重组胸腺素β4在干眼模型中对炎症反应的调节作用及对眼表修复的影响

背景 研究证实炎症与干眼的发生和发展相关,其中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)是重要的炎症因子.胸腺素β4 (Tβ4)具有促进上皮细胞迁移和抑制炎症反应的作用,但其对干眼眼表修复的影响及其机制尚未阐明. 目的 观察重组Tβ4对于眼模型鼠眼中TNF-α和IFN-γ表达的调控作用及其对眼表修复的影响.方法 选用清洁级雄性成年SD大鼠50只,用质量分数0.3％苯扎氯铵溶液连续点左眼7d以诱导干眼模型,以泪膜破裂时间(BUT)、角膜荧光素染色评分、Schirmer试验Ⅰ(SIt)结果评估造模情况.将造模成功的36只眼按随机数字表法分为模型对照组、重组人表皮生长因子(rhEGF)点眼组、Tβ4点眼组及PBS点眼组,按照分组分别用5μl Tβ4溶液(9μg/ml)、rhEGF滴眼液、无菌PBS点眼,每日3次,连续7d,大鼠右眼不进行任何干预作为正常对照组.各组大鼠均于点眼后7d行BUT、角膜上皮荧光素染色和SIt检查.点眼后7d以过量麻醉法处死动物,制备大鼠眼表组织切片,采用苏木精-伊红染色法观察各组大鼠角膜和结膜组织形态学变化;采用过碘酸希夫染色法计数结膜组织中杯状细胞的数目;透射电子显微镜下观察大鼠角膜和结膜细胞超微结构改变;分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测大鼠结膜组织中TNF-α mRNA和IFN-γ mRNA及其蛋白的表达. 结果 正常对照组、模型对照组、rhEGF点眼组、Tβ4点眼组和PBS点眼组大鼠BUT分别为(10.42±0.66)、(7.46±0.49)、(8.71±0.50)、(9.59±0.35)和(8.63±0.68)s,总体比较差异有统计学意义(F=5.65,P=0.00),其中模型对照组大鼠BUT明显短于正常对照组,rhEGF点眼组和Tβ4点眼组大鼠BUT明显较模型对照组大鼠延长,差异均有统计学意义(均P＜0.05).各组间大鼠SIt和角膜荧光素染色评分的总体比较差异均无统计学意义(F=0.42,P=0.79;F=136.77,P=0.00).苏木精-伊红染色显示,模型对照组大鼠角膜、结膜上皮缺损,角膜基质层水肿;rhEGF点眼组和Tβ4点眼组大鼠角膜、结膜上皮细胞形态不规则,呈过度增生状.各组大鼠结膜组织中杯状细胞数量的总体比较差异有统计学意义(F=3.16,P=0.04),其中模型对照组和rhEGF点眼组大鼠结膜组织中杯状细胞数量均明显低于正常对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05),而Tβ4点眼组大鼠结膜杯状细胞数量与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).透射电子显微镜下观察可见,模型对照组大鼠角膜、结膜上皮细胞的微绒毛和微皱襞肿胀、融合、卷曲、断裂和脱落,Tβ4点眼组角膜、结膜上皮细胞微绒毛呈增生修复状态.各组大鼠结膜组织中TNF-α mRNA和IFN-γ mRNA相对表达量总体比较差异均有统计学意义(F=43.08、371.69,均P=0.00),各组大鼠结膜组织中TNF-α和IFN-γ蛋白表达量总体比较,差异均有统计学意义(F=34.27、43.52,均P=0.00),其中模型对照组大鼠结膜组织中TNF-α mRNA和IFN-γ mRNA及其蛋白的表达量均明显高于正常对照组,而Tβ4点眼组上述因子的表达量均明显低于模型对照组和rhEGF点眼组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 Tβ4局部点眼可通过下调干眼大鼠结膜组织中TNF-α和IFN-γ的表达而增加泪膜的稳定性,促进眼表损伤的修复.     

黏着斑激酶在肿瘤坏死因子α上调人角膜上皮细胞明胶酶活性中的作用

目的 探讨黏着斑激酶(FAK)在肿瘤坏死因子α(TNF-α)上调体外培养人角膜上皮细胞明胶酶活性中的作用.方法 实验研究.体外培养无眼部疾患人角膜上皮细胞,将传至3～4代的细胞暴露于含1 μg/L TNF-α(B组)、10 μg/L TNF-α(C组)、100 μg/L TNF-α(D组)的培养基中,对照组(A组)用含等量磷酸盐缓冲液(PBS)的培养基处理,明胶酶谱分析各组条件培养基中基质金属蛋白酶2和9( MMP-2、MMP-9)的活性,免疫印迹法分析FAK总蛋白表达及磷酸化FAK的表达;运用RNA干扰技术特异性抑制人角膜上皮细胞FAK的表达并重复以上过程.统计学方法使用单因素方差分析,各组间比较采用Tukey HSD检验.结果 明胶酶谱分析:与A相比,B、C、D组MMP-2、MMP-9活性均明显上调,差异有统计学意义(A、B、C、D组MMP-2活性表达分别为:124.06 ±4.06、146.72±5.51、241.18±5.65、389.95±4.44,F=2960.91,P=0.000;MMP-9活性表达分别为:122.78±5.86、165.70±7.90、479.49±6.22、495.88±5.03,F=4937.46,P=0.000),各组间比较差异均有统计学意义(MMP-2各组间比较均为P=0.000;MMP-9各组间比较P=0.000);免疫印迹分析:C、D组中磷酸化FAK较A组增加,差异有统计学意义(C、D组磷酸化FAK分别为:0.52±0.03、0.61 ±0.06;F=431.03,P=0.000),100 μ.g/L TNF-α组较10 μg/L TNF-α组中磷酸化FAK表达增加(P=0.005);运用RNA干扰技术特异性抑制人角膜上皮细胞FAK表达后,FAK总蛋白较特异性抑制之前明显下调,B、C、D组MMP-2的活性差异无统计学意义(转染后A、B、C、D组MMP-2分别为:55.13±0.66、55.67±0.43、55.49±0.20、55.91±0.37;F=2.73,P=0.079).10、100μg/L TNF-α干预组中MMP-9少量增加(转染后A、B、C、D组MMP-9分别为:80.48±0.39,81.26±0.62,84.43±0.47,85.56±0.61;F=105.80,P=0.000)但增加幅度较转染前明显减小,D组较C组MMP-9活性增强,差异有统计学意义(P=0.019).仅在100 μg/L TNF-α干预组中检测到FAK磷酸化(0.47±0.05),但表达量较抑制前明显减少(t=5.03,P=0.001).结论 FAK信号在TNF-α上调入角膜上皮细胞明胶酶活性过程中发挥一定作用,针对这一过程干预可能对防治角膜病变有意义.     

金黄色葡萄球菌培养上清液对中性粒细胞及RPE细胞炎性相关因子表达的影响

目的 观察金黄色葡萄球菌培养上清液对中性粒细胞及视网膜色素上皮细胞(RPE)炎性相关因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平的变化.方法 实验研究.分离入外周血中性粒细胞,与人RPE细胞株D407共培养,加入无菌体的金黄色葡萄球菌ATCC29213培养上清液.其中细菌上清液分为50μl、100μl、250μl、500μl以及空白组、脑心浸萃液态培养基对照组6组;中性粒细胞数量分为空白组、1 ×104、5 ×104、5×105,4组.在6、12、24、48、72 h等时间点搜集培养液上清,应用酶联免疫吸附试验检测培养液中IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平的变化.结果 当不同剂量金黄色葡萄球菌上清液单独作用RPE细胞时,培养液中IL-1β水平随着细菌上清液剂量增加而上升、亦随着作用时间的延长而增加;但IL-6水平500μl组高于空白组,仅在24h[(23.17±3.16)ng/L;(7.61±1.53) ng/L]及48 h[ (35.00 ±4.37) ng/L;(13.17±3.27)ng/L]时差异具有统计学意义(P =0.001;P =0.026).RPE细胞在100μl细菌上清液作用下,加入不同数量中性粒细胞共培养,5×105组培养液中IL-1β水平在6 h[ (236.62±8.20) ng/L]及12 h[ (447.42±35.13)ng/L]均高于其余各组,差异具有统计学意义(6 h:P =0.000,P=0.000,P=0.002;12 h:P =0.000,P=0.000,P=0.000);培养液中IL-6的水平在12 h时5×105组[( 46.96±2.72) ng/L]亦高于其余各组,差异具有统计学意义(P =0.000,P=0.000,P=0.000).在各时间点培养液中均检测不到明显的TNF-α表达.结论 中性粒细胞及RPE细胞共培养体系在金黄色葡萄球菌上清液的刺激下可检测到IL-1β和IL-6表达;其中IL-1β表达在早期出现,且高水平状态维持较长.金黄色葡萄球菌的毒力因子含量及中性粒细胞数量对引发IL-1β和IL-6的高表达起重要作用.     

基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在结膜松弛症成纤维细胞中的表达

目的探讨基质金属蛋白酶1、3（MMP．1、MMP．3）及其组织抑制因子1、3（TIMP-1、TIMP．3）在结膜松弛症（CCh）成纤维细胞培养上清液中的表达,揭示四者表达水平变化与CCh的内在联系。方法体外原代培养CCh成纤维细胞,取第3—6代细胞,以2．5×10^5个／mL浓度接种于24孔板中培养,24h后提取细胞上清液,采用ELISA检测MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3的表达水平。不同组间比较采用单因素方差分析。结果MMP-1的表达：CCh组成纤维细胞的蛋白浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。MMP-3的表达：CCh组成纤维细胞的蛋白浓度明显高于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0．01）。TIMP．1的表达：CCh组成纤维细胞的蛋白浓度与正常对照组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。TIMP-3的表达：CCh组成纤维细胞的蛋白浓度明显低于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论成纤维细胞MMP．1／TIMP-1及MMP-3／TIMP-3的表达失衡可能参与了CCh的发生、发展。     

白细胞介素-1α对猪小梁细胞基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶抑制剂表达的影响

背景房水外流通路的阻塞或小梁网细胞外基质（ECM）的异常堆积导致房水流畅系数降低是引起眼压升高的原因之一,基质金属蛋白酶（MMPs）和组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）的平衡对ECM的代谢至关重要,白细胞介素-1α（IL-1α）可以通过调节MMPs的表达而调节房水的外流。目的研究猪重组IL-1α对体外培养的猪眼小梁细胞MMP-2、MMP-3及TIMP-1表达的影响。方法从猪眼取出带有小梁组织的巩膜,用组织块培养法培养小梁细胞并进行传代,第3代的猪小梁细胞应用纤维连接蛋白（FN）和层黏连蛋白（LM）进行鉴定。第3代小梁细胞血清饥饿培养24h后分为2组,对照组加入无血清培养基,IL组加入10m／L IL-1α,分别培养30min。采用细胞免疫化学法分析IL组MMP-2、MMP-3及TIMP-1蛋白在培养小梁细胞中的表达;采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测小梁细胞中MMP-2mRNA、MMP-3mRNA及TIMP-1 mRNA的表达,并与对照组的检测结果进行比较。结果传3代的细胞对FN和LM呈现阳性反应。与对照组比较,IL组小梁细胞中MMP-3和TIMP-1蛋白的表达量（A值）明显升高,差异均有统计学意义（t=-7．694、t=-5．199,P〈0．05）,但2组间小梁细胞中MMP-2表达的差异无统计学意义（t=-2．365,P〉0．05）。IL组小梁细胞中MMP-3mRNA和TIMP-1mRNA的表达量（A值）明显高于对照组,差异均有统计学意义（t=-3．025、t=-1．921,P〈0．05）,而2组间小梁细胞中MMP-2mRNA的表达差异无统计学意义（t=-1．173,P〉0．05）。结论外源性IL-1α能增加猪眼小梁细胞中MMP-3、TIMP-1的表达,引起MMP-3／TIMP-1平衡改变,促进小梁网ECM的分解,增加房水外流,而对MMP-2的表达无影响。     

炎性细胞因子对色素上皮细胞衍生因子表达的影响

目的 观察肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素（IL）-6、IL-8等炎性细胞因子对视网膜色素上皮细胞衍生因子（PEDF）表达的影响。方法 原代培养人视网膜色素上皮 (RPE）细胞，取3～5代细胞分别以浓度为20.00、2.00 、0.20 、0.02 ng/ml的TNF-α、IL-6、IL-8干预6、12、24、48 h，蛋白免疫印迹方法检测培养液中PEDF蛋白质的表达水平。 结果 TNF-α、IL-6、IL-8对人RPE细胞PEDF的分泌均有抑制作用，并且其抑制作用随着3种炎性细胞因子浓度的增加和作用时间的延长而增强；在浓度0.02 ng/ml、作用时间6 h（F=7.14，P＜0.05)，浓度2.00ng/ml、作用时间48 h（F=14.05，P＜0.01)，浓度20.00ng/ml、作用时间24 h（F=11.53，P＜0.01) 3种作用条件下,对PEDF分泌抑制作用的差异具有统计学意义，其中TNF-α干预组PEDF的表达量最低，对人RPE细胞PEDF的分泌抑制作用最明显（F＝14,P＜0.01）。结论 TNF-α、IL-6、IL-8能够下调体外培养的人RPE细胞PEDF蛋白质的表达。     

龙胆泻肝汤对葡萄膜炎大鼠关键炎症细胞因子表达的影响

目的 探讨龙胆泻肝汤对实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠关键炎症细胞因子表达的影响.方法 Lewis大鼠随机分为对照组(6只)、EAU组(18只)和LXT组(18只).光感受器间维生素A结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein,IRBP)免疫EAU组和LXT组大鼠,对照组大鼠注射等量不含IRBP的乳化液.使用实时荧光定量PCR及ELISA方法检测血液、淋巴结和脾脏中IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-10细胞因子在EAU大鼠体内治疗前后的变化情况.结果 LXT组大鼠全血中IFN-γ mRNA表达在第8天虽然高于对照组(P=0.000),但已显著低于EAU组(P=0.000);LXT组IL-17 mRNA在第12天达峰值,显著低于EAU组(P=0.000),且均显著高于对照组(P=0.000);TNF-α mRNA仅在第12天显著高于对照组(P=0.000),但低于EAU组(p=0.000);IL-10 mRNA表达在第16天高于EAU组(P =0.042).LXT组大鼠淋巴结和脾脏中IFN-y、IL-17和TNF-α mRNA表达在第12天显著低于EAU组(均为P =0.000);LXT组淋巴结中IL-10 mRNA表达在第8天开始显著高于对照组(P=0.001),且在整个炎症期均维持在较高水平;LXT组脾脏IL-10 mRNA表达在第12天达峰值,且高于对照组和EAU组(均为P=0.000).LXT组大鼠血清中IFN-y、IL-17和TNF-α蛋白表达水平在第12天和第16天均低于EAU组(均为P＜0.05);EAU组和LXT组血清中IL-10蛋白表达在第12天均高于对照组(均为P ＜0.05),第16天达峰值,但LXT组IL-10蛋白含量更高.结论 龙胆泻肝汤通过抑制IFN-γ、IL-17和TNF-oα相关炎症因子的表达发挥其抗炎作用,促进IL-10的表达,加速自身免疫炎症的恢复.龙胆泻肝汤可通过多种途径在EAU的治疗中发挥免疫调节作用.     

增生性玻璃体视网膜病变增生膜内炎性细胞因子mRNA表达

目的 检测炎前因子mRNA在增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)中的表达情况，证实其在PVR发病中的作用。 方法 收集14例不同分级的PVR患者玻璃体切割术中所取出的增生膜，石蜡包埋切片，用生物素标记的寡核苷酸探针进行原位杂交，检测IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的表达，两例角膜移植后的供体眼作为正常对照。 结果 共有5例样本有阳性表达。3例增生膜中IL-1βmRNA表达，3例表达了IL-6 mRNA，1例表达了IL-8 mRNA，3例表达TNF-αmRNA。其中1例既表达了IL-1β又表达了IL-6 mRNA，1例IL-1β、IL-8和TNF-αmRNA三者均表达，2例有IL-6和TNF-αmRNA两者表达。正常视网膜未检测到炎前因子mRNA的表达。 结论 IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α参予了PVR增生膜的形成过程。 (中华眼底病杂志, 2002, 18: 286-288)     

地塞米松对脂多糖诱导人视网膜色素上皮细胞炎症损伤及NLRP3/Caspase-1通路的影响

目的　探究地塞米松（Dex）对脂多糖（LPS）诱导人视网膜色素上皮（HRPE）细胞炎症损伤及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）通路的影响。方法　体外培养ARPE-19细胞株,MMT法检测不同浓度Dex处理细胞24 h、48 h、74 h对LPS诱导ARPE-19细胞存活率的影响,确定Dex最佳处理浓度和时间。ARPE细胞随机分为:正常对照组（NC组）、LPS组（5 mg·L^-1 LPS）、Dex组（0.20 mol·L^-1 Dex）、Dex+LPS组（0.20 mol·L^-1 Dex+5 mg·L^-1 LPS）,RT-qPCR检测各组细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达量,ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平,Western blot检测NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平。结果　同一时间点,与NC组比较,LPS组ARPE-19细胞存活率均显著降低（均为P<0.05）,且随着Dex浓度增加,细胞存活率呈先升高后下降的趋势;0.20 mol·L^-1 Dex作用LPS诱导的ARPE-19细胞24 h时细胞存活率为(90.77±5.73)%,接近NC组,因此选用0.20 mol·L^-1Dex作用24 h用于后续实验。NC组与Dex组间TNF-α、IL-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达量差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。与NC组、Dex组比较,LPS组、Dex+LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6、 NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著升高,且Dex+LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6 、NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著低于LPS组（均为P<0.05）。结论　Dex可能通过抑制NLRP3/Caspase-1通路减轻LPS诱导的HRPE炎症损伤。     

RNA干扰对兔角膜基质细胞环氧化酶2与基质金属蛋白酶2表达的抑制作用研究

目的 探讨针对环氧化酶2(COX-2)的RNA干扰(RNAi)对兔角膜基质细胞中COX-2与基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响.方法 实验研究.体外培养兔角膜基质细胞,测定阳离子脂质体介导的小干扰RNA(siRNA)在兔角膜基质细胞中的转染率,设计并合成3条针对兔COX-2基因的短发卡RNA(shRNA)1、2、3和1条阴性对照shRNA,利用阳离子脂质体介导转染正常与IL-lα刺激后的兔角膜基质细胞,在IL-lα刺激后6、12、24、48、72 h收集细胞,实时荧光定量聚合酶链反应检测兔角膜基质细胞中COX-2和MMP-2基因的表达变化,并与对照组进行比较.同一时间点各组间比较采用单因素方差分析,处理组两两比较采用q检验.结果 阳离子脂质体能够有效介导siRNA转染体外培养的兔角膜基质细胞,转染率可达70%～80%.IL-lα刺激后兔角膜基质细胞中COX-2与MMP-2 mRNA的表达较空白对照组显著升高;在不同时间点,生物合成的3条针对COX-2的靶向shRNA中shRNA-2能显著抑制IL-α刺激后的兔角膜基质细胞中COX-2、MMP-2 mRNA表达,抑制率最高可分别达83.04%、73.69%,与单纯IL-lα刺激组相比差异均有统计学意义(q=24.03,P=0.00;q=14.76,P=0.00);而shRNA-1、shRNA-3、阴性对照shRNA转染组与单纯IL-lα刺激组相比,COX-2 mRNA的表达差异无统计学意义(F=0.02,P=0.99),MMP-2 mRNA的表达差异也无统计学意义(F=0.02,P=0.98).结论 针对COX-2的RNAi能够有效抑制IL-lα诱导后的兔角膜基质细胞中COX-2与MMP-2的表达.     

PDGF对人RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响

背景研究表明血小板源性生长因子（PDGF）能调节多种细胞中基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶组织抑制剂（MMP／TIMP）的表达和平衡,但视网膜色素上皮（RPE）细胞中MMP／TIMP的表达与PDGF作用剂量和作用时间的关系尚不明确。目的观察PDGF对RPE细胞中MIP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响。方法体外培养人RPE细胞系ARPE-19,将达到70％～80％融合的细胞分为5个组。分别将0、0．1、1、10、50mg／LPDGF加入RPE细胞培养基作用36h,分别采用逆转录PCR（RT—RCR）法和Western blot法检测各组RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及其蛋白的表达。PDGF组采用10mg／LPDGF组PDGF分别刺激RPE细胞24、36和48h,对照组用不含PDGF的培养液培养,采用逆转录PCR（RT—RCR法和Western blot法分别检测RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白的表达。结果随着PDGF质量浓度的增加和刺激时间的延长,RPE细胞生长速度加快,细胞增生明显。PDGF刺激RPE细胞36h,随着PDGF质量浓度的增加,MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA在RPE细胞中表达相对值逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F=79．304,P=0．000;MMP-9 mRNA：F=8．465,P=0．003）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值随着PDGF质量浓度的增加而逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2：F=26．550,P=0．000;MMP-9：F=80．993,P=0．000）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。各质量浓度PDGF组RPE细胞中TIMP-1 mRNA和蛋白表达相对值差异均无统计学意义（F=0．143,P=0．962;F=1．955,P=0．178）。随着10mg／L PDGF刺激RPE细胞时间的延长,RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达逐渐增加,差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F时间=83．250,P=0．002;MMP-9 mRNA：F时间=6．785,P=0．019）;各时间点RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显增加,差异均有统计学意义（MMP-2：F时间=11．185,P=0．041;MMP-9：F时间=968．413,P=0．000）。PDGF作用不同时间点对照组与PDGF组间MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白在RPE细胞中的表达差异均有统计学意义（分组：均P=0．000,时间点：P〈0．05）,而各时间点2个组间RPE细胞中TIMP-1表达相对值的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论PDGF上调PRE细胞中MMP-2和MMP-9的表达,其作用呈剂量和时间依赖性,但对PRE细胞中TIMP-1的表达无明显影响。PDGF导致RPE细胞中MMP／TIMP的平衡失调,从而导致细胞外基质的破坏,促进RPE细胞的迁移。     

IL-1β和TNF-α对体外培养的人RPE细胞FasL蛋白及mRNA表达的影响

目的：观察IL-1β和TNF-α对培养的人RPE细胞FasL蛋白、mRNA表达的影响.方法：流式细胞仪检测暴露于IL-1β和/或TNF-α的RPE细胞FasL的表达,并用mRNA斑点杂交分析mRNA的改变.结果：流式细胞仪显示23.4%培养的RPE细胞表达FasL.IL-1β,TNF-α和二者联合应用后FasL阳性率则分别为25.7%,9.7%和17.2%.mRNA斑点杂交亦证实TNF-α下调FasLmRNA的表达.结论：TNF-α可下调体外培养的人RPE细胞FasL蛋白,mRNA的表达.     

基质金属蛋白-9抑制剂阻断视网膜色素上皮细胞表面CD73脱落防治实验性自身免疫性葡萄膜炎的初步研究

目的:初步探讨MMP-9抑制剂阻断RPE细胞表面CD73脱落,防治实验性自身免疫葡萄膜炎(EAU)的机制。方法:体外培养分离自野生型C57BL/6小鼠及CD73基因敲除(CD73-/-)小鼠的RPE细胞,以脂多糖及TNF-α共同干预,诱导RPE表面CD73脱落。依据是否同时加入MMP-9抑制剂CTK8G1150(终浓度5.0μmol/L),将两种小鼠培养的RPE细胞分别设为MMP-9抑制剂干预组及无干预对照组。每组细胞给予溶媒、1μmol/L单磷酸腺苷(AMP)、1μmol/L AMP及3μmol/L 5'-α,β-亚甲基-二磷酸腺苷(APCP)(AMP+APCP)进行干预。氚化胸苷掺入法检测不同组别RPE细胞对CD4+T细胞增生的刺激作用。分别以野生型B6小鼠及CD73-/-小鼠为受体,过继免疫诱发EAU。受体小鼠分别随机分为MMP-9抑制剂干预组及未干预对照组,于过继免疫后4、7、10 d视网膜下腔分别注射CTK8G1150或溶媒。实时定量PCR(RT-PCR)、Western blot法检测受体小鼠RPE细胞中CD73 mRNA及蛋白表达。组间比较采用单因素方差分析。结果:刺激方式为AMP时,C57BL/6 MMP-9抑制剂干预组CD4+T细胞的增生能力较无干预组显著下降,差异有统计学意义(F=13.28,P<0.01);溶媒、AMP+APCP时,两组CD4+T细胞增生能力比较,差异无统计学意义(F=7.78、6.58,P>0.05)。CD73-/-MMP-9抑制剂干预组、无干预组不同刺激方式CD4+T细胞增生能力比较,差异均无统计学意义(F=5.24、6.12、7.04,P>0.05)。RT-PCR检测结果显示,B6受体小鼠MMP-9抑制剂组、无干预对照组RPE细胞中CD73 mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(F=6.54,P>0.05)。Western blot检测结果显示,B6受体小鼠MMP-9抑制剂组RPE细胞中CD73蛋白表达较未干预对照组显著增加,差异有统计学意义(F=15.24,P<0.01)。结论:MMP-9抑制剂阻断RPE细胞表面CD73的脱落对EAU具有保护作用。     

NF-κB活性对TNF-α调节小梁细胞表达MMP-3和MMP-9的影响

目的探讨核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是否参与肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）调节人眼小梁细胞（human trabecular cells，HTCs）表达基质金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinases-3，MMP-3）和基质 金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinases-9，MMP-9）的过程。方法采用RT-PCR法和酶谱分析法（zymography）检测体外培养的人眼小梁细胞经0ng／ml（对照组）、lng／ml、10ng／ml、25ng/ml TNF-α处理24h后，细胞表达MMP-3、MMP-9的量；运用NF-κB的特异抑制剂二硫氨基甲酸吡啶（pyrrolidine dithocarba-mate，PDTC）抑制NF-κB的活化，观察TNF-α对体外培养的HTCsMMP-3，MMP-9表达影响的改变。结果运用RT-PCR法和酶谱分析法研究均发现经浓度为1ng／ml、10ng／ml、25ng／ml的TNF-α处理的细胞在mRNA和上清液中活性蛋白水平均能增加MMP-3、MMP-9的表达，各组mRNA／β-actin吸光度比值和条带酶解量与对照组相比差异均有显著性（P〈0．05）。提前30min加入PDTC，MMP-3、MMP-9的表达量分别较未加入PDTC组表达量明显减少．差异有显著性（P〈0．05）。结论TNF-α可上调MMP-3及MMP-9的表达。PDTC能够下调TNF-α对小梁细胞MMP-3及MMP-9的表达，因此推测NF-κB可能参与MMP-3和MMP-9转录的启动．     

白内障摘除手术方式对兔眼房水中TNF-α、IL-1β、IL-6的影响

目的探讨不同白内障手术方式对兔眼房水中TNF-α、IL-1β和IL-6含量影响。方法 18只日本大耳白兔均分3组,I组空白对照组;II组超声乳化摘除术组;Ⅲ组超声乳化联合前段玻璃体切割术组。分别于术前,术后1、3、7、14、28 d对术眼进行临床检查,并抽取房水于-30℃中保存。用酶联免疫吸附试验对术后兔房水中的TNF-、IL-1β和IL-6含量进行测定。结果Ⅲ组后囊混浊程度较II组轻;兔房水TNF-α、IL-1β和IL-6含量于术后3、7、14 d和28 d明显升高,术后7～14 d达最高值;Ⅲ组房水中TNF-α、IL-1β和IL-6含量较II组的稍低,具有统计学意义。结论超声乳化联合前段玻璃体切割术治疗后发性白内障的效果优于单纯的超声乳化摘除术,在一定程度阻止后发障的发生。超声乳化联合前段玻璃体切割术后的TNF-α、IL-1β和IL-6的含量较单纯的超声乳化摘除术的低,TNF-α、IL-1β和IL-6可能参与后发性白内障的形成。     

叔丁基对苯二酚对2型糖尿病大鼠视网膜细胞的保护作用及其机制

背景 细胞凋亡是糖尿病视网膜病变(DR)中的重要机制之一,氧化应激、高糖等可启动细胞凋亡通路,从而造成细胞损伤.叔丁基对苯二酚(tBHQ)是一种抗氧化应激药物,但其在DR的发生和发展过程中是否发挥视网膜细胞的保护作用尚不明确. 目的 观察tBHQ对2型糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子(VEGF)及Bcl-2表达的影响,探讨tBHQ通过核因子-E2相关因子2/抗氧化反应元件(Nrf2/ARE)信号通路对2型糖尿病大鼠视网膜可能的保护机制.方法 选取50只清洁级健康雄性SD大鼠.应用随机数字表法随机选取其中10只大鼠为正常对照组,以正常饲料喂养;其余40只大鼠采用高脂高糖饲料喂养4周后空腹12h,然后大鼠腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)诱导2型糖尿病模型.造模成功大鼠均衡分组,模型对照组大鼠继续给予高脂高糖饮食,tBHQ干预组大鼠于造模后1周在高脂高糖饲料中添加质量分数1％ tBHQ进行干预,各组大鼠分别于造模后4周和12周收集大鼠心脏全血,检测各组大鼠空腹血糖(FPG),血浆总胆固醇(TC)、总三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量;采用放射免疫分析法检测各组大鼠空腹血清胰岛素(FINs)含量.采用免疫组织化学法检测各组大鼠视网膜中VEGF、bcl-2蛋白的表达分布;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法定量检测各组大鼠视网膜中Bcl-2 mRNA和VEGF mRNA的相对表达量. 结果 35只大鼠成功建立2型糖尿病模型.各组大鼠造模后不同时间点FINs含量总体比较差异均有统计学意义(F分组=22.480,P=0.000;F时间=7.636,P=0.008).各组间大鼠血浆FPG、TC、TG和LDL-C含量总体比较差异均有统计学意义(FPG:F分组=78.531,P=0.000;TC:F分组=28.049,P=0.000;TG:F分组=13.108,P=0.000;LDL-C:F分组=6.804,P＜0.05).免疫组织化学检测显示,Bcl-2和VEGF蛋白主要表达于视网膜各层的血管、视网膜神经节细胞(RGCs)层、内核层和外核层.各组间大鼠视网膜中VEGF和bcl-2蛋白的相对表达量总体比较差异均有统计学意义(VEGF:F分组=11.805,P=0.000;bcl-2:F分组=22.943,P=0.000);tBHQ干预组大鼠造模后12周视网膜中bcl-2蛋白的相对表达量明显高于造模后4周,差异有统计学意义(P＜0.05).各组大鼠造模后不同时间点视网膜中VEGF和Bcl-2 mRNA相对表达量总体比较差异均有统计学意义(VEGF:F分组=79.220,P=0.000;F时间=6.090,P＜0.05;Bcl-2:F分组=105.000,P=0.000;F时间=13.170,P=0.001).其中造模后4周和12周模型对照组和tBHQ干预组大鼠视网膜中VEGF和Bcl-2 mRNA相对表达量明显高于正常对照组,tBHQ干预组大鼠视网膜中Bcl-2 mRNA相对表达量明显高于模型对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.05);tBHQ干预组大鼠造模后12周视网膜中VEGF和Bcl-2 mRNA相对表达量明显高于造模后4周,差异均统计学意义(均P＜0.05). 结论 tBHQ可通过下调视网膜中VEGF的表达和上调bcl-2的表达对DR发挥抗氧化损伤和抗凋亡作用.此外,tBHQ对糖尿病大鼠可能有降血糖、调节胰岛素、降血脂的作用.     

基质金属蛋白酶-1及其抑制剂和转化生长因子-β1在糖尿病结膜松弛症结膜组织中的表达

目的测定基质金属蛋白酶-1（MMP-1）及其抑制剂（TIMP-1）和转化生长因子-β1（TGF-β1）在糖尿病结膜松弛症患者结膜中的表达,探讨其在糖尿病结膜松弛症发生过程中的作用机制。方法按照张兴儒眼结膜松弛症临床分级标准和1999年WTO糖尿病诊断标准,经手术共收集待检结膜标本36份,其中包括糖尿病结膜松弛症6例9眼（糖尿病结膜松弛症组）、单纯结膜松弛症5例9眼（单纯结膜松弛症组）、糖尿病不伴结膜松弛症9例9眼（糖尿病组）和行白内障囊外摘出术（ECCE）手术的正常对照9例9眼（正常结膜组）。采用免疫组织化学SP法检测并比较各组结膜组织中MMP-1、TIMP-1和TGF-β1的表达。结果 MMP-1在糖尿病结膜松弛症和单纯结膜松弛症组患者结膜中阳性表达的平均吸光度（A）值分别为0.2732±0.0285和0.2599±0.0229,明显高于糖尿病组和正常结膜组的0.1872±0.0138和0.1485±0.0079,差异均有统计学意义（P〈0.05）;TIMP-1的表达在各组间差异无统计学意义（F=2.470,P=0.079）。TGF-β1在糖尿病结膜松弛症组患者结膜中的阳性表达高于单纯结膜松弛症组、糖尿病组和正常结膜组（0.2065±0.0331vs0.1866±0.0129;0.2065±0.0331vs0.1773±0.0153;0.2065±0.0331vs0.1632±0.0155）,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 MMP-1和TIMP-1表达失衡在糖尿病结膜松弛症的发生发展过程中起重要作用,此过程不受TGF-β1的调控。     

低浓度氯喹保护成年小鼠视网膜神经节细胞抵抗N-甲基-D-天冬氨酸的兴奋性毒性作用

目的:观察不同浓度氯喹对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)损伤模型小鼠RGC的保护作用及可能调控机制。方法:健康雄性C57/BL6小鼠54只,随机分为氯喹低浓度组、氯喹高浓度组、PBS对照组,每组均为18只。氯喹低浓度组、氯喹高浓度组小鼠分别按体重10、100 mg/kg剂量腹腔注射氯喹;PBS组小鼠腹腔注射等体积PBS。腹腔注射1次/d,连续2d后,氯喹低浓度组、氯喹高浓度组小鼠左眼玻璃体腔注射5 nmol/L NMDA,对侧眼注射等体积PBS。建模后7d,视网膜铺片RGC染色,计数RGC存活数目;建模后9、10d,分别行视动反应和ERG检查;建模后11 d,行视网膜免疫荧光染色检测各组小鼠视网膜胶质纤维酸性蛋白(GFAP)荧光表达和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各组小鼠视网膜GFAP、TNF-α、IL-6 mRNA表达。各组间RGC密度、视敏度、光负性反应(PhNR)波振幅比较采用单因素方差分析。结果:建模后7d,与PBS对照组小鼠RGC密度比较,氯喹低浓度组显著升高,差异有统计学意义(F=54.41,P<0.01);氯喹高浓度组降低,但差异无统计学意义(F=1.18,P>0.05)。氯喹低浓度组小鼠视敏度、PhNR波振幅均高于PBS对照组,差异有统计学意义(F=9.10、17.60,P<0.05、<0.01)。氯喹低浓度组小鼠视网膜GFAP绿色荧光表达明显少于PBS对照组、氯喹高浓度组,差异有统计学意义(F=23.66,P<0.05)。低浓度氯喹组小鼠视网膜GFAP(F=110.20)、IL-6(F=167.60)、TNF-α(F=17.78)mRNA表达较高浓度氯喹组、PBS对照组显著下降,差异有统计学意义(P<0.010、<0.001、<0.010)。结论:低浓度氯喹对NMDA损伤所致RGC丢失有保护作用,其作用机制可能与抑制胶质细胞活化与炎症反应有关;高浓度氯喹会加重RGC凋亡。     

IGF-1对人RPE细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelial,RPE)细胞缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法 取体外培养的第3-5代人RPE细胞,经不含IGF-1、含10.00μg.L-1、50.00μg.L-1、100.00μg.L-1IGF-1的无血清培养液处理24h后,通过RT-PCR分别检测HIF-1αmRNA和VEGF mRNA的相对表达量,用Western-blotting分别检测HIF-1α蛋白和VEGF蛋白的相对表达量。结果 对照组、10.00μg.L-1、50.00μg.L-1及100.00μg.L-1IGF-1组人RPE细胞中HIF-1αmRNA相对表达量分别为:1.44±0.18、1.48±0.17、1.51±0.18、1.53±0.21,4组比较差异无统计学意义(F=0.320,P=0.811);而4组HIF-1α蛋白的相对表达量分别为0、678.17±101.49、1175.35±149.71、1467.77±262.76,4组比较差异有显著统计学意义(F=113.550,P=0.000),并随IGF-1浓度的增加,相对表达量增高,各组间比较差异均有统计学意义(均为P<0.05);4组VEGF165mRNA及VEGF165蛋白的表达量比较,差异均有显著统计学意义(F=55.096,P=0.000;F=30.269,P=0.000),各组VEGF165mRNA及蛋白水平随IGF-1浓度的增加而增高,各组间比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 IGF-1能促进人RPE细胞HIF-1α蛋白的累积,诱导VEGF165mRNA及蛋白的表达,是导致增生性糖尿病性视网膜病变重要的细胞因子之一。抑制IGF-1表达可能是防治该病的有效靶点。     

缺氧对视网膜色素上皮细胞基质细胞衍生因子-1和整合素连接激酶表达的影响

背景 缺氧是诱导新生血管形成的主要因素,近年来越来越多的研究证实基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和整合素连接激酶(ILK)在新生血管性疾病中发挥着重要作用,而缺氧对视网膜色素上皮(RPE)细胞SDF-1和ILK表达的影响尚未阐明. 目的 探讨缺氧对体外培养RPE细胞中SDF-1和ILK表达的影响.方法 从4周龄SPF级健康C57BL/6小鼠眼球中获取RPE组织并进行消化和培养,将达到80％融合的细胞进行传代.取第3代细胞制作细胞爬片后用细胞角蛋白18(CK18)抗体进行免疫组织化学检测和鉴定,以5×104个/ml密度将RPE细胞接种于含胎牛血清的DMEM/F12培养液的培养瓶中,无血清饥饿培养24 h后常氧组在常规培养基中进行培养,缺氧组在CoCl2浓度为200 μmol/L的含胎牛血清的DMEM/F12培养液中进行培养,2个组根据培养时间的不同再亚分为1、3、6、12、24、48、72h组.采用逆转录PCR(RT-PCR)检测RPE细胞中SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达,采用Western blot检测RPE细胞中SDF-1蛋白和ILK蛋白的表达,均以目的基因A值/β-actin A值表示.结果 培养的RPE细胞呈不规则多边形,细胞质内布满黑色素颗粒,90％以上的细胞对CK18呈阳性反应.随着CoCl2培养时间的延长,SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达量逐渐增加,总体比较差异均有统计学意义(SDF-1 mRNA:F=281.875,P=0.000;ILK mRNA:F=187.566,P=0.000),12h达高峰,之后略有降低,但仍高于常氧组,缺氧1h组SDF-1 mRNA及蛋白表达无明显变化;缺氧培养3、6、12、24、48、72 h组SDF-1 mRNA和ILK mRNA的表达量均明显高于常氧培养组,差异均有统计学意义(P＜0.01).随着CoCl2培养时间的延长,SDF-1蛋白和ILK蛋白的表达量逐渐增加,差异均有统计学意义(SDF-1:F=44.719,P=0.000; ILK:F=144.481,P=0.000).缺氧1h组SDF-1及ILK蛋白表达无明显变化;缺氧3、6、12、24、48、72 h组SDF-1蛋白、ILK蛋白表达明显升高,与常氧组比较差异均有统计学意义(P＜0.01). 结论 SDF-1和ILK参与了RPE细胞的缺氧反应,并且在缺血缺氧性视网膜病变的发生发展过程中可能发挥一定的作用.