大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的分离培养及鉴定

背景：骨髓间充质干细胞的分离和培养扩增至今缺乏统一的方法。内皮祖细胞可以由外周血或骨髓中的单个核细胞诱导分化而成,但因获取骨髓单个核细胞的方法各异,分离效果亦有较大差异。 目的：拟在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞,并对其进行鉴定。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-10/2009-02在安徽医科大学第一附属医院中心实验室完成。 材料：清洁级健康雄性SD大鼠2只,由安徽省动物中心提供。 方法：抽取大鼠骨髓,通过密度梯度离心法提取单个核细胞,采用差速贴壁法分离骨髓间充质干细胞。原代骨髓间充质干细胞培养48 h后,收集未贴壁细胞,加入含胎牛血清、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、重组人上皮生长因子的EGM-2完全培养液诱导骨髓间充质干细胞向内皮祖细胞分化。设立3组：分别为早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞、2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞、大鼠成熟主动脉内皮细胞,采用硝酸还原酶法间接测量细胞培养液中一氧化氮的含量。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与内皮祖细胞体外培养情况,细胞培养液中一氧化氮的含量。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,24 h内大部分细胞贴壁,9~10 d可达90%融合,纯化扩增后骨髓间充质干细胞呈均匀一致的长梭性,传代周期为8 d左右,流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞CD34,CD45呈阴性,CD105呈阳性。2次贴壁的内皮祖细胞培养3 d内贴壁,6 d形成集落,8~10 d出现条索状结构,呈微血管样生长,2周时大部分细胞呈多角形,细胞集落相互连接,呈典型的“铺路石”样,7~10 d细胞DiI-acLDL、FITC-UEA-1双染呈阳性,流式细胞仪检测Flk-1,CD133阳性。2次贴壁且诱导培养的内皮祖细胞培养液中一氧化氮含量明显高于早期贴壁且普通培养的内皮祖细胞(P < 0.05),但低于大鼠成熟主动脉内皮细胞(P < 0.05)。 结论：差速贴壁法能有效地分离、纯化、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,加入多种细胞生长因子诱导后具有较强地向内皮细胞方向分化的能力,且2次贴壁细胞已具有部分内皮细胞的功能。     

心脏瓣膜组织工程中理想种植细胞的来源比较

背景：现有的人工瓣膜,无论是机械瓣膜还是生物瓣膜,都存在与取材有关、无法从工艺制作方式改进解决的固有缺陷。组织工程心脏瓣膜概念的提出为解决该难题提供了新的方向。 目的：通过比较成熟分化血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞骨的获取手段、体外增殖能力以及在脱细胞基质上的生长情况,分析何者更适合作为制备组织工程人工心脏瓣膜的种植细胞。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2008-06/09在上海市胸科医院动物实验基地完成。 材料：用胰蛋白酶(胰酶)-EDTA、Triton X-100、DNase、RNase消化猪主动脉瓣膜获得脱细胞基质。从1只12 kg 2岁雄性杂交犬大隐静脉、股外侧动脉及肋骨骨髓获取种植细胞。 方法：用胰酶消化并收集内皮细胞,收集骨髓细胞,分别进行培养。通过贴壁法获得内皮细胞及骨髓间充质干细胞。利用内皮细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向内皮细胞分化,并绘制细胞生长曲线。以抗Ⅷ因子抗体以及抗血管内皮生长因子抗体荧光染色,荧光显微镜观察。将细胞种植于脱细胞瓣膜上培养3 d后进行扫描电镜观察。 主要观察指标：①试验犬伤口愈合情况。②细胞培养、增殖情况。③骨髓来源骨髓间充质干细胞表型分析以及形态学观察。 结果：成熟血管内皮细胞体外增殖能力低下,骨髓间充质干细胞则增殖旺盛。生长曲线显示骨髓间充质干细胞的倍增时间约30 h,而成熟内皮细胞生长曲线平直。对骨髓间充质干细胞进行抗Ⅷ因子抗体以及抗VEGF抗体荧光染色,可见荧光染色阳性。扫描电镜见种植骨髓间充质干细胞的脱细胞瓣膜上散在星状细胞贴附。 结论：骨髓间充质干细胞体外增殖能力强,在内皮细胞生长因子诱导下可向内皮细胞转化,并可以生长贴附于脱细胞瓣膜,是作为组织工程人工心脏瓣膜制备的理想细胞来源。     

血管内皮生长因子165基因修饰人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质构建活性组织工程皮肤

背景：利用组织工程原理构建的人工皮肤替代物用于皮肤移植可有效解决供皮不足这一难题，但组织工程皮肤很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效。 目的：以血管内皮生长因子165基因修饰的人骨髓间充质干细胞复合兔脱细胞真皮基质，拟构建活性组织工程皮肤。 设计、时间和地点：以基因工程为基础的组织构建实验，于2008-03/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成。 材料：普通级新西兰大白兔5只用于提取脱细胞真皮基质原料，由南昌大学医学院动物科学部提供，人骨髓间充质干细胞取自临床骨髓穿刺检查正常的患者，pShuttle-CMV/VEGF165质粒转化大肠杆菌菌种由武汉协和医院郜勇博士惠赠。 方法：无菌条件下切取兔耳全层皮肤，将2 cm×2 cm皮片置于0.25%胰酶-EDTA消化液中去掉表皮，再置入曲拉通X-100溶液使真皮细胞完全脱净，磷酸盐缓冲液反复清洗，即为脱细胞真皮基质，4 ℃保存备用。采用密度梯度离心与贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞，取传至第3代细胞，按5×105/孔密度接种，待细胞达80%融合时进行脂质体介导的pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染，接种于制备好的脱细胞真皮基质上体外联合培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质的形态观察，组织工程皮肤结构观察。 结果：体外培养的骨髓间充质干细胞大部分呈梭形，基因转染后细胞形态及活性无明显影响；脱细胞真皮基质呈瓷白色，柔韧有弹性。血管内皮生长因子165基因修饰的骨髓间充质干细胞与脱细胞真皮基质共培养2 d后，所构建的组织工程皮肤呈淡红色，质软，接种细胞生长状态正常，苏木精-伊红染色及扫描电镜观察可见在脱细胞真皮基质的间隙中有大量长梭形细胞附着生长。 结论：血管内皮生长因子165基因转染的人骨髓间充质干细胞在兔脱细胞真皮基质中生长良好，可在体外联合构建活性组织工程皮肤。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

背景：目前对骨髓间充质干细胞常用的分离方法有密度梯度离心法、贴壁筛选分离法。 目的：联合应用密度梯度离心法和贴壁筛选分离法体外分离培养、扩增兔骨髓间充质干细胞，并对其进行鉴定。 设计、时间及地点：对比观察的细胞学实验，于2007-10/2008-03在上海市第六人民医院中心实验室完成。 材料：2月龄新西兰纯种大耳白兔6只用于骨髓间充质干细胞取材与原代培养，1.073 kg/L的Percoll分离液。 方法：实验采用Percol分离液利用密度梯度离心法及结合贴壁分离筛选法来分离、纯化骨髓间充质干细胞, 在采用密度梯度离心法得到骨髓间充质干细胞后，经贴壁培养及反复换液纯化骨髓间充质干细胞。分别取第3，5，7，9代骨髓间充质干细胞，行细胞计数，绘制细胞生长曲线。 主要观察指标：倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况。采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。CD44染色呈阳性，CD34染色呈阴性，说明所提取、纯化的细胞是骨髓间充质干细胞。 结果：增殖传代的骨髓间充质干细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养的细胞更均匀，细胞生长旺盛、增殖迅速，胞核明显，核仁清晰，核浆比例大，细胞形态均匀，平行排列呈螺旋状或漩涡状，传代至第5代时无明显变化。随传代次数的增加，细胞增殖能力逐渐下降，第3~5代细胞增殖能力强。所分离培养的细胞均表达CD44,不表达CD34。 结论：在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞。     

体外分离培养人皮下脂肪干细胞的生物学特性及影响因素★

目的：研究证实脂肪组织提取物中存在脂肪源性干细胞，并表现出向多谱系细胞分化的特点。对来源于人皮下脂肪组织的脂肪干细胞进行体外培养，观察其形态特点、生物学特性及间充质来源细胞表面相关标志的表达。 方法：实验于2005-11/2007-02在泸州医学院医学分子生物学实验室完成。①对象：行切疤植皮术的正常体质量患者8例，年龄16~45岁，均无传染性疾病，来源于泸州医学院烧伤整形科，实验前征得患者同意。②实验方法：人脂肪干细胞的分离、培养与传代：无菌条件下取患者新鲜的皮下脂肪，I型胶原酶消化+贴壁法获取原代脂肪干细胞，生长至70%融合时传代，观察细胞的形态学变化。当原代细胞的胞质中出现较多透亮液滴后，行油红O染色。将第3代脂肪干细胞冻存，1个月后复苏，观察细胞的生长情况。选择生长状态良好的第3代脂肪干细胞，苏木精-伊红染色观察细胞形态，SABC法检测间充质来源细胞特异性标志波形蛋白的表达，SP法检测间充质干细胞表面相关抗原CD44的表达。取处于对数生长期的细胞，绘制细胞生长曲线，计算细胞倍增时间。 结果：①原代和传代过程中人脂肪干细胞的形态学变化：原代和传代培养的细胞均为长梭形贴壁生长。当原代细胞达到50%融合后，部分细胞由梭形逐渐变为多角形或椭圆形，胞质内出现油红O染色阳性的脂滴。传代细胞中此现象逐渐消失，且经冻存后复苏的活细胞率达80%以上，细胞生长、增殖能力未受影响。②间充质来源细胞表面标志的鉴定：第3代人脂肪干细胞的胞质丰富，HE染色弱嗜碱性，呈淡蓝色；波形蛋白阳性率为(97.1±2.3)%，CD44阳性率为（85.4±3.22）%。③人脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间：传代培养的脂肪干细胞生长曲线呈“S”形，群体倍增时间为62.38 h。 结论：从人皮下脂肪组织分离培养出的脂肪干细胞，在体外扩增和冷冻保存后生物学特性稳定，且具有良好的增殖能力，表达间充质来源细胞表面标志波形蛋白和表面抗原CD44。     

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养条件的优化组合

背景：骨髓间充质干细胞分离培养方法的不同可导致其活性与纯度各异，直接影响组织工程的修复效果。 目的：对骨髓间充质干细胞体外分离培养条件进行优化组合，并验证其获取骨髓间充质干细胞的效果。 设计、时间及地点：细胞学体外实验，于2007-10/12在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。 材料：清洁级3月龄新西兰白兔2只，由山西畜牧研究所提供。 方法：向含有新鲜骨髓的DMEM培养液中加入等量淋巴细胞分离液，采用密度梯度离心和差速贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，每间隔8 h将未贴壁细胞转移入新的培养瓶，接种5 d后首次换液，细胞融合率达90%时胰酶消化传代，第1、3、5代细胞用于实验。 主要观察指标：镜下观察细胞形态及生长状态，绘制细胞生长曲线，测定倍增时间，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44标记率。 结果：原代培养的骨髓间充质干细胞呈圆形、梭形、多角形等，48 h可见贴壁细胞有伸展现象，呈梭形，多角形，成纤维细胞样展开，细胞核清晰，首次换液后可见细胞透亮并充分展开，14 d左右可达90%融合。第1、3、5代骨髓间充质干细胞整体呈S型，1~3 d为潜伏期，3 d后进入对数生长期，7~8 d为平台期，平均倍增时间为24.22 h。第2代骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达，标记率为93.0%。 结论：采用密度梯度离心联合差速贴壁、离心介质选择淋巴细胞分离液、接种5 d首次换液的体外分离培养纯化方法，获得的骨髓间充质干细胞生长状态良好，且纯度较高。     

人脐血间充质干细胞的体外成骨

背景：用免疫细胞阴性筛选法可以排除造血干细胞对于间充质干细胞生长的影响,较快的获得具有表达间充质干细胞的细胞群。 目的：探讨人脐静脉血间充质干细胞向成骨样细胞分化的能力。 方法：用免疫磁珠阳性筛选法分离脐血间充质干细胞后进行培养。取P2代细胞行成骨诱导分化。 结果与结论：人脐血间充质干细胞贴壁生长,长梭形,3周长满瓶底,传代后细胞增殖迅速。细胞表型为高表达CD44+,CD29+和CD166+。在成骨诱导后碱性磷酸酶染色阳性,Von-Kossa染色提示钙化结节形成。提示脐血间充质干细胞能够在体外分化为成骨样细胞。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的分化

背景：目前骨髓间充质干细胞已经应用于多种组织血管的修复,但涉及尿道血管组织的报道甚少。 目的：探讨体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-07/2008-01在苏州大学附属儿童医院儿科研究所完成。 材料：清洁级4周龄SD大鼠4只,由苏州大学实验动物中心提供。作为诱导剂的血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞因子为Sigma公司产品。 方法：密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞达80%~90%融合时消化传代。传至第3代,细胞按1×109 L-1密度接种,加入含血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞因子的DMEM培养基向血管内皮细胞诱导分化。 主要观察指标：MTT测定细胞生长曲线,免疫荧光法检测细胞表面CD44与Vimentin的表达,光学倒置显微镜下观察诱导后细胞形态变化,电镜观察细胞超微结构。 结果：骨髓间充质干细胞生长曲线呈倒“S”型,第3 代细胞表面CD44和Vimentin表达阳性率分别为89.3%和85.6%。向血管内皮细胞诱导1~3 d细胞呈梭形或纺锤形,7 d后变成不规则的圆形或椭圆形,胞浆淡染,胞核较大,核染色质粗,且部分细胞死亡,14 d后整瓶细胞呈漩涡状生长,21~25 d后细胞密集处呈内皮细胞特有的铺路石样排列。诱导后第21天,细胞浆内可见微管、微丝及W-P小体。 结论：血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞因子联合诱导条件下,骨髓间充质干细胞在体外可分化为血管内皮细胞。     

小鼠胚胎卵黄囊与成体间充质干细胞的比较：生物学特性相似吗？

背景：与成体间充质干细胞相比,来源于早期胚胎的卵黄囊间充质干细胞有更强的自我更新能力和可塑性,且在胚胎发育过程中可分化为成血管细胞和造血干细胞,启动胚胎血管发生和造血组织发育。 目的：探讨小鼠卵黄囊间充质干细胞的生物学特征。 设计、时间及地点：重复测量设计,细胞学体外观察,于2006-03/2007-01在首都医科大学组织学与胚胎学实验室完成。 材料：妊娠10 d的ICR小鼠80只,由首都医科大学动物部提供。 方法：显微分离ICR小鼠胚胎卵黄囊,经Ⅰ型胶原酶消化得到卵黄囊细胞,取贴壁细胞培养,于接近90%融合时按1∶2进行传代。取生长状态良好的第1代细胞,以地塞米松、胰岛素定向诱导卵黄囊间充质干细胞向脂肪细胞方向分化;以血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子体外诱导其向血管内皮细胞方向分化。 主要观察指标：相差显微镜下观察卵黄囊间充质干细胞形态;流式细胞仪检测卵黄囊间充质干细胞表面标志和细胞周期;钙钴法测定卵黄囊间充质干细胞碱性磷酸酶活性;细胞组织化学检测卵黄囊间充质干细胞化学变化;油红O检测诱导成脂能力;免疫荧光法鉴定诱导成血管内皮细胞能力。 结果：体外培养获得的小鼠卵黄囊间充质干细胞大多数呈梭形;原代和第1代细胞均为CD44,CD105阳性,CD34也有少量表达;67.4%细胞处于G0/G1期,13.9%细胞处于S期;P1代细胞碱性磷酸酶染色及苏丹黑B反应呈阴性,PAS染色呈阳性;成脂诱导1周后,胞浆中有脂滴形成,经油红O染色脂滴为鲜红色;成血管内皮细胞诱导后,细胞由原来梭形或多角形渐变为圆形或椭圆形,且内皮细胞标志物FLK1染色呈阳性。 结论：小鼠卵黄囊间充质干细胞的生物学特征与成体间充质干细胞相似。     

人脐静脉间充质干细胞体外诱导分化为神经元的可行性*★

目的：探讨来源于人脐静脉内皮及内皮下层间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性，分析体外分离纯化、原代及传代培养的最佳条件，为神经组织修复选择理想的种子细胞来源。 方法：实验于2006-04/12在辽宁医学院解剖学实验室完成。①对象：取正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条，由辽宁医学院附属第一医院提供，产妇及其家属均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：无菌条件下用1 g/LⅠ型胶原酶消化脐静脉内皮及内皮下层，收集的细胞按5×107 L-1，1×108 L-1，5×108 L-1，1×109 L-1，3×109 L-1密度接种进行原代培养，待细胞80%融合时胰酶消化传代。取第2代细胞，诱导组经含有3 μmo/Lβ-巯基乙醇、20%胎牛血清的DMEM预诱导液处理后，换成含10 g/L二甲基亚砜、100 mmol/L丁化羟基茴香醚的无血清DMEM诱导液进行诱导。未诱导组将诱导液更换为无血清DMEM。③实验评估：记录原代培养过程中不同接种密度细胞贴壁所需时间。免疫细胞化学检测诱导前细胞表面抗原血管性血友病因子、CD166的表达及诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白的表达，倒置相差显微镜下计数阳性细胞分化率。 结果：①不同接种密度细胞贴壁所需的原代培养时间比较：5×107 L-1组仅有1孔细胞贴壁呈克隆样生长，但培养至28 d时仍不能传代，其余培养孔均无细胞贴壁生长。与1×108 L-1组比较，5×108 L-1，1×109 L-1，3×109 L-1组细胞贴壁生长的原代培养时间均明显缩短（P < 0.05），且后3组比较差异无显著性意义（P > 0.05）。②贴壁细胞表面抗原检测：CD166呈阳性，血管性血友病因子呈阴性。③诱导分化：诱导组脐静脉间充质干细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性表达，不表达胶质纤维酸性蛋白。巢蛋白阳性细胞率为（9.5±1.2）%，神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率为（15.6±2.6）%。未诱导组以上3种标志均不表达。 结论：①在体外可以成功分离培养获得人脐静脉内皮及内皮下层的间充质干细胞，其原代培养细胞的种植密度以5×108 L-1~ 1×109 L-1为佳。②细胞传2代后性质相对均一，基本无造血细胞和内皮细胞污染，达到纯化目的，具有间充质干细胞特点。③在化学诱导剂β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基茴香醚联合作用下，其可以向神经元样细胞分化。     

改良Dexter法与IMDM培养基培养骨髓基质细胞的比较*★

背景：体外分离培养骨髓基质细胞，并于骨髓移植后将其注入严重联合免疫缺陷鼠体内，对于促进造血及免疫重建尤为必要。 目的：比较骨髓基质细胞在不同培养条件下的生长状况，寻找一种体外分离培养扩增骨髓基质细胞简单而实用的方法。 设计、时间及地点：体外对比观察实验，于2006-07/2007-01在太原市中心医院皮肤科实验室完成。 材料：人骨髓取自太原市中心医院血液科经筛选的正常骨髓(取材均经患者同意)。 方法：分离人骨髓单个核细胞，对照组采用改良Dexter法培养：将骨髓单个核细胞用5×10-7mol/L氢化可的松的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×109 L-1，以每孔1 mL接种于24孔培养板，培养2 d后全量换液，去除非贴壁细胞，之后每3 d半量换液1次。细胞生长至半融合状态时传代，传两三代后用胰酶消化，收集细胞，液氮冷冻保存。实验组用IMDM培养基培养：用不含氢化可的松的IMDM培养基培养，其余成分及培养条件均与对照组相同。2 d后全量换液，去除非贴壁细胞，之后每4天半量换液1次。传代及收集方法同对照组。 主要观察指标：通过倒置显微镜观察细胞贴壁情况、形态变化及增殖状态，MTT比色法检测细胞增殖活性。 结果：倒置显微镜下，两组培养细胞在接种24 h后细胞大量贴壁并伸展开，随着培养时间延长，贴壁细胞数量增多，14 d左右细胞铺满板底达融合状态。传代细胞经消化后变形，24 h后恢复原来形态，并贴壁增殖，形态和原代细胞相似，4.0~ 5.0 d后呈融合状态。两种方法培养的骨髓基质细胞增殖活性差异无显著性意义（P > 0.05）。 结论：改良Dexter法及IMDM培养基培养均可使骨髓基质细胞在短期内贴壁及增殖。IMDM培养基由于不需加氢化可的松，故比改良Dexter法更易于操作。     

CD、Flt-1基因对原代培养的恶性胶质瘤细胞VEGF表达及生长的影响

目的研究CD、Flt-1基因对恶性胶质瘤细胞VEGF表达及生长的抑制作用。方法 CD、FLT-1基因共表达质粒pEGFP-C1-CD-Flt-1转染恶性胶质瘤细胞,ELISA法检测培养液上清中VEGF含量,实时定量PCR及免疫组化检测细胞VEGFmRNA及蛋白的表达,通过MTT法和流式细胞术观察其对细胞活性的影响。结果转染72h后实验组细胞VEGFmRNA及蛋白水平显著降低,培养液中VEGF含量降低,细胞活性受到抑制,流式细胞术发现实验组细胞的G1期细胞比例明显高于对照组,细胞出现凋亡。结论重组质粒pEGFPC1-CD-Flt-1,其体外可抑制恶性胶质瘤细胞VEGFmRNA及蛋白的表达,抑制细胞活性、诱导细胞凋亡。     

转染血管内皮生长因子基因的人成骨细胞增殖及其生物学功能

背景：传统的自体或异体骨移植治疗骨缺损都存在难以克服的缺点,基因治疗可能是一种新途径。 目的：观察转染外源性血管内皮生长因子基因的人成骨细胞体外生物学特性。 设计、时间及地点：对比观察，细胞学实验，实验于2005-05/2006-05在辽宁医学院科学实验中心完成。 材料：人髂骨骨块取自需髂骨植骨的颈椎病患者的植骨块修洁剩余部分的骨质，患者知情同意。质粒pCDI/VEGF121为北京大学人类疾病治疗中心马大龙教授惠赠；感受态大肠杆菌DH5a为辽宁医学院刘丹平教授惠赠。 方法：体外分离和培养人成骨细胞。实验分为血管内皮生长因子基因转染组与对照组。利用阳离子脂质体将pCDI-VEGF121真核表达质粒导入体外培养的人成骨细胞。 主要观察指标：传代后1，3，5，7 d观察血管内皮生长因子在人成骨细胞内的表达，及其对人成骨细胞增殖活力和细胞分泌骨钙素和碱性磷酸酶能力的影响。 结果：pCDI-VEGF121真核表达质粒转染人成骨细胞后第3，7天，以反转录聚合酶链反应方法检测到其中有血管内皮生长因子mRNA表达。转染组的细胞数在第1，3，5，7天均高于对照组(P < 0.05或P < 0.01)。培养3 d时转染组成骨细胞的碱性磷酸酶阳性率大于对照组(P < 0.01)；转染组的骨钙素含量高于对照组(P < 0.05或< 0.01)。 结论：血管内皮生长因子基因转染可以促进体外培养人成骨细胞的增殖能力和相应的生物学功能。     

改良Nash差速贴壁联合阿糖胞苷法体外分离培养大鼠嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞*☆

背景：目前常用的嗅鞘细胞培养方法有差速贴壁法、化学抑制法、抗体亲和吸附法、补体法等,各自均存在优缺点,单一使用某种方法时细胞纯化率较低。 目的：拟采用改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法体外分离纯化大鼠嗅球及嗅黏膜来源的嗅鞘细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-11/2008-05在武汉大学人民医院骨科实验室和消化内科实验室完成。 材料：10周龄Sprague-Dauley大鼠10只,由武汉大学人民医院实验动物中心提供,阿糖胞苷由武汉大学人民医院制备。 方法：完整取大鼠双侧嗅球及剪取鼻中隔后1/3嗅黏膜,剪碎后胰酶消化,制成单细胞悬液,按1×109 L-1密度接种于未包被的25 cm2玻璃培养瓶中,18~20 h后将细胞悬液转移至另一未包被的25 cm 2玻璃培养瓶中（第1次差速贴壁）,24 h后再将细胞悬液转移至经多聚右旋赖氨酸包被的25 cm2塑料培养瓶或经多聚右旋赖氨酸包被的6孔培养板中（第2次差速贴壁）,接种培养48 h后半量换液以去除杂细胞。在差速贴壁培养后二三天,加入3.0~5.0 pmol/L阿糖胞苷去除残余成纤维细胞。 主要观察指标：嗅鞘细胞的形态观察、分裂增殖情况、免疫荧光染色鉴定结果及纯度测定。 结果：体外培养24 h嗅球源性嗅鞘细胞即可贴壁,而嗅黏膜源性嗅鞘细胞多在培养四五天后贴壁,两种来源的嗅鞘细胞形态相似,以双极或梭形细胞为主,少量为3极及多突起形多级细胞,同时夹杂扁平、煎鸡蛋形细胞。纯化培养10 d的嗅鞘细胞,胶质纤维酸性蛋白、神经生长因子受体p75免疫荧光染色及神经生长因子受体p75+hoechs免疫荧光双染后大部分双极或多极细胞膜、胞体、突起呈阳性,细胞纯度可达90%以上。 结论：改良Nash差速贴壁+阿糖胞苷法可在体外成功分离培养出高纯度的嗅球及嗅黏膜源性嗅鞘细胞,嗅球源性嗅鞘细胞贴壁时间及分裂增殖程度优于嗅黏膜源性嗅鞘细胞。     

大鼠乳鼠和成鼠雪旺细胞提取纯化的对照研究*

背景：许旺细胞是神经创伤修复的种子细胞,获取大量高纯度、高活性许旺细胞是研究的关键。 目的：比较乳鼠和成年鼠许旺细胞的体外培养、纯化和形态学的差别,探讨简单可行的、可以获得高纯度许旺细胞的培养方法。 方法：出生1~3 d SD大鼠20只和成年大鼠10只(体质量150~200 g),实验按细胞的来源分为新生组和成年组。双酶分步消化,二次接种差速分离纯化细胞;倒置显微镜观察细胞形态、贴壁速度;细胞计数,纯度计算;MTT法检测细胞增殖能力,绘制两组许旺细胞的增殖曲线,判定增殖速度;S-100免疫化学法鉴定细胞。 结果与结论：乳鼠的许旺细胞贴壁速度快于成纤维细胞,成鼠的许旺细胞贴壁速度慢于成纤维细胞,两组许旺细胞纯度均达96%以上;MTT法检测两组许旺细胞增殖均活跃,由增殖曲线显示乳鼠许旺细胞增殖更快(P < 0.05);S-100免疫化学反应均呈阳性。提示双酶分步消化,二次接种差速分离纯化细胞,可以获取纯度高、活性良好的许旺细胞;乳鼠许旺细胞的增殖、贴壁能力更强。     

人脑胶质瘤细胞的原代培养及生长活性观察

目的 研究人脑胶质瘤细胞原代培养的方法,观察培养细胞的生长活性与肿瘤级别之间的关系.方法 用消化培养法原代培养24例人脑胶质瘤细胞,酶消化法 振荡贴壁法 机械划除法纯化,增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色及甲基噻唑基四唑(MTT)法观察培养细胞的生长活性.结果 20例原代培养成功,第4代以后肿瘤细胞纯度达98%以上,PCNA、MTT法显示肿瘤细胞的生长活性与肿瘤级别成正比.结论 采用消化培养法可成功培养原代胶质瘤细胞,酶消化法 振荡贴壁法 机械划除法的纯化方法可获得较高的肿瘤细胞纯度;肿瘤细胞的生长活性与肿瘤的恶性程度有关,离体细胞的生长活性可作为判断肿瘤恶性程度的一个指标;检测细胞生长活性MTT法比PCNA染色更具敏感性.     

氯甲基苯甲酰氨荧光染料标记大鼠骨髓间质干细胞的体内示踪

背景：目前广泛应用于骨髓间质干细胞的标记方法主要为绿色荧光蛋白标记法，但标记与固定程序复杂，操作繁琐，易出现偏差。氯甲基苯甲酰氨(Chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine, CM-Dil)是亲脂性膜荧光染料，能够与含有肽和蛋白质的硫氢基结合进而标记整个细胞。 目的：探讨CM-Dil对大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的可行性。 设计、时间及地点：体内外细胞学观察，于2007-05/12在中山大学干细胞与组织工程研究中心、中山大学动物实验中心完成。 材料：SPF级Wistar大鼠40只，由中山大学实验动物中心提供。CM-Dil为美国Sigma公司产品。 方法：在体外，以标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为实验组，以未标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为对照组，比较两组细胞生长与增殖情况，MTT法检测细胞生长增殖情况。在体内，分别将标记CM-Dil的骨髓间质干细胞经门静脉移植及肝内培养，于移植后第7，15，21，30天制备肝脏切片。 主要观察指标：骨髓间质干细胞CM-Dil标记率，标记细胞在肝内定植、生长与分布。 结果：体外培养结果显示，两组骨髓间质干细胞在细胞生长、增殖、分裂以及形态学上均基本相似，在绿色光激发下，CM-Dil发出红色荧光，24 h后细胞标记率为100%，21 d后CM-Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭。体内实验中，经门静脉移植的骨髓间质干细胞在肝脏内主要位于间质，呈椭圆形或不规则形的分化细胞；肝内培养的骨髓间质干细胞在培养孔内呈“贴壁生长”，为椭圆形分化细胞，未发现骨髓间质干细胞进入并定植于肝组织内；CM-Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭的时间亦为21 d。 结论：CM-Dil染色简单、方便、稳定，荧光开始淬灭时间较长，可望成为大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的新方法。     

人脐带血间充质干细胞的分离培养及增殖能力*

背景：随年龄的增加，骨髓来源的间充质干细胞在数量和质量上均受到影响，并对供体损伤较大，寻找替代的间充质干细胞来源成为研究热点，而脐带血中是否含有间充质干细胞仍存在争议。 目的：拟从人脐带血中分离培养间充质干细胞，并对其生物学特性进行检测。 方法：无菌条件下，应用Percoll密度梯度离心法分离脐血标本，收获中间层细胞，加入含胎牛血清、青霉素和链霉素、L-谷氨酰胺的DMEM基础培养液，再经反复贴壁纯化，除去悬浮生长细胞，得到较多呈融合状态的贴壁细胞，待细胞达60%~80%融合时胰酶消化传代。分别取第1，5，9代细胞，观察细胞形态变化，流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达，绘制细胞生长曲线，MTT法检测细胞活性。 结果与结论：分离的脐血间充质干细胞大小均匀，呈梭形或星形的成纤维细胞样细胞。第1，5，9代脐带血间充质干细胞高表达CD29，CD105和CD166，低表达CD34和CD45；接种后5 d细胞进入指数增生期，9 d后数量减少，群体倍增时间为（53.5±8.32）h；细胞生长状态良好，在细胞活力方面1~7代基本相似(P > 0.05)，至第9代细胞增殖活力稍下降，但仍无明显差异(P > 0.05)。结果证实可在体外成功从脐血中分离培养出间充质干细胞，第1~9代细胞均具有良好的增殖能力。     

大鼠胎盘来源间充质干细胞的生物学特性

背景：研究报道,人间充质干细胞用于实验动物研究的结果不令人满意,所以考虑使用大鼠胎盘来源的间充质干细胞用于动物实验研究,以期获得更好的实验结果。查阅国内外相关文献,目前尚未发现大鼠胎盘来源间充质干细胞的相关报道。 目的：建立从大鼠胎盘分离间充质干细胞的方法,观察其基本生物学特性。 方法：通过胶原酶消化法从大鼠胎盘分离并得到间充质干细胞。每天用倒置显微镜观察其形态。用MTT法测定其生长动力学并绘制生长曲线。用流式细胞仪检测其表型及细胞周期。通过免疫组化法证实其成脂及成骨分化的潜能。 结果与结论: 原代细胞培养8 h后细胞贴壁,24 h内细胞形成集落,第4代细胞大小、形态基本一致,以梭形为主。细胞周期检测提示G0/G1期、S期、G2期的比例分别为83.76%,8.01%,8.23%。免疫表型分析其表达CD29和CD90,不表达CD45。体外诱导实验证实胎盘间充质干细胞具有成脂和成骨分化的潜能。     

人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞诱导分化及其治疗糖尿病效果

背景：相对于其他来源的干细胞而言，脐带间充质干细胞免疫排斥反应和免疫原性较小，但并不等同于无任何免疫排斥反应。 目的：观察人脐带间充质干细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化，及其移植后对糖尿病大鼠的治疗效果。 设计、时间及地点：细胞学体内对照观察，于2008-11在辽宁医学院解剖学教研室实验室完成。 材料：清洁级雄性SD大鼠36只，随机分为4组：胰岛样细胞组12只、间充质干细胞组12只、模型对照组6只、正常对照组6只。人脐带间充质干细胞由天津国家干细胞中心提供。 方法：取传至第3代的人脐带间充质干细胞，待细胞融合至70%~80%后，换用含碱性成纤维细胞生长因子、尼克酰胺的DMEM高糖培养基，向胰岛样细胞诱导分化。除正常对照组外，其余3组大鼠均腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型。造模后，胰岛样细胞组于肾被膜下植入胰岛样细胞2×106个，间充质干细胞组同法植入等量未诱导的脐带间充质干细胞，模型对照组植入不含任何细胞的培养液1 mL。 主要观察指标：诱导后胰岛样细胞的鉴定，胰岛样细胞的移植效果。 结果：诱导前脐带间充质干细胞呈长梭形贴壁生长；诱导4 d后细胞向中央聚集，出现胰岛样细胞团，此后胰岛样细胞团逐渐增大且数量增多；诱导7 d双硫腙染色呈阳性表达。移植后2周，胰岛样细胞组血糖浓度明显降低，一直维持至第6周；间充质干细胞组血糖浓度在移植后很快下降，但4周后血糖浓度上升；模型对照组血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内。免疫组化染色结果显示，移植后4周胰岛样细胞组胰腺管腔内可见大量胰岛素表达，间充质干细胞组仅有表达少量胰岛素，正常对照组胰岛素表达无明显变化。 结论：人脐带间充质干细胞体外可诱导分化为胰岛样细胞。与脐带间充质干细胞相比，胰岛样细胞能够较长时间维持大鼠血糖浓度在正常水平，且植入后可迅速发挥降糖作用。