壳聚糖及其衍生物作为组织工程角膜支架的研究进展

利用组织工程技术构建组织工程角膜能够从根本上解决角膜移植供体不足和术后免疫排斥等问题.理想的支架材料是构建组织工程角膜的重要条件.壳聚糖及其衍生物具有良好的透明性、生物相容性、可降解性、力学性能和可塑性,在角膜组织工程中具有良好的应用前景.本文对壳聚糖及其衍生物在角膜组织工程中的研究现状进行了综述,讨论了目前存在的问题,为构建满足临床要求的组织工程角膜提供指导.     

利用纤维蛋白-琼脂糖支架构建完整的兔角膜替代物

目前，对不可逆性角膜病变唯一的治疗方法是角膜移植术，但由于供体器官缺乏、移植术后免疫排斥反应使角膜移植术受到限制，组织工程化角膜克服了这一缺点。理想的生物材料应具备生物相容性、透明性、稳定性且角膜细胞能够在上面黏附生长。作者用兔角膜3种细胞为种子细胞，用纤维蛋白一琼脂糖为支架通过在多孔培养嵌入物上的相继培养法成功构建了全层兔角膜替代物。     

干细胞与角膜眼表重建研究进展

角膜是眼表的重要防护屏障和光学系统的重要组成部分,其完整性和透明性是实现有效视功能的重要前提。各种原因造成的眼表疾病未经及时有效治疗都有可能发展到终末阶段———角膜缘干细胞功能障碍,包括角膜缘干细胞数目的减少和微环境的病理改变。自体角膜移植无疑是治疗角膜缘干细胞功能障碍最有效的方法。但是供体角膜来源十分有限,且切除健眼组织行角膜移植可能会对健眼造成长期损害。随着干细胞研究的不断深入和组织工程技术的兴起,组织工程角膜应运而生,并且迅速发展。其基本原理为选用生物性能良好的支架材料,体外模拟角膜缘干细胞微环境,诱导各类种子干细胞分化为角膜类上皮,然后再行角膜眼表重建。常用种子细胞包括角膜缘干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、骨髓间充质干细胞、皮肤干细胞、口腔黏膜干细胞。本文就上述干细胞在角膜眼表重建中的应用作一综述。     

组织工程构建角膜上皮中相关种子细胞的研究进展

传统角膜移植术存在着供体来源缺乏、术后免疫排斥等问题.虽然很多地方已建立了眼库,但供体来源依然有限.因此,构造一种类似正常角膜结构的组织工程角膜、扩大角膜移植供体来源、满足患者需求成为治疗严重眼表疾病需要迫切解决的问题.本文对角膜上皮细胞的组织工程构建中采用的种子细胞进行归类,并介绍相关的重建方法及分析各种种子细胞在角膜上皮细胞组织工程中的优势及存在的问题,以期能为该领域的研究提供有益的探索方向.     

脱细胞猪角膜基质的生物相容性与组织工程化兔角膜上皮移植的研究

目的 探讨脱细胞猪角膜基质的生物相容性,评价组织工程化角膜上皮组织作供体的可行性,观察支架材料的细胞化情况和种子细胞的存活情况.方法 实验研究.采用完全随机化设计的方法,用Dispase-Triton-X-100处理猪角膜基质,脱去角膜细胞;以角膜基质囊袋内植入的方法,观察异种角膜基质植入后的生物相容性,A组:脱细胞猪角膜基质,B组:新鲜猪角膜基质,C组:空白对照组.以组织工程化雄性角膜上皮组织为供体,同种雌性为受体,作板层角膜移植,观察角膜的混浊、水肿、新生血管等情况;组织病理学和免疫组化方法检测支架材料的细胞化情况,Y染色体性别决定基因(SRY)-聚合酶链反应(PCR)方法追踪种子细胞的存活情况.结果 猪角膜基质植入兔角膜囊袋后,角膜逐渐恢复透明,排斥反应指数＜6,组织病理学观察角膜结构完整,胶原纤维平行排列,少许细胞长入脱细胞猪角膜基质边缘,各组免疫组化检测未见CIM+、CD8+T淋巴细胞浸润.组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植后,3～4 d上皮光滑,10～20 d变为透明;15 d时角膜上皮、基质、内皮完整,上皮细胞约4或5层结构,少许基质细胞长入支架,1个月时可见角膜上皮细胞约7或8层细胞,基质纤维排列规则,多量细胞长入脱细胞角膜基质.上皮细胞表达CK3,支架内新生细胞表达波形蛋白.SRY-PCR结果显示种子细胞可以在受体内长期存活.结论 脱细胞猪角膜基质生物相容性良好,组织工程化角膜上皮可作为板层角膜移植的供体,脱细胞猪角膜基质细胞化良好,种子细胞可以在受体内长期存活.     

组织工程角膜上皮支架材料研究进展

体外培养角膜缘干细胞构建组织工程角膜上皮后再行角膜移植是治疗角膜缘干细胞缺乏导致眼表疾病的重要方法,选择理想的支架材料是构建组织工程角膜上皮过程中的一个关键环节。但支架材料的组织相容性、透光度,支架材料的降解与角膜修复的同步化,手术的长期有效性等问题仍有待进一步研究。细胞生物学、分子生物学、组织工程学和材料学的发展为构建组织工程角膜上皮的研究开辟了更广阔的前景。从近年来新发现或研制的支架材料的来源、优缺点及应用等方面,就构建组织工程角膜上皮支架材料的研究进展进行综述。     

组织工程角膜内皮移植研究进展

由于角膜供体材料严重短缺, 穿透角膜移植术及角膜内皮移植术的临床广泛开展受到严重制约, 其根本原因在于健康角膜内皮的增生能力有限。随着组织工程技术和细胞工程技术不断发展, 组织工程角膜研究已取得一定进展, 应用组织工程技术体外培养高密度、具备健康内皮功能的角膜内皮细胞进行移植是当前研究的热点。组织工程角膜内皮技术研发的关键在于种子细胞、载体材料和移植方式的选择。目前, 国内外大量研究的种子细胞来源包括人角膜内皮细胞、干细胞、血管内皮细胞及人羊膜上皮细胞等。常见的载体材料包括羊膜、脱细胞角膜基质、后弹力层、晶状体前囊膜等。体外培养的细胞采用穿透角膜移植术、角膜内皮移植术或前房注射细胞的方式进行移植。本文从角膜内皮种子细胞来源、移植载体选择以及角膜内皮移植方法等方面就组织工程角膜内皮移植研究进展进行综述, 总结目前研究面临的问题并展望其前景。     

异种脱细胞角膜基质材料的生物相容性研究

目的：研究脱细胞猪角膜基质材料在角膜组织中的生物相容性,为组织工程角膜的构建寻找一种良好的支架材料。方法：将用去垢剂联合酶的方法脱细胞处理的猪角膜基质材料植入兔角膜基质囊袋中,进行裂隙灯观察并照相。不同时间取材HE染色,进行光镜检查。结果：脱细胞猪角膜基质材料植入兔角膜基质囊袋,观察4mo,生物相容性良好,材料逐渐降解吸收。结论：脱细胞猪角膜基质材料植入兔角膜中无炎症、无免疫排斥反应,生物相容性好,可作为组织工程角膜的支架材料。     

构建组织工程人工角膜的天然生物材料的研究进展

当角膜失去透明性或者形状发生改变时,可能会造成视力的丧失。最有效的治疗手段是使用全层或者部分层供体角膜进行角膜移植手术。然而,在全球范围内捐赠角膜的来源严重不足,约有超过98.5%的角膜盲患者在等待捐赠角膜。此外,在角膜移植后,存在感染的可能以及异体移植免疫排斥反应等问题。因此,多年以来组织工程角膜作为供体角膜的可行替代品,不同材料和方法已被广泛研究。并且在近十几年来,有了突破性的进展。研究的最终目的是为了构建具有良好透明性、生物相容性以及合适机械强度的组织工程全层或部分层人工角膜,以修复、再生或替换病变角膜。本综述讨论了近年来最常被研究的天然生物材料包括羊膜、脱细胞角膜、胶原、蚕丝,作为人工角膜支架的研究进展以及目前存在的问题。并进一步说明了该领域中上述讨论的生物材料所面临的其他挑战,以及今后的研究方向。     

组织工程角膜支架材料的研究进展

理想的支架材料是组织工程角膜构建的重要条件.目前常用的组织工程角膜支架材料主要包括生物材料、人工材料、复合材料.羊膜、脱细胞角膜基质等生物材料是一种天然结构,具有组织相容性好、含有多种细胞因子、对人体无刺激性等优点,但来源有限,可塑性欠佳.聚羟基乙酸等高分子有机合成材料来源广泛、制作工艺简单、力学性能可控,但在人体代谢过程不尽清楚.复合材料综合了生物材料和有机合成材料的优点,但复合材料的混合比例,生物相容性和其他理化特性还需进一步研究.因此,寻找具有更高生物活性、安全性、透明性的支架材料仍是当前组织工程角膜研究的重点.     

组织工程化角膜支架的研究进展

近20年来,应用组织工程技术构建角膜组织——组织工程化角膜的构建取得了较大的进展。然而,能够广泛应用于临床的组织工程化角膜的构建仍不够完善。组织工程化角膜支架是构建组织工程化角膜的重要组成部分之一。探寻生物相容性好、可降解并具有足够生物力学强度的支架材料是组织工程化角膜研究领域亟待解决的课题。就组织工程化角膜支架的发展历程进行概括总结,评价不同支架材料的优缺点,拓展理想支架材料的研发视野,为可广泛用于临床的组织工程化角膜的研制提供信息。     

异种角膜基质材料的制备和体外细胞种植的实验研究

目的研究异种角膜基质生物支架材料的制备方法和体外种植兔角膜基质细胞后细胞在材料上的生长、增殖情况。方法将York猪全层角膜用去垢剂联合0．25％胰蛋白酶、DNA-RNA酶祛除猪角膜基质细胞并冻干制备成支架材料；将兔角膜组织块用胶原酶消化后，用含10％血清的DMEM培养液体外培养，并做波形丝蛋白，角蛋白免疫组织化学染色检测；将培养的兔角膜基质细胞的2～3代接种在材料上，培养5d后，做HE染色、扫描电镜观察。结果猪角膜基质片经脱细胞处理后，细胞成分祛除干净并保留了角膜组织的三维网格状结构，网状间隙明显增大，利于细胞生长；体外培养的兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色为阳性、角蛋白染色为阴性；HE染色、扫描电镜结果显示兔角膜基质细胞在支架材料上生长、增殖良好。结论异源性角膜经祛脱细胞处理而获得的生物支架材料利于异种细胞的黏附和增殖，可进一步用于组织工程角膜的研究。     

利用组织工程方法治疗角膜缘干细胞缺失的相关研究进展

角膜缘干细胞在角膜上皮更新和创伤愈合中起重要作用,角膜缘干细胞缺失可导致各种严重眼表面疾患。因为治疗上存在自体移植的健眼损伤问题,同种异体移植的排斥反应以及供体不足等问题,近年来随着对干细胞研究的深入以及组织工程学的发展,有利于克服和解决上述问题,为角膜缘干细胞缺乏的治疗带来了曙光。本文通过近年来组织工程治疗角膜缘干细胞缺失的相关研究的回顾,归纳了种子细胞和支架材料选择两方面的研究进展,以探索该领域存在的问题和未来的研究方向。（国际眼科纵览, 2017,  41:   346-351）     

原花青素交联的支架材料的生物相容性研究

目的 探讨原花青素作为交联剂的壳聚糖、胶原蛋白、硫酸软骨素、透明质酸钠合成的支架材料植入兔角膜的生物相容性.方法 将壳聚糖、胶原蛋白、硫酸软骨素、透明质酸钠等溶液按照一定的比例混合,加入原花青素和戊二醛溶液作为交联剂,制成2种支架材料分别植入2组新西兰大白兔角膜的囊袋内.在不同的时间点进行裂隙灯显微镜观察照相,并进行组织病理学检查,比较不同的支架材料对角膜的影响.结果 原花青素交联组术后1周有结膜睫状充血,角膜水肿;2周后充血水肿逐渐消失.兔眼角膜情况稳定,术后4个月基本透明;材料与角膜的生物相容性好,5个月后材料大部分吸收溶解,角膜透明.组织病理学检查可见兔角膜标本中材料内有角膜基质细胞长入.原花青素交联的支架材料比戊二醛交联的支架材料刺激性小.结论 原花青素交联的壳聚糖、胶原蛋白、硫酸软骨素、透明质酸钠组成的支架材料与角膜组织具有良好的生物相容性,原花青素可能比戊二醛更适合作为支架材料的交联剂.     

组织工程角膜三维构建的实验研究

目的以人胚胎干细胞（hESC）诱导细胞为种子细胞,以脱细胞猪角膜基质（APCM）为支架三维构建生物工程角膜,以期用于穿透性角膜移植,解决角膜供体极度匮乏的难题。方法实验研究。无菌条件下将新鲜猪角膜组织置于0.5% SDS溶液中4 ℃脱细胞 24 h,获取APCM。将hESCs与人角膜基质细胞通过Transwell共培养5 d,获取眼周间充质干细胞（POMPs）,再于人晶状体上皮细胞源性条件培养基继续培养14 d获取角膜内皮样细胞并进行鉴定和筛选纯化。将纯化后扩增的角膜内皮样细胞接种于APCM构建角膜内皮植片,并移植入角膜内皮功能失代偿动物模型进行泵功能评估;采用人角膜缘干细胞（LSCs）来源的条件培养基培养hESCs 12 d,诱导其分化人角膜上皮样细胞并筛选鉴定,将其与APCM构建的角膜上皮植片移植于LSC失代偿动物模型的角膜缘,观察其眼表修复能力。结果诱导的人角膜内皮样细胞表达内皮细胞相关标记物vimentin、N-cadherin、Na+/K+ATP酶和ZO-1。构建的角膜内皮植片能够促使角膜内皮功能失代偿动物的角膜逐渐恢复透明。构建的角膜上皮细胞植片具有4～5层细胞复层结构,类似于正常角膜上皮,且能够一定程度上修复LSC失代偿动物模型眼表。结论采用hESCs诱导分化来源的细胞与APCM构建的人角膜内皮植片和人角膜上皮植片具有类似于正常角膜的功能,为全层生物角膜的构建提供了良好的实验和理论基础,具有良好的临床应用前景。     

Ex vivo expansion of corneal limbal epithelial/stem cells for corneal surface reconstruction

PURPOSE: The management of severe ocular surface disease due to limbal stem cell deficiency has changed dramatically. The concept of limbal stem cells, as the source of corneal epithelium revolutionised the therapeutic approach of ocular surface reconstruction. Deficiency of limbal stem cells results in blinding ocular surface diseases. Grafting viable limbal tissue, from either fellow healthy eye or a donor eye, with the resident stem cell population may replenish limbal stem cells and can restore the corneal surface to normality. Transplanting the limbal tissue can be achieved through a variety of procedures that include cadaveric keratolimbal allograft (KLAL), live or living related conjunctival limbal allograft (Ir-CLAL) and limbal autograft. Advances in tissue engineering techniques have offered a viable alternative to overcome the limitation of limbal tissue available for transplantation. Epithelial stem cells harvested from a small limbal biopsy can be expanded in vitro on a suitable carrier and then transplanted to the diseased cornea to successfully restore the corneal surface. This article is a chronological review of the important steps that brought ex vivo expanded stem cell transplantation in ocular, particularly corneal surface reconstruction. METHODS: The MEDLINE data base was searched for the years 1966-2002, using key words cornea, cell culture, ex-vivo expansion, limbus, stem cell, ocular surface and transplantation. Several articles that were not found by MEDLINE search were taken from references from other articles. Inclusion or exclusion of article was based on the relevance to the subject. CONCLUSIONS: Corneal epithelial reconstruction with ex vivo expanded limbal cells is a potential tool in ocular surface reconstruction, although the technique is currently investigational. Strategies to achieve conjunctival epithelial restoration and tear film replenishment will allow ophthalmic surgeons to truly reconstruct the ocular surface.     

Stem cell–based therapy for corneal epithelial reconstruction: present and future

Limbal stem cell deficiency is a painful and potentially blinding disease. Cultured limbal epithelial transplantation (CLET) is frequently performed for corneal surface reconstruction with variable clinical success. This work summarizes recent developments and trends that have the potential to increase safety and efficacy of CLET in the future. Apart from gradual transition to xenobiotic-free culture systems, novel biofunctional scaffolds presenting components of stem cell microenvironments aim at promoting long-term maintenance of stem cells in vitro and after transplantation. Hair follicles and other tissues may serve as autologous sources of adult stem cells in bilateral ocular surface disease. However, despite all progress made in the fields of tissue engineering and cell therapy, it is unlikely that CLET will yield fully satisfactory clinical results until the factors that govern limbal stem cell maintenance and differentiation are identified.     

关注组织工程角膜基础研究的挑战

近20年来,应用组织工程技术构建角膜组织的研究取得了显著进展,对角膜种子细胞、载体材料、构建方法等有了越来越深入的认识.然而,组织工程角膜的基础研究仍面临艰巨挑战,如合适的载体与种子细胞的选择,构建方法的优化和标准化,以及远期效果的评估等.后续研究有待于解决这些问题,并将组织工程全角膜真正带入临床使用阶段.     

Ocular surface reconstruction using autologous rabbit oral mucosal epithelial sheets fabricated ex vivo on a temperature-responsive culture surface

PURPOSE: Autologous stem cell transplantation for total limbal stem cell deficiency is immunologically preferable, to avoid allograft rejection. This study was undertaken to investigate the possibility of a novel tissue engineering approach for ocular surface reconstruction, using autologous oral mucosal epithelial stem cells expanded ex vivo on temperature-responsive cell culture surfaces. METHODS: Rabbit oral mucosal epithelial cells cultured on temperature-responsive culture surfaces with mitomycin-C-treated 3T3 feeder cells for 2 weeks produced confluent epithelial cell sheets. Putative progenitor cell populations were estimated by colony-forming assays. Autologous transplantation of these cell sheets to surgically manipulated eyes was performed, and ocular surface reconstruction and cell phenotypic modulation were examined. RESULTS: All cultured oral epithelial cells were nonenzymatically harvested as transplantable intact cell sheets by reducing culture temperature to 20 degrees C. Oral epithelial cells were stratified in three to five cell layers more similar to corneal epithelium than to oral mucosal epithelium. Colony-forming assays and immunofluorescence for p63, beta1-integrin, and connexin 43 indicated retention of viable stem and/or progenitor cell populations in cell sheets. Autologous transplantation to rabbit corneal surfaces successfully reconstructed the corneal surface, with restoration of transparency. Four weeks after transplantation, epithelial stratification was similar to that in the corneal epithelium, although the keratin expression profile retained characteristics of the oral mucosal epithelium. CONCLUSIONS: Cell sheet harvest technology enables fabrication of viable, transplantable, tissue-engineered epithelial cell sheets that retain putative progenitor cells from autologous oral mucosal epithelial cells. Promising clinical capabilities for autologous tissue-engineered epithelial cell sheets for ocular surface reconstruction are indicated.