丙戊酸钠对体外培养的人晶状体上皮细胞增生的抑制作用

目的 探讨丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)对体外培养的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLECs)增生和细胞周期的影响.方法 采用不同浓度的VPA(0.5 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L～、4 mmol·L-1)作用于HLECs,四甲基偶氮唑蓝法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测在不同时间点(24 h、48 h、72 h)VPA对细胞增生的抑制作用;流式细胞仪测定VPA(1 mmol·L-1、2 mmol·L-1)作用于HLECs 48 h后细胞周期分布情况;Western blot测定在VPA(1 mmol·L-1、2mmol·L-1)作用于HLECs 48 h后,细胞周期依赖性激酶抑制因子(p21)在蛋白质水平表达量的改变.结果 MTT检测显示VPA浓度≥0.5 mmol·L-1对体外HLECs增生的抑制作用呈时间和剂量依赖性.VPA作用48 h后,各药物浓度组(0.5 mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1、4 mmol·L-1)细胞生长抑制率分别为11.05%、21.58%、26.67%和38.25%,流式细胞仪检测显示VPA可阻滞HLECs由G0/G1期向s期转换,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少.经2 mmol·L-1VPA作用48 h,G0/G1期及S期细胞比例分别为(85.40±3.90)%和(7.35±1.47)%,与阴性对照组[(53.14±1.71)%和(35.31±1.14)%]比较差异具有统计学意义(P<0.05).Western blot检测发现VPA可促进p21蛋白质水平的表达.VPA处理48 h后,各组平均灰度比值分别为0.582±0.082(1 mmol·L-1)和0.914±0.113(2 mmol·L-1),与阴性对照组(0.303±0.029)比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 VPA可以通过促进p21表达,使HLEcs阻滞于G0/G1期,最终抑制HLECs增生.     

碱性成纤维细胞生长因子促人晶状体上皮细胞增生的研究

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子（ｂ－ＦＧＦ）在后发性白内障形成过程中的作用。方法 应用体外培养人的晶状体上皮细胞,第３代细胞悬液接种于２４孔培养板内,加入不同终浓度的ｂ－ＦＧＦ（０,１,０,１０．０,１００．０ｎｇ／ｍｌ）,每组重复３孔,培养７２ｈ后,细胞计数。结果 ｂ－ＦＧＦ添加组,细胞增生呈浓度依赖性,ｂ－ＦＧＦ浓度越高,细胞增生越快。结论 白内障手术后房水中内源性ｂ－ＦＧＦ的增加可能是后发     

维拉帕米对人晶状体上皮细胞整合素表达的抑制作用

目的研究钙通道阻滞剂维拉帕米对人晶状体上皮细胞（LECs）株SRA01/04整合素表达的影响。方法对人LECs株SRA01/04进行培养并传代,分别以0.02、0.04、0.08mmol/L的维拉帕米作用于SRA01/0424h,经流式细胞仪检测SRA01/04各整合素的阳性表达率。结果整合素α2、α3、α5、β1、β2在人LECs株SRA01/04中呈阳性表达,维拉帕米对其表达具有抑制作用,并随药物浓度的增加而逐渐增强（P〈0.05）。结论钙通道阻滞剂维拉帕米对LECs整合素的表达具有抑制作用,可能阻碍整合素介导的LECs黏附、移行和增生,有望成为防治后发性白内障的有效药物。     

榄香烯对人晶状体上皮细胞增生及细胞周期的影响

目的探讨中药单体榄香烯（Ele）对人晶状体上皮细胞株（HLE-B3）增生及细胞周期的影响。方法利用重组人碱性成纤维细胞生长因子（rhbFGF）诱导HLE-B3增生,将80mg/L的Ele作用在处于增生状态下的HLE-B324h后,四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测Ele对HLE-B3增生的抑制作用;苏木精-伊红染色观察Ele作用后HLE-B3细胞形态的改变;流式细胞术（FCM）检测Ele对HLE-B3细胞周期的影响。结果MTT检测显示：rhbFGF组HLE-B3吸光度值（0.5990±0.0531）较正常组（0.4091±0.0422）显著升高,Ele组HLE-B3吸光度值（0.4500±0.0614）较rhbFGF组显著降低,抑制率达24.90%（P〈0.01）。苏木精-伊红染色后光学显微镜下观察到rhbFGF组较正常组细胞数量增多,细胞形态清晰,胞浆丰富,胞核清晰,交织呈网状结构;Ele组细胞数量明显减少,胞浆减少,轮廓不清,交织的网状结构减少,甚至有的细胞变圆,细胞核凝集,见核固缩现象,胞浆嗜酸性染色。FCM检测细胞周期变化时发现：G1期的细胞在rhbFGF组（42.062%±1.270%）较正常组（46.422%±3.765%）减少（P〈0.05）,Ele组（60.665%±2.069%）较rhbFGF组明显增加（P〈0.01）;S期的细胞在rhbFGF组（51.647%±1.123%）较正常组（31.842%±2.798%）明显增加（P〈0.01）,Ele组（30.222%±3.429%）较rhbFGF组明显减少（P〈0.01）;G2期的细胞在rhbFGF组（6.288%±0.966%）较正常组（21.735%±3.806%）明显减少（P〈0.01）,Ele组（9.112%±1.659%）较rhbFGF组明显增加（P〈0.01）。结论Ele能通过改变HLE-B3细胞形态及细胞周期的进程而有效抑制rhbFGF诱导的HLE-B3增生,有望成为防治后发性白内障的理想药物。     

MG132对体外培养人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用

目的 研究蛋白酶体抑制荆MG132对晶状体上皮细胞系SRA01/04细胞增殖的影响,探讨其抑制细胞增殖的有效药物浓度及分子机制.方法 不同浓度的MG132分别处理SRA01/04细胞36h,通过MTT法检测MG132对SRA01/04细胞增殖的影响,通过流式细胞术检测MG132对SRA01/04细胞凋亡的影响,通过Annexin V-FITC/PI双染法在荧光显微镜下观察SRA01/04细胞早期凋亡形态.结果 随着MG132浓度的升高,对SRA01/04细胞增殖的抑制作用逐渐增强,半数有效抑制浓度IC50为2.48μmol·L-1.MG132可诱导SRA01/04细胞凋亡;流式细胞术结果表明:浓度为2.5μmol·L-1、5.0μmol.L-1的MG132作用SRA01/04细胞36h后,细胞早期凋亡率分别为6.55%±0.35%和13.75%±3.18%,而0μmol·L-1为0.75%±0.21%,差异均有统计学意义(均为P<0.05).凋亡细胞被Annexin V-FITC单独染色(绿色荧光),活细胞不被染色,坏死细胞被Annexin V-FITC和PI(红色荧光)同时染色.结论 蛋白酶体抑制剂MG132可通过诱导细胞凋亡来抑制SRA01/04细胞的增殖,起到防治后发性白内障的作用.     

姜黄素对人晶状体上皮细胞增生的抑制作用

目的探讨姜黄素(curcumin,CUR)对人晶状体上皮细胞株SRA01/04(human lens epithelial cell line SRA01/04,HLECSRA01/04)增生的抑制作用及其剂量-效应与时间-效应的关系。方法MTT比色法分别测定不同浓度的CUR作用于HLEC不同时间后的细胞生长抑制率;不同浓度的CUR作用于HLEC24h后,流式细胞术检测HLEC的细胞凋亡率;DAPI免疫荧光染色观察HLEC的形态学改变;免疫组织化学检测HLEC的caspase-3蛋白表达情况。结果MTT比色法实验结果显示,随药物浓度增加和作用时间延长,HLEC生长抑制率增加(P<0.05)。CUR作用于HLEC24h后,流式细胞术检测表明,细胞凋亡率随药物浓度增加而明显增加(P<0.05);DAPI免疫荧光染色可见细胞核固缩、溶解碎裂、产生凋亡小体,而对照组细胞形态规则,细胞核呈现均匀的荧光染色;免疫组织化学可见,用药组caspase-3蛋白的表达随CUR浓度增加而增强(P<0.05)。结论CUR对HLEC有抑制增生和诱导凋亡作用,且呈明显的剂量-效应与时间-效应关系,可望成为后发性白内障的防治药物。     

逆转录病毒载体携带自杀基因对晶状体上皮细胞的抗增生作用

围绕后发性白内障防治的实验研究是当前眼科研究的热点之一。现代白内障术后，残留的晶状体上皮细胞向后囊表面增生和移行，在后发性白内障的发生过程中起着重要作用。基因疗法为疾病的治疗开辟了一条新途径，有着广阔的前景。本实验用逆转录病毒载体携带自杀基因(HSV-tk基因)导入晶状体上皮细胞，随后再给予丙氧鸟苷(ganciclovir，GCV)，观察其对晶状体上皮细胞的影响，以期为将来后发性白内障的基因治疗奠定基础。     

人及小鼠白内障晶状体上皮细胞凋亡的超微结构

目的 探讨人老年性白内障及小鼠先天性白内障与其晶状体上皮细胞凋亡的关系。方法 用透射电镜观察４例老年性白内障患者及２例先天性白内障小鼠晶状体上皮细胞凋亡的超微结构,并分别与同类正常晶状体上皮细胞超微结构进行比较。结果 老年性白内障患者及先天性白内障小鼠晶状体上皮细胞中均可见凋亡细胞,而正常晶状体未见凋亡细胞。结论 人老年性白内障及小鼠先天性白内障的发生均与其晶体上皮细胞的凋亡有关。     

核心蛋白多糖对兔晶状体上皮细胞增生的抑制作用

目的探讨核心蛋白多糖(Decorin)对兔晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LEC)增生的抑制作用及其剂量-效应与时间-效应的关系,为药物防治后发性白内障提供新的选择。方法 MTT比色法分别测定不同浓度的Decorin(0.1mg·L-1、1.0mg·L-1、10.0mg·L-1)作用于LEC不同时间后的细胞生长抑制率;采用流式细胞技术测定细胞周期,用ELISA法检测各组培养液上清中TGF-β的水平,RT-PCR测定TGF-βmRNA的表达,免疫细胞化学观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。结果 ELISA示每100万个细胞中对照组TGF-β含量为(427.24±41.34)ng,0.1mg·L-1、1.0mg·L-1和10.0mg·L-1Decorin组TGF-β的含量分别为(236.01±28.63)ng、(117.86±18.14)ng、(111.72±26.72)ng,与对照组比较差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。MTT比色法实验结果显示,作用24h对照组抑制率为(3.62±1.34)%,0.1mg·L-1、1.0mg·L-1和10.0mg·L-1Decorin组抑制率分别为(4.14±2.08)%、(12.93±2.47)%、(23.47±1.78)%,LEC生长抑制率增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);随着Decorin作用时间延长,生长抑制率增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。随药物浓度及作用时间延长,LEC出现明显的G0/G1期阻滞,G0/G1期细胞所占比例明显升高(P<0.05)。RT-PCR示Decorin组TGF-βmRNA表达明显减少,与MTT法检测结果呈现大致相同的趋势,免疫细胞化学观察,对照组α-SMA表达较多,细胞肥大,细胞质呈棕色,Decorin组α-SMA较少表达。Decorin表现出明显的抑制作用。结论 Decorin对LEC有抑制增生和诱导凋亡作用,且呈明显的剂量-效应与时间-效应关系,可望成为后发性白内障的防治药物。     

MicroRNA在氧化应激诱导晶状体上皮细胞凋亡中作用的初步研究

目的：观察H2 O2处理对晶状体上皮细胞HLE-B3miRNA表达谱的影响,初步明确miRNA在氧化损伤诱导晶状体细胞凋亡中的作用及机制。
　　方法：100μmol/L H2 O2处理HLE-B324h后,收集细胞用Trizol法提取总RNA。使用芯片检测miRNA的表达,并且qRT-PCR对芯片结果进行验证。运用生物信息学方法预测差异miRNA调控的靶基因。
　　结果：HLE-B3细胞经H2 O2处理后,28个miRNA表达发生明显变化(18个上调,10个下调)。差异miRNA可能通过调控BCL2 L2和MIP的表达,参与了晶状体细胞凋亡,进而导致了白内障的发生发展。
　　结论：氧化损伤能够明显改变晶状体上皮细胞的miRNA表达谱,此变化可能在白内障的发生发展中起调节作用。     

肝细胞生长因子对培养的人晶状体上皮细胞增生及移行作用的研究

目的研究肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对体外培养的人晶状体上皮细胞(hu-man lens epithelial cells,HLECs)增生及移行的作用。方法在无血清培养液培养的HLECs中分别加入不同浓度的HGF(2.5、5、10、20、40、50、100μg/L),MTT法测定促细胞增生的情况;流式细胞仪分析细胞周期;HLECs损伤愈合模型,观察不同浓度HGF(10、20、50μg/L)处理24h后HLECs的移行情况。结果HGF浓度处于10、20、40、50μg/L时对HLECs具有促增生作用(P<0.05或P<0.01),增生率分别为10.5%、30.2%、28.3%和11.1%;当浓度为20μg/L作用24h能达到最大促增生效果(P<0.01),增生率为29.6%;HGF通过促进细胞G0向G1的转化来促进细胞的增生;HGF可明显促进HLECs的移行,其移行能力分别为22.1%(10μg/L)、57.7%(20μg/L)和208.6%(50μg/L)。结论HGF可促进HLECs的增生和移行,是HLECs的有丝分裂原和强有力的促移行因子。     

短发夹状RNA干扰bcl-2后诱导人晶状体上皮细胞凋亡的实验研究

目的 应用RNA干扰技术抑制人品状体上皮细胞(HLEC)bcl-2基因表达,观察诱导其细胞凋亡情况,为防治晶状体后囊膜混浊提供新的策略.方法 实验研究.设计2条以bcl-2基因为靶标的短发夹RNA(shRNA),克隆入质粒PGCsi表达载体,分别命名为P1、P2,经脂质体转染入永生性HLEC系SRA01/04,48 h后检测转染效率和bd-2的基因及蛋白表达情况,并检测HLEC的细胞凋亡情况.多组间及组间计数资料的比较,采用随机区组设计的方差分析.结果 重组质粒经自动基因测序仪测序,证实构建成功.转染后48 h,流式细胞仪测得P1、P2转染率为44.1%、47.2%.免疫印迹法测得P1、P2组的bcl-2蛋白表达较对照组降低,实时荧光定量聚合酶链反应法测得P1、P2组的bcl-2 mRNA相对表达量为0.435、0.476,较对照组降低(F=1672.4,P<0.05),流式细胞仪双染法测得P1、P2组HLEC的细胞凋亡率分别为42.3%、45.4%,较对照组增加(F=1756.2,P<0.05),并且活化型caspase-3蛋白的表达增加.结论 P1、P2可抑制HLEC的bcl-2基因表达,并诱导HLEC凋亡.(中华眼科杂志,2009,45:636-640)     

紫外线诱导晶状体上皮细胞凋亡的实验研究

目的 探讨紫外线对体外培养的牛眼晶状体上皮细胞凋亡作用。方法 以TUNEL技术和DNA片段分析法研究紫外线照射牛晶状体后不同时间晶状体上皮细胞发生凋亡的情况。结果 经紫外线照射后,TUNEL法显示,照射组晶状体上皮细胞中有凋亡细胞,对照组晶状体上皮细胞中无明显的凋亡细胞;DNA片段分析发现照射组晶状体上皮细胞有DNA“梯状”图谱,而对照组晶状体上皮细胞未见DNA断裂现象。结论 紫外线可诱导牛晶状体上皮细胞发生凋亡。     

人原代晶体上皮细胞bFGF多肽和mRNA的表达

目的 为研究后发性白内障的发生机理,检测生长中人晶体上皮细胞（ＨＬＥＣｓ）自身是否表达碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）。方法 体外培养人晶体上皮细胞,用免疫细胞化学和原位核酸分子杂交的方法,检测ＨＬＥＣｓ中ｂＦＧＦ多肽和其ｍＲＮＡ的表达。结果 用免疫细胞化学和原位核酸分子杂交方法,可检测到生长中的人晶体上皮细胞自身表达碱性成纤维细胞生长因子。结论 结合碱性成纤维细胞生长因子促进人晶体上皮细胞生长     

Aquaporin-1 down regulation associated with inhibiting cell viability and inducing apoptosis of human lens epithelial cells

AIM: To investigate the role of Aquaporin-1 (AQP-1) in lens epithelial cells (LECs) and its potential target genes. AQP-1 is specifically expressed in LECs of eyes and is significant for lens homeostasis and transparency maintenance. Herein, AQP-1 expression in LECs was investigated to evaluate its influence on cell survival in association with its potential role in cataract formation. METHODS: LECs were transfected with lentivirus carrying AQP-1 small interfering RNA (siRNA). Real-time polymerase chain reaction (PCR) and Western blotting were conducted to detect AQP-1 expression in LECs from different groups. Meanwhile, cell counting kit-8 (CCK-8) assay and flow cytometry were performed to measure LEC proliferation and apoptosis, respectively. RESULTS: AQP-1 expression was significantly reduced in LECs, both at mRNA and protein levels (P<0.05), after siRNA treatment. Decreased cell viability was detected by CCK-8 assay in LECs with siRNA interference, compared to control cells (P<0.05). The apoptosis rate significantly increased in cells after siRNA interference (P<0.05). CONCLUSION: The decreased cell viability following AQP-1 down regulation is largely due to its induction of apoptosis of LECs. AQP-1 reduction might lead to changes of physiological functions in LECs, which might be associated with the occurrence and development of cataracts.     

维生素E琥珀酸酯对人晶状体上皮细胞增殖的影响

目的研究维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate,VES)对体外培养的人晶状体上皮细胞(HLECs)增殖的影响。方法人晶状体上皮细胞株HLECs-B3以VES刺激24h、48h、72h、96h,VES浓度为5μg/ml、10μg/ml和20μg/ml,用MTT比色法测定VES对细胞增殖的抑制作用;以流式细胞仪分析细胞周期。结果VES对人晶状体上皮细胞的增殖具有显著的抑制作用,表现为时间和剂量依赖关系。并且将细胞周期阻滞于G0/G1期。结论VES对体外培养的人晶状体上皮细胞的增殖具有抑制作用,为临床筛选防治后发性白内障的药物提供依据。     

晶状体前囊膜下上皮细胞增殖性病变的临床病理分析

目的：观察晶状体前囊膜下上皮细胞增殖的组织病理学变化,并探讨其发生原因。方法：取不同病因致手术摘除的伴晶状体前囊膜下上皮细胞增殖的眼球标本64例,其中眼外伤36例,绝对期青光眼10例,角巩膜葡萄肿6例,视网膜母细胞瘤5例,眼内炎4例,白内障手术后2例,糖尿病性白内障1例,在光镜下进行组织病理学观察研究。结果：增殖的晶状体前囊膜下上皮细胞形态不规则,排列不整齐、向后囊膜下延伸;囊膜破裂或部分缺如 前囊膜下纤维结缔组织化生,纤维组织形成;晶状体纤维崩解、液化和钙化,结论：眼内多种病状态,如眼外伤、眼内炎、青光眼,以及糖尿病等全身疾患均可命名晶状体前囊膜下上皮细胞增殖,导致晶状体发生病变,眼内炎和眼外伤后晶状体发生增殖的程度最重。     

硫醇转移酶(TTase)对紫外线诱导氧化损伤的人晶状体上皮细胞的保护作用

目的 探讨硫醇转移酶(thioltransferase,TTase)对紫外线诱导氧化损伤的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLEC)的保护作用.方法 将体外培养的HLEC随机分为4组.正常组:正常培养的HLEC;紫外线组:正常培养的HLEC+紫外线(波长302 nm、辐照强度55.56 μW·cm-2的紫外线照射15 min,辐照量共计500 J·m-2);TTase siRNA组:TTase siRNA转染的HLEC;TTase siRNA+紫外线组:TTase siRNA转染的HLEC+紫外线(照射参数同紫外线组).应用乳酸脱氢酶释放试剂盒检测细胞的增殖能力;测定TTase酶活性及Western blotting检测TTase蛋白表达;测量细胞内总GSH、GSH与GSSG含量,计算GSSG与总GSH的比值.结果 紫外线组较正常组细胞增殖能力下降21.0％ (P ＜0.05),TTase siRNA组较正常组细胞增殖能力下降17.0％ (P ＜0.05);TTase siRNA+紫外线组较正常组细胞增殖能力下降29.0％ (P ＜0.05).紫外线组TTase活性较正常组升高,约为正常组的2.1倍;siRNA组较正常组TTase活性下降,约为正常组的67.0％(P＜0.05);TTase siRNA+紫外线组较TTase siRNA组TTase活性增加,约为TTase siRNA组的1.3倍(P＜0.05).与正常组相比,紫外线组TTase相对表达量升高,约为正常组的3.9倍,TTase siRNA组的TTase相对表达量明显降低,约为正常组的35.0％(P＜0.05);而TTase siR-NA+紫外线组的TTase相对表达量较TTase siRNA组升高,约为TTase siRNA组的3.0倍(P＜0.05).相比于正常组,紫外线组、TTase siRNA组及TTase siRNA+紫外线组GSSG含量均上升,分别为正常组的2.3倍、1.4倍和3.7倍(均为P＜0.05);紫外线组、TTase siRNA组和TTase siRNA+紫外线组GSH含量较正常组下降,分别为正常组的68.4％、79.0％和61.7％(均为P＜0.05).紫外线组、Tlase siRNA组和TTase siRNA+紫外线组GSSG/总GSH比值均较正常组增加,分别为正常组的3.1倍、1.7倍和5.2倍(均为P＜0.05).结论 TTase对紫外线诱导氧化损伤的人晶状体上皮细胞均有重要的保护作用.     

羟基喜树碱对培养的兔晶状体上皮细胞的影响

目的 探讨羟基喜树碱（hydroxycamptothecine,HCPT)对兔晶状体上皮细胞（rabbit lens epithelial,RLECs)细胞周期的阻断作用和诱导细胞凋的作用,并研究其对Fas/FasL表达的影响。方法 使用流式细胞仪分析检测HCPT对RLECs细胞周期的阻断作用,以光镜和电子显微镜观察细胞形态的变化,应用末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法检测HCPT诱导的细胞凋亡情况,应用免疫组化方法检测HCPT对Fas/FasL表达的影响。结果 HCPT可将RLECs阻断于细胞周期的S期并诱导其凋亡;凋亡细胞具有典型的形态;脱氧尿苷三磷酸标记显示散在阳性细胞,且凋亡细胞的数量随HCPT药物浓度的增加而增多。HCPT对RLECs的Fas/FasL表达无明显影响。结论 HCPT不仅可阻断RLECs的分裂,而且可诱导细胞发生凋亡;Fas/FasL介导途径未参与HCPT诱发RLECs凋亡的过程。