8型重组腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因在角膜基质细胞中的表达及影响

目的:评价8型重组腺相关病毒(rAAV8)介导增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)转染角膜基质细胞后的表达及对细胞增殖的影响。方法:以不同MOI的rAAV8-EGFP转染大鼠角膜基质细胞,转染后以倒置荧光显微镜观察角膜基质细胞中GFP的表达,流式细胞仪分析角膜基质细胞中rAAV8-EGFP表达的阳性率。MTT法分别检测rAAV8和rAAV8-EGFP转染对角膜基质细胞增殖的影响。结果:倒置荧光显微镜观察rAAV8-EGFP转染角膜基质细胞后GFP的阳性表达7d达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV8-EGFP对角膜基质细胞的转染效率分别为31.5%(MOI=5×103),42.5%(MOI=5×104),54.8%(MOI=5×105);MTT检测结果显示rAAV8及rAAV8-EGFP转染对角膜基质细胞增殖均无明显影响。结论:rAAV8-EGFP能有效地转染角膜基质细胞,并且对细胞增殖无明显影响。     

绿色荧光蛋白标记的恶性组织细胞增生症瘤细胞眼前房移植模型

目的建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的恶性组织细胞增生症瘤细胞cy15在眼前房生长及浸润的模型,探讨cy15细胞在前房生长的规律及GFP标记活细胞的优势。方法将带有GFP的逆转录病毒MP71-GFP-PRE转入cy15瘤细胞,获得稳定表达GFP的cy15GFP细胞系。20只BALB/C小鼠(20只眼)每只眼前房注入2μl细胞密度为2×106个/ml的cy15GFP瘤细胞悬液,术后分别在裂隙灯和荧光显微镜下观察瘤细胞在前房的生长情况,连续观察30d,分别在瘤细胞植入前房后第15d、20d、30d时处死小鼠做眼球HE病理切片。结果成功地建立了稳定表达GFP的cy15GFP细胞系。接种的20只BALB/c鼠眼前房均可见肿瘤细胞生长,借助于荧光显微镜能动态地观察到肿瘤细胞在活体小鼠眼前房的生长浸润过程。结论建立的GFP标记的肿瘤细胞眼前房接种模型为研究眼内肿瘤细胞生长与浸润的规律以及抗肿瘤药物的筛选提供了一种新的手段。     

姜黄素对人晶状体上皮细胞增生的抑制作用

目的探讨姜黄素(curcumin,CUR)对人晶状体上皮细胞株SRA01/04(human lens epithelial cell line SRA01/04,HLECSRA01/04)增生的抑制作用及其剂量-效应与时间-效应的关系。方法MTT比色法分别测定不同浓度的CUR作用于HLEC不同时间后的细胞生长抑制率;不同浓度的CUR作用于HLEC24h后,流式细胞术检测HLEC的细胞凋亡率;DAPI免疫荧光染色观察HLEC的形态学改变;免疫组织化学检测HLEC的caspase-3蛋白表达情况。结果MTT比色法实验结果显示,随药物浓度增加和作用时间延长,HLEC生长抑制率增加(P<0.05)。CUR作用于HLEC24h后,流式细胞术检测表明,细胞凋亡率随药物浓度增加而明显增加(P<0.05);DAPI免疫荧光染色可见细胞核固缩、溶解碎裂、产生凋亡小体,而对照组细胞形态规则,细胞核呈现均匀的荧光染色;免疫组织化学可见,用药组caspase-3蛋白的表达随CUR浓度增加而增强(P<0.05)。结论CUR对HLEC有抑制增生和诱导凋亡作用,且呈明显的剂量-效应与时间-效应关系,可望成为后发性白内障的防治药物。     

白藜芦醇对过氧化氢诱导人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的 探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对过氧化氢(H2O2)诱导人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)氧化损伤的保护作用.方法 HLEC传代培养24h后,分别加入不同浓度(5μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1) RES预处理12 h后,加入100 μmol·L-1 H2O2继续孵育24 h,倒置相差显微镜观察细胞形态改变,MTT比色法检测RES对H2O2诱导的HLEC活力的影响,流式细胞仪检测HLEC细胞凋亡率,比色法检测凋亡相关因子caspses-3及caspase-9的表达.结果 氧化损伤可以诱导HLEC形态改变,RES处理后,细胞形态逐渐得到改善.MTT结果显示RES对HLEC活性无抑制作用,RES(5μmol·L-1、10 μmol· L-1、20 μmol· L-1、40 μmol·L-1)孵育24 h后细胞存活率分别为(101.30±4.49)％、(100.31±3.53)％、(101.71±3.33)％、(99.30±3.00)％,与对照组(99.67±2.67)％比较,差异均无统计学意义(均为P＞0.05);模型组HLEC经氧化损伤处理后,细胞存活率(34.33±3.71)％明显下降,用20 μmol·L-1及40 μmol·L-1 RES处理后,HLEC存活率分别提高到(57.33±5.61)％和(72.67±6.98)％,与模型组比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05).流式细胞计数结果显示:对照组HLEC凋亡率为(1.99±0.17)％,经H2O2处理后,模型组HLEC凋亡率为(51.73±4.97)％,20μmol·L-1、40 μmol·L-1 RES处理后,HLEC凋亡率分别为(34.43±3.67)％、(26.55±2.07)％,与模型组比较,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).此外,RES还可以减少H2O2所致HLEC内caspses-3及caspase-9的表达.结论 RES可以明显抑制HLEC凋亡,其抑制凋亡的作用可能是其防止和延缓白内障发生发展的细胞学基础,从而为寻求有效的防治白内障药物提供可靠的实验依据.     

氧化损伤诱导的人晶状体上皮细胞系基因表达谱的差异和表型改变

目的：探讨人晶状体上皮细胞( hulan lens epithelial cells, HLEC)氧化刺激后基因表达谱的差异以及相应的表型改变。
　　方法：培养人晶状体上皮细胞系HLE-B3并给予H2 O2刺激。24 h后,提取细胞总RNA进行基因表达谱芯片检测,并采用生物信息学数据库DAVID对氧化刺激组相比对照组显著上调的基因进行Gene Ontology ( GO )功能富集分析。 RT-qPCR对上调的基因进行验证。通过MTT和流式细胞仪检测细胞凋亡水平。
　　结果：表达谱芯片结果显示,氧化刺激造成HLEC中367个基因上调,GO分析表明这些基因富集于310个功能类别中,主要包括p53信号通路、细胞凋亡通路、细胞程序性死亡通路等。 RT-qPCR结果证实,6个主要参与促凋亡或抗凋亡调节的基因,包括 BCL2 A1、TP53 I3、FAS、ZMAT3、DDB2和BCL2 L1,在氧化刺激后表达水平明显上升。 MTT实验和流式细胞仪检测结果显示,H2 O2刺激后HLEC凋亡逐渐上升,是细胞氧化损伤的主要表现。
　　结论：氧化刺激可同时诱导HLEC中促凋亡基因和抗凋亡基因表达水平上调,但最终仍然导致了细胞凋亡。     

短发夹状RNA干扰bcl-2后诱导人晶状体上皮细胞凋亡的实验研究

目的 应用RNA干扰技术抑制人品状体上皮细胞(HLEC)bcl-2基因表达,观察诱导其细胞凋亡情况,为防治晶状体后囊膜混浊提供新的策略.方法 实验研究.设计2条以bcl-2基因为靶标的短发夹RNA(shRNA),克隆入质粒PGCsi表达载体,分别命名为P1、P2,经脂质体转染入永生性HLEC系SRA01/04,48 h后检测转染效率和bd-2的基因及蛋白表达情况,并检测HLEC的细胞凋亡情况.多组间及组间计数资料的比较,采用随机区组设计的方差分析.结果 重组质粒经自动基因测序仪测序,证实构建成功.转染后48 h,流式细胞仪测得P1、P2转染率为44.1%、47.2%.免疫印迹法测得P1、P2组的bcl-2蛋白表达较对照组降低,实时荧光定量聚合酶链反应法测得P1、P2组的bcl-2 mRNA相对表达量为0.435、0.476,较对照组降低(F=1672.4,P<0.05),流式细胞仪双染法测得P1、P2组HLEC的细胞凋亡率分别为42.3%、45.4%,较对照组增加(F=1756.2,P<0.05),并且活化型caspase-3蛋白的表达增加.结论 P1、P2可抑制HLEC的bcl-2基因表达,并诱导HLEC凋亡.(中华眼科杂志,2009,45:636-640)     

携带人内皮抑素基因的重组腺相关病毒感染对人脐静脉内皮细胞增生的影响

目的 评价携带人内皮抑素(endostatin,ES)基因的重组腺相关病毒(rAAV)感染对人脐静脉内皮细胞(ECV304细胞)增生的影响.方法 以不同感染复数的rAAV-ES感染ECV304细胞,Western blotting检测细胞裂解液中ES蛋白的表达,ELISA法检测ES蛋白的分泌情况,流式细胞仪分析感染后ECV304的细胞周期,MTT法检测ECV304增殖情况.结果 感染了rAAV-ES的ECV304细胞可表达并分泌ES蛋白,表达高峰在感染后96h,表达量为96.93μg·L-1;感染后的ECV304细胞增殖受到抑制,流式细胞仪分析其周期中G0与G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例显著减少;MTT检测显示以感染复数为5 ×105vg·cell-1感染96h时时ECV304细胞增殖的抑制率最高(54.54±1.37)%.结论 rAAV-ES感染ECV304细胞后有高水平的ES蛋白表达并能显著抑制ECV304细胞的增殖.     

阿魏酸对高糖诱导的人晶状体上皮细胞损伤的保护作用

目的探讨阿魏酸对高糖诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)损伤的保护作用。方法以HLEC为研究对象,将细胞随机分为对照组(HLEC+DMEM)、DMSO组(HLEC+DMEM+DMSO)、高糖组(HLEC+DMEM+30 mmol·L^-1高糖)、高糖+阿魏酸组(HLEC+DMEM+DMSO+30 mmo·L^-1高糖+阿魏酸)。采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况;流式细胞术检测各组细胞凋亡;Q-PCR检测p53、Bcl-2、Bax mRNA表达水平;免疫细胞化学和Western blot法检测p53、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果高糖抑制HLEC的细胞活性,不同浓度阿魏酸干预后,HLEC的细胞活性均明显升高,差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。流式细胞术检测结果显示,高糖组HLEC凋亡率高于对照组(P<0.05),高糖+阿魏酸组细胞凋亡率低于高糖组(P<0.05);高糖组p53、Bax mRNA和蛋白表达水平均明显高于对照组,而Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平...     

色素上皮衍生因子修饰的人脐带间充质干细胞构建方法

目的:构建携带色素上皮衍生因子(pigment epithelial-derived factor,PEDF)基因的重组慢病毒,感染人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUCMSCs),探讨PEDF在hUCMSCs中的表达及重组慢病毒对hUCMSCs活性的影响.方法:利用pLenti-CMV-hChR2-EYFP 载体系统,构建携带PEDF基因的重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP,进一步感染hUCMSCs,获得携带PEDF基因的hUCMSCs(PEDF-hUCMSCs),激光共聚焦显微镜和ELISA法检测PEDF-hUCMSCs 的PEDF蛋白表达情况,采用CCK8法检测PEDF-hUCMSCs的活性.通过观察细胞形态和流式细胞术检测验证重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP感染hUCMSCs后对细胞传代、细胞表型的影响.结果:成功构建携带PEDF基因的重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP,高效感染hUCMSCs,获得的PEDF-hUCMSCs能有效表达PEDF蛋白,检测结果显示重组病毒感染组细胞与空白对照组细胞活性无统计学差异(P>0.05).重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP感染对hUCMSCs的增殖能力、细胞形态和细胞表型没有明显改变. 结论:携带PEDF基因的重组慢病毒pLenti-CMV-PEDF-EYFP修饰的PEDF-hUCMSCs能有效表达PEDF蛋白,为进一步探索应用PEDF-hUCMSCs治疗视网膜色素变性疾病奠定了实验基础和理论依据.     

Thiel-Behnke角膜营养不良活体共聚焦显微镜下特征及TGFBI基因突变分析

目的 研究Thiel-Behnke角膜营养不良患者临床表现、活体共聚焦显微镜下影像学特征及其TGFBI基因突变。 设计 前瞻性研究。 研究对象 Thiel-Behnke角膜营养不良家系35名成员。 方法 对该家系成员进行视力、裂隙灯显微镜、眼前节相干光断层扫描以及活体共聚焦显微镜检查；取外周静脉血制备血白细胞基因组DNA，PCR扩增TGFBI致病基因，分析患者基因序列变化情况。 主要指标 视力、裂隙灯显微镜检查、眼前节相干光断层扫描影像学观察、活体共聚焦显微镜检查，以及患者外周血基因序列突变分析。 结果 本家系4代35名家系成员中，10例患者表现为双眼角膜前弹力层及其附近可见弥漫性、灰白色混浊物沉积；病灶主要位于角膜中央区和角膜中周部的前弹力层，但浅基质层亦可见点状混浊病灶，呈线状或蜂窝状外观。眼前节相干光断层扫描显示患者角膜前弹力层及浅基质层出现连续、均匀一致的高反光沉积物，沉积物前缘（朝向上皮层）呈锯齿样；活体共聚焦显微镜在上皮层至浅基质层之间可见高反光、不规则、无定形物质沉积，病灶及周围组织未见炎性细胞浸润。外周血基因序列示该家系患者TGFBI基因第12外显子的第39密码子第2个碱基呈杂合子点突变G→A，导致精氨酸转变为谷氨酰胺取代（R555Q）。 结论 R555Q突变所致的Thiel-Behnke角膜营养不良活体共聚焦显微镜下影像学特征为角膜前弹力层高反光、不规则、蜂窝状、无定形物质沉积。     

Imbalanced IL-37/TNF-α/CTSS signaling disrupts corneal epithelial barrier in a dry eye model in vitro

PurposeTo explore novel role and molecular mechanism of a natural anti-inflammatory cytokine interleukin (IL) 37 in preventing corneal epithelial barrier disruption from hyperosmolar stress as can occur in dry eye disease.MethodsPrimary human corneal epithelial cells (HCECs) were cultured from fresh donor limbal explants. An in vitro dry eye model with hyperosmolar stress was established by switching HCECs from isosmolar (312mOsM) to hyperosmolar medium (350–500 mOsM), and some cells were treated with rhIL-37 or rhTNF-α, for different periods (2–48 h). The expression of cytokines and cathepsin S, and barrier protein integrity were evaluated by RT-qPCR, ELISA, and immunofluorescent staining with confocal microscopy.ResultsThe integrity of epithelial barrier was significantly disrupted in HCECs exposed to hyperosmolar medium, as shown by immunofluorescent images of tight junction (TJ, ZO-1, occludin and claudin-1) and adheren junction (E-cadherin) proteins. TNF-α accentuated hyperosmolar-induced disruption of TJ barrier functional integrity whereas exposure to IL-37 blunted or even reversed these changes. Cathepsin S, encoded by CTSS gene, was found to directly disrupt epithelial barrier integrity. Interestingly, CTSS expression was significantly induced by TNF-α and hyperosmolarity, while exogenous rhIL-37 inhibited TNF-α and CTSS expression at mRNA and protein levels following hyperosmolar stress. Furthermore, rhIL-37 restored barrier protein integrity, observed in 2D and 3D confocal immunofluorescent images, in HCECs under hyperosmolar stress.ConclusionOur findings demonstrate a novel signaling pathway by which anti-inflammatory cytokine IL-37 prevents corneal epithelial barrier disruption under hyperosmotic stress via suppressing TNF-α and CTSS expression. This study provides new insight into mechanisms protecting corneal barrier in dry eye disease.     

伴有角膜浑浊玻璃体视网膜手术临床探讨

目的探讨眼外伤角膜浑浊状态下玻璃体视网膜手术的手术时机、方法及技巧。方法对65例（67眼）眼外伤角膜浑浊（≥2／5面积）术中采用刮除角膜上皮、应用棱镜式接触镜、转动眼位及头位、巩膜外顶压及临时人工角膜等不同的手术方法和技巧,完成玻璃体视网膜手术。结果本组67眼全部顺利完成手术中各项操作,其中9眼眼内异物均在直视下摘出。术后有13眼（19．40％）视网膜脱离,其中6眼再次手术成功,7眼放弃手术。随访6～12个月,最终视力≥眼前数指者39眼（58．21％）,眼球萎缩9眼（13．43％）。同时行穿透性角膜移植3眼,2眼植片透明,1眼植片浑浊。结论眼外伤角膜浑浊状态下,应尽量采取相应措施完成玻璃体视网膜手术,以挽救视功能或保留眼球。     

Studies on the use of desferrioxamine in experimental ocular siderosis produced by extrabulbar administration of iron

The objective of these studies was to find out whether iron administered extrabulbarly can penetrate inside the eyeball and whether this process can be checked by transconjunctival injections of desferrioxamine. Histological examination revealed that 12 months after the placing of iron in the orbit, an accumulation of the metal can be observed in the sclera, choroid, and retina of untreated animals. In the group of animals treated with desferrioxamine, iron did not penetrate into the eyeball, and only in some animals could its presence be found in superficial layers of the sclera. The possibility is discussed of using the drug for the treatment of conditions resulting from the presence of foreign bodies in the orbit.     

应用23G玻璃体切除术治疗金属异物所致眼球贯通伤

目的 探讨23G玻璃体切除手术治疗金属异物所致眼球贯通伤的效果,分析其有效性及安全性.方法 26例（26眼）因金属异物所致眼球贯通伤,术前常规CT和（或）DR异物定位和（或）眼部B超定位,行角膜和（或）巩膜伤口清创缝合、白内障摘出和（或）同时施行23G玻璃体切除、眼内异物摘出、视网膜激光光凝、C3F8或硅油填充等治疗.术后随访3～24个月.结果 26例经一期或二期23G玻璃体切除手术均顺利摘出异物.大部分患者术后视力有不同程度提高.术后裸眼视力≥0.3者3眼,0.12～ 0.25者5眼,手动～0.1者10眼,光感者6眼,无光感者2眼;术后有19眼解剖及功能修复、视力较术前提高,4眼解剖修复、视力同术前,1眼为硅油依赖眼,1眼眼球萎缩,1眼行眼球摘除术.结论 金属异物所致眼球贯通伤行一期处理后适时施行玻璃体切除术,可以改善其预后;23G玻璃体切除术可安全有效地应用于眼球贯通伤患者.     

玻璃体手术治疗眼球壁异物疗效观察

目的 观察玻璃体手术治疗眼球壁异物的临床疗效.方法 回顾性总结分析21例(21只眼)眼球壁异物(除外异物直接暴露于巩膜外,并能直视下夹取者),经玻璃体切除手术取出后视力恢复及并发症的发生情况.结果 眼球壁异物21例(21只眼)中,20只眼异物一次性取出,1只眼异物顶出后极部眼球壁外.术后视网膜在位17只眼,视网膜脱离4...     

眼内异物的B型超声扫描诊断分析

目的：分析眼异物在B型超声扫描探查中的声像学特点及定位的优势，为临床诊断提供依据。方法：采用眼科专用A、B型两用超声波扫描仪，对38例眼异物进行探查。结果：本组38例中32例经B超探查发现异物回声，异物检出率为84．2％（32／38）其中眼内异物22例（57．9％）；眼球壁异物9例（23．7％）；眶内异物1例（2．6％）。有30例行X光或CT检查，结果23例发现异物，异物检出率为76．6％（23／30），其中眼内异物16例（53．3％）；球壁异物4例（13．3％）；眶内异物3例（10．0％）。结论：B型超声探查对于眼内异物，特别是眼球壁异物具有特异性的诊断价值。     

眼表糖萼屏障及其在干眼中的应用

研究表明,眼球表面上皮细胞中高度糖基化的黏蛋白和半乳糖凝集素-3共同形成的糖萼屏障对眼球表面湿润性和润滑性的维持十分重要。而干眼患者眼球表面湿润性降低及泪膜破裂时间缩短与糖萼屏障的损伤密切相关。本文旨在概述眼球表面糖萼屏障的组成及其在干眼中的变化,介绍评估干眼患者糖萼屏障损伤的新方法,并对目前使用的两种靶向治疗干眼患者眼球表面糖萼屏障损伤的药物进行综述。     

眼部弓箭射伤诊治的体会

目的探讨眼部弓箭射伤的手术治疗方法。方法7例（7眼）眼部弓箭伤进行分析。7例眼部巨大异物（箭）分别采用分离软组织后拔出和眼球摘除同时拔出异物（箭）。结果7例均完整取出弓箭异物，不伤及眼球者视力完好，眼球破裂者视力丧失，伴颅脑损伤者有神经并发症。结论眼部弓箭射伤是罕见的眼部巨大异物，需及时手术取出，术前行CT检查，手术的方式根据箭伤及的部位和是否伴有眼球贯通和颅脑伤。     

肝细胞生长因子诱导实验性视网膜脱离的病理机制研究

目的 观察肝细胞生长因子（HGF）对视网膜色素上皮（RPE）细胞屏障功能的影响以及RPE内过度表达HGF导致视网膜脱离（RD）的病理机制。 方法 编码HGF（AdCMV.HGF）、绿色荧光蛋白（Ad CMV.GFP）的E1/E3缺失的腺病毒载体，以5×10⁴ 噬斑形成单位（pfu）/眼注射到成年有色兔的视网膜下。检查注射后3、7、14、28 d时的眼底及组织病理变化,利用免疫组织化学和酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测HGF在视网膜和玻璃体的表达水平。 结果 对照组注射Ad CMV.GFP眼显示GFP几乎仅表达于PRE单核细胞层，AdCMV.HGF注射眼在注射点处的PRE细胞出现强的HGF免疫阳性反应。玻璃体内HGF的表达水平在注射7 d后达到最高峰、28 d后降低到基础水平。在HGF的表达期内AdCMV.HGF注射眼出现慢性RD和脉络膜慢性炎症。在RD区域，视网膜下的空间内可见增生性的RPE细胞，部分实验兔眼还产生多层的细胞膜结构。 结论 RPE内过度表达的HGF能引发慢性浆液性RD，同时伴有视网膜下RPE增生。提示HGF可能作为治疗RD的作用靶点。(中华眼底病杂志，2007，23：193-197)     

Fluorescent photoreceptors of transgenic Xenopus laevis imaged in vivo by two microscopy techniques

PURPOSE: To develop a method for imaging individual photoreceptors in an intact transgenic Xenopus eye, thus allowing in vivo observation of the effects of various transgenes on photoreceptor development, degeneration, or both. METHODS: Albino and pigmented transgenic Xenopus laevis that express enhanced green fluorescent protein (GFP) in the major ("red") rods were generated. The distribution of GFP throughout the retina and within the rods was evaluated by confocal microscopy of frozen sections and immunoelectron microscopy. In vivo images of photoreceptors were obtained using conventional fluorescence microscopes to image through the lens of the eye or a laser scanning confocal microscope to image through the hypopigmented iris of albino eyes. RESULTS: Confocal and immunoelectron microscopy of tissue sections showed that GFP was predominantly localized to the inner segments of the major rods; a smaller amount was in the outer segments. In a number of animals, not all the major rods expressed GFP. It was possible to identify these animals by obtaining fluorescence images of the retinas of intact, living tadpoles with conventional fluorescence microscopes, using the lens of the tadpole as part of the optical path. Confocal images of living animals could be used to visualize the distribution of GFP within the photoreceptors. CONCLUSIONS: The ability to observe individual photoreceptors noninvasively allows in vivo longitudinal microscopic analysis of photoreceptor development in transgenic Xenopus tadpoles.