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1.
目的:构建野生型及突变型人IL-13(hIL-13)哺乳细胞表达质粒。方法:采用融合PCR扩增人生长激素(hGH)-hIL13融合蛋白编码序列。PCR产物和pcDNA3.1表达载体经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切处理后,将PCR产物定向插入pcDNA3.1真核表达载体中,构建质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g。将其转化到DH5α感受态细胞内进行扩增,阳性克隆鉴定,质粒抽提,进行测序验证。结果:重组质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g经测序验证,hGH-hIL13融合蛋白编码序列与实验设计一致,且已与pcDNA3.1(+)真核表达载体正确重组。结论:成功构建了哺乳细胞表达质粒pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-a和pcDNA3.1(+)/hGH-hIL13-g,为后续野生型及突变型hIL-13哺乳细胞的重组表达奠定了基础。 相似文献
2.
为研究miR-93-5p、主要组织相容性复合体Ⅰ类相关基因A(MHC classⅠchain-related gene A, MICA)对宫颈癌细胞增殖及NK细胞Th1细胞因子分泌的影响及机制,采用qRT-PCR法检测人正常宫颈细胞Ect1/E67、人宫颈癌细胞HeLa中miR-93-5p的表达;在miR-93-5p mimics组(转染miR-93-5p mimics)、miR-NC组(转染miR-NC)、pcDNA 3.1-MICA组(转染pcDNA 3.1-MICA)和pcDNA 3.1组(转染pcDNA 3.1)中用脂质体转染HeLa细胞,并与NK细胞共培养;MTT法检测各组细胞增殖率;ELISA检测各组细胞中Th1细胞因子IFN-γ、TNF-α含量;Western blotting检测各组细胞中MICA蛋白的表达量。结果显示,与Ect1/E67细胞相比,HeLa细胞中miR-93-5p的表达水平显著升高(P0.05),且miR-93-5p靶向MICA;抑制miR-93-5p、过表达MICA均可显著下调HeLa细胞的增殖率,上调IFN-γ、TNF-α表达。由此,miR-93-5p可促进宫颈癌细胞增殖,抑制NK细胞杀伤能力,或可为宫颈癌的靶向治疗提供新靶点。 相似文献
3.
目的:探讨Salusin-α基因转染血管平滑肌细胞对乙酰辅酶A乙酰转移酶1(ACAT1)及清道夫受体(SA-R)表达的影响。方法:构建pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP(EGFP为绿色荧光蛋白)和psiHIV-U6-Salusin-α质粒(psiHIV-U6为慢病毒RNA干扰载体)。分别转染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP质粒和psiHIV-U6-Sa-lusin-α质粒至氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导培养的血管平滑肌细胞(VSMCs),并设置对照组,于37℃5%CO2培养箱中培养48h后,用Western-blotting方法检测ACAT1及SA-R的表达。结果:成功构建pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP和psi-HIV-U6-Salusin-α质粒。转染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP入VSMCs,Salusin-α表达增加,ACAT1表达降低(P<0.05)。转染psiHIV-U6-Salusin-α入VSMCs,Sa-lusin-α降低表达,ACAT1表达增加(P<0.05)。同时转染pcDNA3.1-Salusin-α-EGFP和psiHIV-U6-Salusin-α入VSMCs,Salusin-α和ACAT1表达均无显著性变化(P>0.05)。Salusin-α表达增加或降低对SA-R的表达均无明显影响(P>0.05)。结论:Salusin-α可下调ACAT1表达,可能具有抗动脉粥样硬化的作用。 相似文献
4.
目的:研究活化型肝星状细胞(HSC)中miRNA-193(miR 193)下调肝纤维化相关基因的表达。方法:将大鼠miR-193的前体序列(pre-miR-193)克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和DNA测序鉴定,获得质粒pcDNA3.1-miR-193;通过脂质体转染法将质粒转染到大鼠的活化型肝星状细胞(HSC-T6)中,采用荧光素酶报告基因分析法和免疫印迹检测肝纤维相关基因的表达。结果:构建的真核表达载体pcDNA3.1-miR-193经酶切鉴定及DNA测序显示,目的片段的大小与预期结果一致;荧光素酶报告基因分析法和免疫印迹检测显示,重组质粒转染到活化型H-SC-T6中后,肝纤维化相关基因的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达呈明显下降趋势,而胶原蛋白Ⅰα1和Ⅰα2的下调作用不明显。结论:miR-193能抑制活化型肝星状细胞中肝纤维化相关基囚α-SMA的表达。 相似文献
5.
目的构建结核杆菌热休克蛋白-65(HSP65)真核表达质粒,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达. 方法用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1-HSP65转染到A549 细胞,经G418筛选后获得抗性细胞克隆;用RT-PCR的方法检抗性细胞中HSP65 mRNA的表达 . 结果经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1-HSP65构建正确;RT-PCR检测结果发现,重组质粒pcDNA3.1-HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65 mRNA为阳性. 结论真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65构建成功 , 并可在真核细胞A549细胞中稳定表达. 相似文献
6.
目的:构建结核杆菌热休克蛋白-65(HSP65)真核表达质粒,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达,方法:用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( ),构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1-65转染到A549细胞,经G418筛选后获得抗性细胞克隆;用RT-PCR的方法检抗性细胞中HSP65mRNA的表达,结果:经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1-HSP65构建正确;RT-PCR检测结果发现,重组质粒pcDNA3.1-HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65mRNA为阳性,结论:真核表达质粒pcDNA3.1-HSP65构建成功,并可在真核细胞A549细胞中稳定表达。 相似文献
7.
目的构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因(sTNFR1)的真核表达载体,研究sTNFR1对TNF-α细胞毒效应的抑制作用。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增人sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3.1(-)重组质粒亚克隆,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1(-)-sTNFR1瞬时转染QSG7701细胞,半定量PT-PCR法检测sTNFR1mRNA的表达,MTT法检测sTNFR1对TNF-α细胞毒效应的抑制作用。结果人sTNFR1基因被正确克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-);通过与3-磷酸甘油醛(GAPDH)比较,pcDNA3.1(-)-sTNFR1转染的QSG7701细胞中sTNFR1mRNA表达量明显高于空载体对照组和空细胞对照组(P<0.05);pcDNA3.1(-)-sTNFR1瞬时转染QSG7701细胞,TNF-α对其细胞毒性作用受到抑制,当TNF-α浓度为100μg/L时pcDNA3.1(-)-sTNFR1/QSG7701的细胞毒性较QSG7701下降64.8%。结论成功地构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-sTNFR1,TNF-α对瞬时转染pcDNA3.1(-)-sTNFR1/QSG7701的细胞株细胞毒性作用受到抑制。 相似文献
8.
目的 构建幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Lpp20,并在HeLa细胞中进行表达.通过肌肉注射免疫C57BL/6小鼠,观察其诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平.方法 用PCR法扩增Lpp20全基因,再将Lpp20基因克隆至pcDNA3.1(+)真核细胞表达载体构建pcDNA3.1(+)/Lpp20重组体,观察其在HeLa细胞中的表达.将核酸疫苗PcDNA3.1(+)/Lpp20、对照空质粒pcDNA3.1(+)及PBS分组通过肌肉注射免疫6周龄C57BL/6小鼠.隔2周免疫一次,共免疫4次.间接ELISA法测定小鼠血清中抗Lpp20 IgG抗体水平,双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应.通过PCR法检测小鼠肌细胞中Lpp20基因的存在.结果 小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,6周后ELISA测定血清抗体A450值为0.74,效价为1:1024.核酸疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ含量明显升高[(410.36±56.23)ps/ml],与空质粒组[(25.26±10.85)pg/ml]之间差异有统计学意义(P<0.01).脾淋巴细胞增殖反应测定,核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数(2.37±0.22)明显高于空质粒组(1.53±0.47)和PBS组(1.20±0.13),P<0.01.PCR检测Lpp20基因可在小鼠肌细胞中存在.结论 成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗,且其在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答.为进一步研究该疫苗的免疫保护作用提供实验依据. 相似文献
9.
目的:探讨血管扩张刺激磷蛋白(VASP)Ser157、Ser239位点的磷酸化对血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导细胞迁移的影响及其作用差异。方法:构建VASPSer157和Ser239位点突变的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/VASP-S157A和pcDNA3.1(+)/VASP-S239A,分别转染ECV304细胞,并筛选出它们的稳定表达细胞株,通过Transwell小室跨膜迁移实验检测2种细胞株的迁移速度。结果:经PDGF-BB作用后,2种稳定表达细胞株的跨膜迁移数量明显少于对照组(P0.05),而2种细胞株之间无显著差异(P0.05)。结论:VASPSer157和Ser239磷酸化位点突变减弱了PDGF-BB诱导的细胞迁移,Ser157和Ser239磷酸化位点对VASP的功能均具有重要影响。 相似文献
10.
《中国组织工程研究》2010,(2)
背景:Bcl-xL/Bcl-xS比值的增高与肿瘤的发生密切相关,其机制尚未阐明。Bcl-x微基因是研究其选择性剪接机制的重要工具。目的:构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因,为进行Bcl-x基因选择性剪接方面的研究打下基础。方法:首先采用PCR法从人白血病细胞K562基因组DNA中扩增出Bcl-x基因外显子2及内含子2的5’部分序列片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,然后扩增出Bcl-x基因内含子2的3’端及外显子3部分序列,定向插入上一片段下游,构建成pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因,测序鉴定无误后,用pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因瞬时转染HL-60,通过RT-PCR方法对其在细胞内表达作进一步鉴定。另外,以pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板,利用反向PCR法构建突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)。结果与结论:以人白血病细胞K562基因组DNA为模板,P1和P2为引物,经PCR扩增得约686bp的目的片段;以P3和P4为引物扩增出约178bp的目的片段。微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x分别经XbaⅠ和EcoRⅠ双切、XbaⅠ和XhoⅠ双切鉴定均得到预期的片段,突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)经EcoRⅠ单酶切后,均得到预期片段,测序结果正确,表明成功构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因。 相似文献
11.
目的构建含乙肝核心C基因的真核表达载体pcDNA3.1-HBc^NheⅠSpeⅠ,为预防性及治疗性表位疫苗的研制打下基础.方法采用分子克隆技术在原核表达质粒pTrc-core的HBcAg e1-loop及e2-loop内分别添加NheⅠ及SpeⅠ酶切位点,双酶切此重组载体pTrc-core ^NheⅠSpeⅠ及真核表达载体pcDNA3.1,产物经纯化、连接,构建成真核表达质粒pcDNA3.1-HBc^ NheⅠSpeⅠ,并通过酶切、PCR及测序对该质粒加以鉴定.为了证实质粒pcDNA3.1-HBc^NheⅠSpeⅠ作为表达载体的可行性,实验中以GFP为报告基因,利用基因重组技术在该质粒的基础上构建了真核表达质粒pcDNA3.1-HBc-GFP,并将其转染HeLa细胞,共聚焦显微镜观察HeLa细胞内绿色荧光蛋白的表达情况.同时将质粒pcDNA3.1-HBc-GFP转化大肠杆菌JM109,密度梯度离心回收并纯化其表达产物HBcAg-GFP,电镜下观察其成颗粒性.结果酶切、PCR及测序结果均与预期结果相符,共聚焦显微镜下观察到HeLa细胞内绿色荧光蛋白的成功表达.电镜下观察到重组蛋白HBcAg-GFP为颗粒性蛋白.结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-HBc ^NheⅠ SpeⅠ,该载体可作为治疗性及预防性DNA疫苗的候选载体,为深入研究预防性及治疗性表位疫苗提供了资料. 相似文献
12.
锌指蛋白A20基因对内皮细胞缺氧损伤的保护作用 总被引:3,自引:0,他引:3
目的探讨外源性锌指蛋白家族中A20基因对缺氧诱导内皮细胞凋亡的影响.方法①培养原代人脐静脉内皮细胞,将细胞分组建立缺氧模型;②采用DOTAP脂质体介导pcDNA3.1EHA20质粒转染培养的内皮细胞,经G418筛选,免疫荧光检测A20基因的表达;③TUNEL原位末端标记法检测转染前后缺氧诱导内皮细胞凋亡情况.结果A20基因在内皮细胞中得到有效表达,正常对照组及转染A20基因组人脐静脉内皮细胞凋亡为(4±1)%,缺氧培养24h后对照组与转染A20基因组凋亡分别为(18±1)%、(8±1)%,两者相差有显著性意义(P<0.05. 结论A20基因能够显著抑制缺氧诱导的内皮细胞凋亡,可能在缺氧所致内皮细胞损伤中具有保护作用. 相似文献
13.
目的构建人Trim5α的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim5α,观察其对TAB2诱导的NFκB启动子荧光素酶报告基因活性的影响。方法提取Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim5α基因编码区全长片段,克隆到5`-Flag-pcDNA3.1(+),经酶切、菌落PCR及测序进行鉴定。转染HEK293T细胞,Western blot检测Trim5α蛋白的表达,双萤光素酶报告基因系统检测Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化的影响。结果经鉴定,成功构建Trim5α表达载体,该载体可在HEK293T细胞中表达Trim5α,Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化无显著影响。结论 Trim5α对TAB2诱导的NFκB报告基因活化未见显著影响,初步建立了Trim蛋白对NFκB报告基因影响的功能筛选平台。 相似文献
14.
目的:克隆和构建带大鼠结缔组织生长因子(CTGF)基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/CTGF,并观察其对血管外膜成纤维细胞(AF)表型的影响。 方法:以AF总RNA为模板,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得CTGF的cDNA,克隆入pcDNA3.1(+)载体,酶切和测序鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1(+)/CTGF用脂质体法转入AF细胞。Western blotting观察CTGF的表达。同时观察转染pcDNA3.1(+)/CTGF对细胞表型的影响。 结果:成功构建大鼠CTGF基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/CTGF.并证明其能在真核细胞内表达。转染pcDNA3.1(+)/CTGF可以诱导AF表型转化。 结论:重组结缔组织生长因子可诱导大鼠血管外膜成纤维细胞表型转化。 相似文献
15.
目的:构建空肠弯曲菌peb1A基因真核表达载体,探讨DNA疫苗不同免疫程序的免疫效果。方法:以重组pET28a(+)-peb1A质粒为模板,将空肠弯曲菌peb1A基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-),经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转染COS-7细胞中表达,Western blot鉴定表达蛋白;昆明小鼠随机分组:设空白对照组、空载体对照组、pcDNA3.1(-)-peb1A实验组,用ELISA法检测免疫后的昆明小鼠血清IgG和IgM抗体水平。结果:重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A经双酶切和PCR鉴定,构建正确。peb1A基因测序结果与GenBank中peb1A基因序列一致。重组质粒成功转染COS-7细胞,并能正确表达重组蛋白。裸DNA组IgG水平均高于两对照组,有显著性差异(P<0.05)。同一剂量短时间(0、10、20天)免疫程序优于长时间(0、15、25、35天)免疫程序(P<0.05)。结论:成功构建空肠弯曲菌真核表达重组质粒pcDNA3.1(-)-peb1A,其经肌肉注射免疫小鼠,具有较好的免疫原性,短时间免疫程序免疫效果好。 相似文献
16.
目的 探讨环状RNA Cbl原癌基因B(circCBLB)/miR-486-5p功能轴对类风湿性关节炎成纤维细胞样滑膜细胞(RA-FLS)增殖、凋亡及炎症因子产生的影响。方法 人RA-FLS,用100μL的10 ng/mL肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激RA-FLS建立模型。采用双荧光素酶靶向验证circCBLB/miR-486-5p的结合关系。构建pcDNA3.1/siRNA-circCBLB、阴性对照(pcDNA3.1-NC/si-NC)和mimics-miR-486-5p,分别转染至RA-FLS。实验分为对照组、 TNF-α处理的RA-FLS、 pcDNA3.1-circCBLB组、 pcDNA3.1-NC组、 si-circCBLB组、 si-NC组、 pcDNA3.1-circCBLB联合miR-486-5p-mimics组。采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡,平板集落形成实验检测细胞平板集落形成能力,实时定量PCR检测各组circCBLB、 miR-486-5p表达水平,ELISA检测各组细胞上清液抗炎因子白细胞介素4(IL-4)、 IL-10,... 相似文献
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目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。 相似文献
18.
目的:用真核重组质粒pcDNA3.1(-)/ltB-nspA鼻饲免疫小鼠,探索粘膜佐剂LTB辅佐NspA所诱发的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答水平。方法:对真核重组质粒行PCR及双酶切鉴定后大量制备,经鼻饲途径免疫雌性BALB/c小鼠,间接ELISA法检测血清中NspA特异性IgG抗体水平及小鼠生殖道灌洗液中NspA特异性sIgA抗体水平;MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清IFN-γ含量。结果:融合基因pcDNA3.1(-)/ltB-nspA组小鼠生殖道灌洗液中sIgA(A450:0.316±0.045)明显高于pcDNA3.1(-)/nspA单基因组(P0.05)和其它对照组(P0.01);小鼠血清中IgG(A450:0.643±0.156)水平、脾淋巴细胞刺激指数(SI:1.65±0.32)和脾淋巴细胞诱生的IFN-γ(160.56±25.67pg/ml)水平均明显高于pcDNA3.1(-)/ltB、空质粒pcDNA3.1(-)和PBS对照组(P0.01)。结论:pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因疫苗经鼻饲免疫,能够诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答;粘膜佐剂LTB可辅佐NspA诱导小鼠产生更高水平的生殖道粘膜免疫。 相似文献
19.
目的 构建膜联蛋白A5(ANXA5)重组质粒并探讨过表达ANXA5对宫颈癌SiHa细胞的增殖产生的影响. 方法 将ANXA5基因克隆入含His标签的pcDNA3.1质粒载体,构建pcDNA3.1-ANXA5重组质粒;用磷酸钙共沉淀法将重组质粒和pcDNA3.1空质粒分别转染宫颈癌细胞系SiHa细胞,G418加压培养,免疫印迹法筛选过表达ANXA5的细胞克隆,免疫组织化学筛选已转染pcDNA3.1空质粒的细胞克隆;将过表达ANXA5蛋白的细胞、载有pcDNA3.1空质粒的细胞以及未处理的SiHa细胞分别进行四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)实验和CCK-8实验检测细胞增殖情况. 结果 成功构建了peDNA3.1-ANXA5重组质粒,测序证实ANXA5基因序列正确;普通未处理的SiHa细胞和转染了pcDNA3.1空质粒的SiHa细胞生长速度较快,两组同无显著性差异(P>0.05);过表达ANXA5的SiHa细胞其增殖速度比前两组显著降低(P<0.05). 结论 膜联蛋白A5可能对宫颈癌细胞系SiHa细胞的增殖具有抑制作用. 相似文献
20.
目的:探讨外源性A20基因在缺氧培养条件下对内皮细胞E-选择素表达的影响。方法:培养原代人脐静脉内皮细胞,将细胞分组建立缺氧模型。采用脂质体转染法将质粒pcDNA3.1EHA20转染培养的内皮细胞,筛选出抗G418的阳性克隆,经免疫荧光鉴定A20表达。采用免疫组化和原位杂交的方法检测内皮细胞E-选择素的表达。结果:缺氧能诱导人内皮细胞E-选择素的高表达。外源性A20基因抑制80%以上由缺氧诱导的内皮细胞E-选择素的表达。结论:外源性A20基因能够显著抑制缺氧诱导的人内皮细胞的活化,有效抑制E-选择素的表达。 相似文献