蛋白的表达减弱,但OIR组同鼠龄小鼠视网膜中VEGFR-2蛋白的表达增强,2组间差异均有统计学意义(均P＜0.01);2个组P14小鼠视网膜中VEGFR-2蛋白表达均明显增强,但OIR组的表达强度仍显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).正常对照组P18小鼠视网膜中VEGFR-2蛋白表达减弱,OIR组VEGFR-2表达强度达峰(M=20.11,P＜0.01). 结论 VEGFR参与OIR小鼠视网膜新生血管的形成,VEGFR-2的促新生血管新生作用强于VEGFR-1.     

结晶样视网膜色素变性患者血脂浓度的变化

背景 结晶样视网膜色素变性(BCD)为一种先天性遗传性眼病,已有研究认为其与血清中脂肪酸代谢异常有关,但目前鲜见关于BCD与血清中脂质水平变化关系的报道. 目的 分析BCD患者血清脂质浓度的变化情况.方法 采用前瞻性研究设计,本研究经过北京同仁医院伦理委员会批准,受检者受检前均签署知情同意书.纳入2011年11月至2013年3月于北京同仁医院眼科就诊的双眼BCD患者50例及同期进行健康体检、年龄和性别匹配的健康体检者50人,采集受检者外周静脉血3 ml,由检验科专业人员检测受检者血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度,结果的判定参照《中国成人血脂异常防治指南》(2007版)中成年人的正常值标准,并将BCD患者组检测结果与正常对照组进行比较.结果 50例BCD患者中血脂水平异常者占58.00％(29/50),其中高TG血症者占34.48％ (10/29);高TC血症者占34.48％ (10/29);混合型高脂血症者占27.59％(8/29).BCD患者血清TG、TC、LDL-C浓度分别为(1.63±1.19)、(5.10±1.05)、(3.27±0.97) mmol/L,明显高于正常对照组的(0.93±0.33)、(4.33±0.56)、(2.63±0.51) mmol/L,差异均有统计学意义(t=4.036、4.496、4.095,均P=0.000). 结论 血脂异常可能与BCD发病有关.     

Tenomodulin抑制氧诱导视网膜病变小鼠模型新生血管形成的研究

目的探讨Tenoinodulin（TeM）蛋白对C57BL／6J小鼠早产儿视网膜病变模型（ROP）视网膜新生血管形成的抑制作用。方法将60只7d龄C57BL／6J幼鼠随机分为高氧组（ROP组）、正常对照组各15只和TeM组30只。将ROP组小鼠置于体积分数（75％±2％）的高氧环境中5d,随后回到正常氧环境中饲养5d;对照组小鼠饲养在正常氧环境中;TeM组是将鼠1只眼玻璃体腔内注射1μg TeM,对侧眼注射PBS作为对照,然后置于体积分数（75％±2％）的高氧环境中饲养5d,之后返回正常氧环境中。17d时处死全部小鼠,收集各组眼球。视网膜荧光素灌注铺片观察视网膜血管的改变、计算视网膜无灌注区的面积;计数突破内界膜的内皮细胞数反映视网膜血管增生情况,观察TeM蛋白对视网膜新生血管形成的抑制作用及对视网膜可能的毒性反应;Western blot检测TeM蛋白在视网膜内的表达。结果与高氧组（2．94±0．55）mm^2。及TeM组中对侧眼注射PBS（2．83±0．46）mm^2的视网膜铺片中央非灌注区面积（mm^2）相比,注射TeM的视网膜铺片（0．44±0．26）mm^2,其中央非灌注区面积差异有统计学意义（P〈0．01）;每个视网膜切面突破内界膜的内皮细胞核数（10．57±2．95）与前二者（44．93±6．78、41．07±7．31）比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。注射TeM的视网膜冰冻切片未见炎症反应和细胞毒性破坏。Western blot检测结果显示注射TeM的视网膜呈阳性表达,注射PBS的视网膜未出现条带反应,TeM的相对分子质量约为16000。结论TeM可有效抑制视网膜新生血管的形成,预示着TeM在预防和治疗眼部新生血管方面具有潜在的作用。     

MCP-1在rd小鼠视网膜变性过程中的表达

目的 探讨单核细胞趋化因子(MCP-1)在rd小鼠视网膜变性过程中的表达.方法 RT-PCR反应测定rd小鼠出生后8、10、12、14、16、18 d视网膜MCP-1 mRNA的表达.原位杂交及免疫组织化学检测高峰期MCP-1 mRNA及蛋白在视网膜的定位表达.结果 与正常对照鼠相比,MCP-1 mRNA在rd小鼠视网膜的表达水平于出生后第8 d开始升高,12 d达高峰.MCP-1 mRNA及蛋白的表达出现于视网膜内层,尤其在内核层细胞及节细胞核周围.结论 趋化因子MCP-1在rd小鼠视网膜变性过程中表达升高,提示MCP-1可能在rd小鼠感光细胞凋亡中发挥作用.     

米诺环素对视网膜色素变性小鼠光感受器细胞的保护作用

目的 观察米诺环素对视网膜色素变性（RP）的rd小鼠［C3H/HeN (Pde6brd-/rd-)］RP过程的影响。方法 40只新生rd小鼠随机分为10组，5组为实验组，5组为对照组，每组4只小鼠。实验组，出生后每日腹腔注射米诺环素22.5 mg/kg；对照组，出生后每日腹腔注射生理盐水10 ml/kg。在出生后1、7、14、21、28 d各处死一组实验组和对照组小鼠，取眼球做组织学观察并行凋亡细胞检测，并对两组视网膜光感受器细胞数、外核层厚度以及凋亡细胞数目进行统计分析。结果 （1）rd小鼠出生后7 d光感受器细胞开始凋亡，14 d达高峰，28 d光感受器细胞完全消失；（2）出生后7 d实验组光感受器细胞数目和外核层厚度与对照组比较差异无统计学意义；（3）出生后14、21 d实验组光感受器细胞数目和外核层厚度多于对照组相应时间点，差异有统计学意义（14 d：t=-3.03、P=0.016，t=-4.469，P=0.004；21d: t=-8.782、P＜0.001，t=-3.497、P=0.004）；（4）出生后7、14 d实验组外核层凋亡细胞数目少于对照组相应时间点，差异有统计学意义（t=-3.497、P=0.004，t=-8.782、P＜0.0001）。结论 米诺环素在rd小鼠RP早期可以延缓光感受器细胞丢失，但不能完全阻止RP的发生。     

应用转基因技术体外培养表达内皮抑素的Brown Norway大鼠视网膜色素上皮细胞

目的应用转基因技术体外培养稳定表达人内皮抑素的视网膜色素上皮(RPE)细胞,为脉络膜新生血管(CNV)基因治疗奠定基础。方法采用人内皮抑素真核表达载体pSecT agA-h内皮抑素,应用电转移法及脂质体介导法转染B row n N orw ay(BN)大鼠RPE细胞,以平阳霉素筛选出表达内皮抑素的RPE细胞,传代培养3周。转染后提取RPE细胞总DNA,聚合酶链反应(PCR)产物琼脂糖凝胶电泳,原位杂交,蛋白印记和免疫组织化学观察内皮抑素在转染RPE细胞中的表达情况;酶联免疫吸附试验(EL ISA)检测转染RPE细胞培养上清液中内皮抑素的表达水平;四甲基偶氮唑蓝比色法(M TT)测定所表达内皮抑素蛋白活性。结果PCR检测结果表明转染后的RPE细胞总DNA中存在长度为550碱基对左右的特异性条带;原位杂交,免疫组织化学观察到大量RPE细胞表达内皮抑素mRNA及内皮抑素蛋白;蛋白印记显示,RPE细胞裂解产物中有内皮抑素阳性条带;EL ISA法检测到转染后3、5、7、10、14、20 d 6个时间点培养上清液内皮抑素蛋白表达量分别为(321.5±41.0)、(162.5±23.45)、(78±11.22)、(78±9.87)、(78±10.06)、(78±12.67)ng/m l;M TT显示,培养上清液中内皮抑素能够抑制脐静脉内皮细胞304的增生,IC 50为45.68μg/m l,对RPE细胞、K 562的生长无影响。结论经电转移法及脂质体介导转染法获得体外培养稳定表达内皮抑素的RPE细胞是可行的,转染成功的RPE细胞能够稳定表达内皮抑素蛋白,所表达的内皮抑素蛋白具有生物活性。     

老龄多巴色素异构酶敲除小鼠视网膜色素上皮细胞中黑色素在视网膜光损伤过程中的作用

目的 观察视网膜色素上皮(RPE)细胞中黑色素含量与光感受器细胞功能之间的关系,探讨黑色素对视网膜光损伤的作用.方法 老龄多巴色素异构酶敲除小鼠(Dct-/-小鼠)和C57BL/6小鼠(野生型小鼠)各20只,分别为Det-/-/小鼠组和野生型小鼠组.采用临床电生理国际标准分别对各型鼠进行视网膜电图(ERG)检查,记录其最大混合反应后各组随机处死2只小鼠,摘除眼球作为阴性对照.余下每组各18只小鼠,将6只小鼠用20 W冷荧光灯行12 h明、12 h暗、12 h明的间断光照36 h,连续3个循环.光照强度为(5000±356)lx.光照结束后第6天再次进行ERG检查,记录ERG结果.随机颈椎脱臼法处死每组各2只小鼠,摘除眼球.所有摘除眼球常规组织切片,光学显微镜、电子显微镜观察.结果 ERG检查结果显示,光损伤前后Dct-/-小鼠a、b波振幅明显低于野生型小鼠(t_(a波光照前)=-7.13,P＜0.01;t_(b波光照前)=-4.414,P＜0.01;t_(a波光照后)=-10.162,P＜0.01;t_(b波光照后)=-6.772,P＜0.01);光损伤后Dct-/-小鼠ERGa、b波的振幅下降幅度明显高于野生型小鼠(t_(a波)=4.975,P＜0.01;t_(b波)=2.908,P＜0.01).光损伤后,光学显微镜检查可见Dct-/-小鼠视网膜水肿、变薄,较野生型明显;电子显微镜检查可见RPE细胞中黑色素颗粒融解、断裂或丢失,光感受器细胞外节盘膜肿胀、碎裂及空泡变,Dct-/-小鼠损伤较野生型小鼠严重.结论 光损伤后RPE细胞黑色素含量减少,光感受器细胞功能下降,提示黑色素对光损伤可能有保护作用.     

银杏叶提取物对光损伤后视网膜色素上皮细胞蛋白质表达的影响

目的 观察中药银杏叶提取物对光损伤后视网膜色素上皮(RPE)细胞蛋白质表达的影响,探讨银杏叶提取物保护RPE光损伤的分子机制.方法 生长良好的人RPE细胞(ARPE-19)融合生长到80%时,随机分为正常对照组、光损伤组和银杏叶提取物处理组.运用冷白光以(2200±300)1x光照ARPE-19,建立光损伤模型;以100 μg/ml的银杏叶提取物(EGb761)处理光损伤的RPE细胞.提取细胞可溶性蛋白,进行蛋白质双向电泳,ImageMaster凝胶软件分析差异蛋白质点,并选取表达差异蛋白进行质谱鉴定和生物信息学分析.结果 蛋白图谱差异分析显示,光损伤组与正常对照组比较,差异蛋白质有33个,其中蛋白质表达下调10个,蛋白质表达上调23个;银杏叶提取物处理组与光损伤组差异蛋白质有25个,其中,蛋白质表达上调3个,蛋白质表达下调22个.银杏叶提取物处理组与正常对照组比较,差异蛋白质有11个,其中,蛋白质表达上调4个,蛋白质表达下调7个.差异蛋白质的质谱鉴定和生物信息分析,成功鉴定出16个蛋白,包括组织蛋白酶B、热休克蛋白、细胞色素C还原酶等.结论 光损伤RPE细胞与银杏叶提取物处理后的光损伤RPE细胞及正常RPE细胞间的蛋白质表达有差异;银杏叶提取物光损伤保护作用涉及组织蛋白酶B、热休克蛋白、细胞色素C还原酶等多种蛋白.     

人视网膜色素上皮细胞吞噬过程中MERTK基因mRNA表达水平与蛋白激酶C关系的研究

目的 探讨人视网膜色素上皮(hRPE)细胞吞噬过程中MERTK基因mRNA表达水平与蛋白激酶C(PKC)的相互作用.方法 对照实验研究.采用1×1010个/L视细胞外节膜盘(ROS),于37℃下孵育体外培养的正常hRPE细胞,在孵育的不同时间终止吞噬反应.用双重荧光标记法,检测hRPE细胞的吞噬能力.用液闪记数γ-32P放射活性法,检测不同吞噬时间点的PKC活性.以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法,检测MERTK基因的mRNA水平变化情况.以PKC激活剂和拮抗剂处理hRPE细胞后,再行MERTK基因mRNA表达水平检测.采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析,实验组与对照组hRPE细胞吞噬ROS能力、PKC活性比较采用Student't检验,MERTK基因mRNA表达水平比较采用单因素方差分析.结果 ROS孵育后的hRPE细胞结合及吞入ROS的数量逐渐增多,至24 h时,hRPE细胞吞噬ROS的数量达到高峰,为(2.85±0.11)×106个,与对照组(0.00±0.00)×106个比较,差异有统计学意义(t=47.64,P＜0.05).ROS孵育后的hRPE细胞胞质PKC活性降低,至24 h时,PKC活性降至最低,细胞质的PKC活性为(151.13±17.67)nmol·g-1·min-1,细胞膜的PKC活性为(152.45±64.83)nmol·g-1·min-1;对照组细胞质的PKC活性为(329.63±14.26)nmol·g-1·min-1,细胞膜的PKC活性为(467.67±68.87)nmol·g-1·min-1;两组间PKC活性比较,差异有统计学意义(细胞质:t=89.66,P＜0.05;细胞膜t=10.31,P＜0.05).在hRPE细胞与ROS不同时段的孵育过程中,MERTK基因mRNA均呈现出高表达状态,孵育至90 min时,MERTK基因mRNA表达灰度值为1.8853±0.0077,与对照组灰度值0.7246±0.0062相比,差异有统计学意义(F=16 060.2167,P＜0.05);孵育至24 h时,MERTK基因mRNA表达灰度值为0.5946±0.0082,与对照组灰度值0.3343±0.0064比较,差异有统计学意义(F=919.8421,P＜0.05).上调hRPE细胞的PKC活性后,再行不同时段的ROS孵育,短时与长时孵育的MERTK基因mRNA表达灰度值均低于对照组(短时孵育:F=17 142.2331,长时孵育:F=1886.4614;P＜0.05).拮抗hRPE细胞的PKC活性后,再行不同时段的ROS孵育,30 min内MERTK基因mRNA表达灰度值为4.4670±0.0092至5.7034±0.0095范围,均高于对照组灰度值0. 9117±0.0021(F=199 012.9138,P＜0.05).结论 PKC的低活性和MERTK基因mRNA的高表达可促进hRPE细胞吞噬ROS的过程.PKC活性和MERTK基因mRNA表达水平作为上游调控信号,通过两条不同的信号通路,以负相关的方式调节hRPE细胞吞噬ROS的功能.     

ResolvinE1对高危角膜移植免疫排斥反应的抑制作用

背景 以往防治角膜移植术后排斥反应的药物存在诱发局部或全身不良反应的风险,研究表明resolvinE1(RyE1)能够调节辅助性T细胞1(Th1)型免疫反应,但其对高危角膜移植术后的植片排斥反应有无抑制作用尚不清楚. 目的 观察高危角膜移植动物模型局部应用RvE1对植片免疫排斥反应的抑制作用.方法 以BALB/c小鼠为受体、C57BL/6小鼠为供体行角膜移植术.采用随机数字表法将90只BALB/c小鼠随机分成异体角膜移植组、异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组,每组各30只.BALB/c小鼠右眼先用缝线法刺激2周以建立高危角膜移植眼模型,然后行穿透角膜移植术.异体角膜移植组和异体角膜移植+RvE1组小鼠右眼行异体角膜移植,自体角膜移植组小鼠将右眼角膜植片旋转180°后缝合于植床上.异体角膜移植组及自体角膜移植组小鼠术后每日用生理盐水10μl结膜下注射1次,异体角膜移植+RvE1组小鼠术后同法注射终质量浓度为0.1 μg/μl的RvE1 10μl,连续7d.术后裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜植片反应并对其排斥反应进行评分.术后21 d处死各组小鼠各20只,收集小鼠术眼角膜、眼球和术眼侧颈部淋巴结,采用苏木精-伊红染色法观察各组小鼠角膜植片的组织病理学变化;采用免疫组织化学法检测术眼角膜中CD4及γ干扰素(IFN-γ)的表达;采用流式细胞术检测术眼侧颈部淋巴结淋巴细胞中Th1细胞(CD3+ CD8a-IFN-γ+)比例;采用荧光定量PCR法检测Th1细胞相关因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-c)、IFN-γ及T-bet mRNA的相对表达水平.结果 异体角膜移植+RvE1组小鼠角膜植片存活时间为(28.5±1.7)d,明显长于异体角膜移植组的(14.0±1.6)d,差异有统计学意义(t=4.14,P＜0.001),自体角膜移植组小鼠植片在术后50 d存活率为100％.苏木精-伊红染色显示,异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组小鼠角膜植片水肿及炎性细胞浸润程度均轻于异体角膜移植组.免疫组织化学法检测显示,各组角膜全层均有CD4表达,而IFN-γ主要表达于角膜上皮层,异体角膜移植组小鼠角膜组织中CD4和IFN-γ阳性细胞数均明显多于异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组.流式细胞术检测显示,异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组小鼠淋巴细胞中Th1细胞比例分别为(1.07±0.25)％和(0.85±0.12)％,明显低于异体角膜移植组的(1.56±0.20)％,差异均有统计学意义(均P＜0.05).荧光定量PCR检测显示,异体角膜移植组小鼠角膜中IL-2、TNF-α、IFN-γ及T-bet mRNA的相对表达量明显高于异体角膜移植+RvE1组和自体角膜移植组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 RvE1可抑制小鼠高危角膜移植排斥反应,作用机制可能与其下调角膜植片和淋巴细胞中Th1细胞及相关细胞因子的表达有关.     

实验性自身免疫性葡萄膜炎炎性因子表达的动态观察

背景 C57BL/6 (B6)小鼠是实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)动物模型常用的小鼠种系,以往研究证明葡萄膜炎的发病机制与辅助性T(Th)细胞分泌的炎性细胞因子相关,但各种Th细胞在EAU发病中的相互作用并不十分清楚. 目的 研究光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)诱导不同天数后EAU小鼠脾脏和血清中炎性因子的动态变化,探讨各种炎性因子在EAU病理过程中的作用. 方法 用IRBP及完全弗氏佐剂(CFA)的乳化液在小鼠的尾根部及躯干部均匀注射5个点以免疫B6小鼠44只,免疫后每周3次用间接检眼镜观察小鼠的EAU发病情况,并参照Thurau的评分标准进行炎症评分.于注射后第30天摘取20只模型小鼠眼球,于瞳孔视神经平面制备切片行组织病理学检测.分别于注射前,注射后第2、5、10、15、20、25、30天取模型小鼠脾脏,提取RNA,逆转录扩增并行凝胶电泳,检测白细胞介素-17(IL-17)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TN F-α)和IL-10等因子的mRNA含量,同时收集相同时间点小鼠的血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中上述因子的质量浓度. 结果 IRBP及CFA乳化液免疫B6小鼠后第12天可见轻度葡萄膜炎症,炎症评分为0.5分,炎症反应在免疫后第13～ 15天最重,评分为1.0分,至第30天炎症明显减轻,评分为0.5.组织病理学检查显示,注射后第30天模型鼠眼部反应与间接检眼镜检查结果吻合,病理评分为0.5.模型鼠血清炎性因子检测结果显示,注射后第5天,小鼠血清中IL-17的质量浓度达到峰值,为(51.85±2.42) ng/L,随着时间的延长开始降低.到第15天时降到最低,为(4.01 ±0.06)ng/L,但在第25天时再次升高至(25.00±0.94) ng/L,之后逐渐下降,第30天时,血清中IL-17的质量浓度为(6.01±0.21)ng/L,与免疫前的(0.98±0.05) ng/L相比差异有统计学意义(P=0.000).小鼠免疫前血清中IFN-γ的质量浓度为(1.02±0.09) ng/L,在注射后第5天达到(50.54±0.48)ng/L,于注射后第10天达到峰值,为(73.21±0.12) ng/L,然后逐渐降低.到第30天时,血清中IFN-γ的质量浓度为(5.15±0.18) ng/L,与免疫前相比差异仍有统计学意义(P=0.000).注射后模型鼠血清中TNF-α质量浓度升高迅速,免疫后第2天质量浓度较免疫前明显升高,第5天达到峰值,质量浓度为(134.25±0.59) ng/L,但至第15天降到最低.注射后第20天再次升高,达到(60.54±0.62)ng/L,之后又逐渐下降,第30天时和免疫前相比差异无统计学意义(P=0.660).IL-10在免疫后第5天可以被检测到,并且随着注射后时间的延长逐渐升高.到第15天时达到高峰,随后开始降低,第30天与免疫前相比差异有统计学意义(P=0.000).脾脏中IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ 4种炎性因子mRNA表达变化趋势和血清中的变化一致. 结论 在B6小鼠的EAU中,Th1、Th2、Th17相关炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-10及IL-17具有特征性变化规律,IFN-γ可能与EAU的急性期病理过程相关;IL-17、TNF-α可能与葡萄膜炎的慢性化、复发性有关;IL-10可缓解EAU的病理过程.