斑马鱼sat1.a突变体的鉴定

目的 在我们的前期研究工作中，通过Tol2转座子介导的插入突变，筛选到了一批组织特异性表达绿色荧光蛋白GFP的斑马鱼品系。其中一个品系Tol2：20141221t的GFP在神经系统中表达，但还没有鉴定到Tol2转座子插入到基因组什么位置，造成了哪个基因的突变。本文的主要研究目标就是对这一由Tol2转座子插入诱导的斑马鱼突变品系进行鉴定。方法 使用交错式热不对称PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）鉴定Tol2转座子插入的基因组位置；利用原位杂交检测被突变的基因的时空表达是否与该品系GFP表达具有一致性；筛选鉴定纯合体突变体，并进一步分析该基因突变造成的发育缺陷。结果 在该品系中，Tol2转座子插入到了亚精胺/精胺N1-乙酰基转移酶1a（spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1a，sat1.a）的第八个内含子区域，致使sat1.a基因转录提前终止。我们筛选到了sat1.a纯合突变体，但是没有检测到明显的发育缺陷。结论 筛选鉴定的Tol2转座子介导的斑马鱼sat1.a突变体没有明显的发育缺陷，但可以作为研究神经系统发育的有力工具。     

阿霉素对模式生物斑马鱼中abcb4基因表达的影响

目的 选择斑马鱼作为实验对象,研究阿霉素(doxorubicin,DOX)对其abcb4基因表达的影响,进一步了解abcb4基因在斑马鱼多药耐药机制中可能的作用。方法 分别以2 mL/L二甲基亚砜（DMSO）,10 μmol/L DOX及含2 mL/L DMSO的10 μmol/L DOX对斑马鱼胚胎进行药物处理,另以Eggwater处理的胚胎作为对照组。将正常发育的4~16个细胞期斑马鱼胚胎,随机分入以上各组中,药物处理至120 hpf。收集药物处理下的斑马鱼不同时期胚胎运用实时荧光定量PCR和胚胎原位杂交技术,检测abcb4基因在斑马鱼中的表达变化情况。结果 相较于对照组,药物处理的斑马鱼胚胎abcb4基因mRNA表达水平升高(P<0.05),而abcb5基因mRNA表达情况则无明显变化。通过斑马鱼胚胎原位杂交,均在斑马鱼120 hpf胚胎小肠部位发现有abcb4基因阳性杂交信号,且药物处理的斑马鱼胚胎在脑及心脏部位发现abcb4基因阳性杂交信号。结论 DOX能诱导斑马鱼胚胎abcb4基因表达水平增高,对阐明abcb4基因在斑马鱼多药耐药产生机制中的作用具有重要意义。     

转双价抗虫基因 Bt-CpTI 提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性

目的 将外源苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因 CryIA(c) 和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 CpTI 共同转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫小菜蛾抗性。方法 构建了以 CaMV 35S 为启动子,新霉素磷酸转移酶 (Npt-Ⅱ) 为选择标记,带有 CryIA(c) 基因和 CpTI 基因的植物表达载体 pGBI121S4ABC 并转入根癌农杆菌 LBA4404。采用叶盘法遗传转化四倍体菘蓝。转基因再生植株经 PCR 和 Southern 杂交检测,并进行抗小菜蛾实验。结果 T₀ 代转化四倍体菘蓝的双基因阳性转化率达到 16.67%。Southern 杂交检测结果表明外源 CryIA(c) 基因和 CpTI 基因均已经随机整合到转基因菘蓝的基因组中。与野生对照相比,转基因四倍体菘蓝对小菜蛾显示出明显抗性。结论 转双价抗虫基因 Bt-CpTI 是提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性的有效手段。     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的 建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系，并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法 通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列，并构建Cas9-MAD2L1载体，将该载体转染到NIH/3T3细胞中，通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后，提取细胞转染后的基因组DNA，利用PCR方法，结合T7E1分析和桑格尔测序，鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况，并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果 将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞，PCR结合T7E1结果显示，以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物，可被酶切成166 bp和62 bp片段，测序结果显示，成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑，脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论 成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系，设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

刺五加GAPDH基因的克隆及序列分析

目的 对刺五加Eleutherococcus senticosus GAPDH基因进行克隆及序列分析,使其成为可用的内参照基因。方法 采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,运用RT-PCR法克隆GAPDH基因的部分序列,并以其为内参照基因进行半定量PCR。结果 克隆了长度为627 bp的刺五加GAPDH基因,推测其编码209个氨基酸,与三七、人参、拟南芥的GAPDH氨基酸序列同源性分别为97%、93%、93%,核苷酸同源性分别为94%、86%、84%。其作为内参照基因的半定量PCR具有良好的扩增效果和重现性。结论 首次分离并克隆了刺五加GAPDH cDNA,证实该序列可以作为基因表达分析的内参照基因,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机制研究奠定基础。     

Streptomyces sp.Tü 4128中新型抗生素bagremycins抗性基因bagJ的研究

通过框内敲除鉴定了链霉菌Streptomyces sp.Tü 4128中基因bagJ的功能。HPLC结果表明,敲除基因bagJ导致抗生素生产水平大幅降低;回补菌株恢复了抗生素的生产;过表达菌株大幅提高了抗生素的产量,证明基因bagJ在新型抗生素bagremycins的生物合成中必不可少。抑菌圈实验表明基因bagJ敲除菌株较野生菌株对bagremycins更加敏感;BagJ在Streptomyces lividans TK64中异源表达后使该菌株对bagremycins的耐受性增强,证明bagJ是新型抗生素bagremycins的抗性基因。扫描电镜的结果证明了BagJ异源表达后导致Streptomyces TK64的菌丝形态发生了改变。其他抗生素的敏感性实验表明,BagJ可能是一个逆向转运蛋白。     

利用CRISPER/Cas9技术构建肝脏特异性敲入Lcat基因小鼠

目的：通过 CRISPR/Cas9 介导的基因编辑技术构建卵磷脂胆固醇脂酰转移酶（lecithin-cholesterol acyltransferase， LCAT）基因敲入C57BL/6小鼠并与肝脏特异性表达Cre的转基因小鼠配繁得到肝脏特异性敲入Lcat基因C57BL/6小鼠模型。 为Lcat基因在肝脏相关代谢疾病发生机制的研究提供动物模型。方法：利用CRISPR/Cas9技术构建Lcat基因敲入小鼠；利用肝脏特异性表达Cre的转基因小鼠与Lcat基因敲入小鼠交配得到肝脏特异性敲入Lcat基因小鼠；通过PCR法鉴定小鼠的基因型 ；利用实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）和 Western blot 技术验证 Lcat 基因的 mRNA 水平和蛋白水平。 结果：PCR结果显示肝脏特异性敲入Lcat基因的小鼠模型构建成功；qPCR结果显示Lcat基因在肝脏中特异性高表达；WB结果显示，与对照组小鼠相比，LCAT蛋白在肝脏特异性敲入Lcat的小鼠肝脏中有明显更高的表达。结论：成功构建肝脏特异性敲入Lcat基因小鼠，为在动物水平探索Lcat基因在肝脏相关代谢疾病中的功能及相关发病机制提供研究平台。     

SFRP1、LINE1基因启动子区CpG岛甲基化状态在肝细胞癌预后评估的价值

目的 探讨分泌型卷曲相关蛋白（SFRP）1、长散在核元件（LINE）1基因启动子区CpG岛甲基化与人原发性肝癌( 简称肝癌)临床病理参数的关系,及其在肝癌预后评估的意义。方法 收集105例肝癌患者血浆和50例对照健康人血浆DNA,使用甲基化特异性PCR（MSP）检测了SFRP1基因启动子区CpG岛高甲基化和LINE1基因启动子区CpG岛低甲基化的情况;分析两种基因启动子甲基化和肝癌患者临床病理参数之间的关系;通过Kaplan-Meier曲线、对数秩检验及Cox多因素分析,分析SFRP1、LINE1基因甲基化状态与肝癌患者总生存率及无病生存率之间的关系。 结果 105例肝癌患者血浆中SFRP1基因启动子区CpG 岛高甲基化阳性率为59.05 % (62/105),LINE1基因启动子区CpG岛低甲基化率为66.67%（70/105）,基因SFRP1高甲基化和LINE1低甲基化表达均阳性为43.81% (46/105),正常对照组中未发现有这两种基因甲基化;SFRP1高甲基化、LINE1低甲基化均与HBsAg是否阳性及甲胎蛋白（AFP）值相关(P<0.05);SFRP1、LINE1基因启动子区域的甲基化状态与总生存率及无病生存率有关：SFRP1高甲基化阴性+LINE1低甲基化阴性组患者预后最好,而SFRP1高甲基化阳性+LINE1低甲基化阳性组患者预后最差。结论 SFRP1、LINE1基因启动子区CpG岛甲基化与肝癌的发生、发展有一定联系,SFRP1和LINE1基因甲基化状态可以作为潜在可靠的分子标记物对患者预后进行预测。     

ABCB4基因的相关疾病研究进展

ABCB4基因编码多药耐药蛋白3（MDR3）主要表达于肝细胞的毛细胆管膜，为磷脂酰胆碱转出酶，将卵磷脂从磷脂双分子层内侧转至膜外的胆汁内。ABCB4基因突变可导致MDR3表达下降和/或功能缺陷从而导致ABCB4缺陷症。随着基因测序的普及和公众对精准医疗的需求，对该基因的深入研究可对以基因型为基础的新治疗方案进行指导。现对ABCB4基因功能和所致疾病新进展进行综述，旨在加强临床医师对ABCB4基因相关疾病的认识。     

FLT3基因表达在急性髓系白血病中的临床意义

目的 研究急性髓系白血病（AML）患者骨髓中FMS样酪氨酸激酶3基因（FLT3）表达水平与FLT3基因内部串联重突变（FLT3-ITD突变）、临床表现和疾病预后的相关性及意义。方法 采用荧光定量PCR法检测128例AML患者初诊时骨髓标本中FLT3基因表达水平,以FLT3基因表达量＜35%作为低表达组,≥35%作为高表达组,并探讨不同FLT3基因表达水平的FLT3-ITD突变、临床症状、实验室检查结果及疾病预后,采用多因素logistic回归分析FLT3基因高表达的影响因素,采用单因素Cox回归和生存曲线进行生存分析。 结果 剔除1例不合格的M2患者RNA样本,最终纳入127例进行分析。AML患者初诊时FLT3表达量为0.01～180.68（均值14.65）。FLT3基因表达水平在WHO的AML分型中M1最高,M6最低,但各亚型间差异不具有统计学意义。FLT3基因高表达组AML患者外周血白细胞计数（WBC）较低表达组高（P<0.01）,且高表达组患者更容易发生贫血及发热临床症状（P<0.05）,多因素logistic回归发现,FLT3基因高表达的可能相关因素为WBC〔回归系数（B）=1.508,比值比（OR）=4.518,95%可信区间（95%CI）：1.465~13.390,P=0.009〕及贫血（B=2.142,OR=8.513,95%CI：3.201~22.644,P<0.001）。 FLT3基因低表达组AML患者完全缓解率（CR）为81.82%（36/44）,高于FLT3基因高表达组38.55%（32/83）,（P<0.05）。生存曲线显示,FLT3基因高表达组患者生存时间较低表达组短（P<0.05）。Cox回归显示, FLT3基因表达高水平患者死亡风险是FLT3基因表达低水平者的3.810倍（B=1.338,相对危险度3.810,95%CI：1.820~7.947,P<0.001）。高表达组总生存率为56.63%,低表达组为70.45%,两组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论 FLT3基因高表达可能与AML患者WBC及贫血症状有关。FLT3基因高表达是AML患者预后不良的指标。     

肉苁蓉苯乙醇苷类成分抗骨质疏松作用机制研究进展

肉苁蓉是一种珍贵的滋补类药材,素有"沙漠人参"的美誉,具有极高的药用价值和食用价值.药理学研究已确认肉苁蓉具有抗氧化、抗炎、抗疲劳、抗衰老、抗骨质疏松、润肠通便、保肝、免疫调节等药理作用,其中苯乙醇苷类是其主要活性成分之一.近年来,肉苁蓉苯乙醇苷类成分抗骨质疏松的作用得到广泛关注,松果菊苷和毛蕊花糖苷是其代表性成分,笔...     

丹参雌激素样作用及机制研究近况

丹参是活血化瘀类常用中药之一,具有活血化瘀、调经、凉血消痈、安神的功效。丹参作为单味药或配伍用药广泛应用于临床。临床以及相关实验研究表明,丹参及其所含有的多种化学成分均有雌激素样作用,可通过调节雌激素受体(ER)、促进细胞凋亡等方式抑制乳腺增生、乳腺癌等妇科疾病的发生发展。     

嗜黏蛋白阿克曼菌与肥胖的关系

嗜黏蛋白阿克曼菌（A.muciniphila）是一种人类肠道的正常菌群，肥胖患者肠道菌群中的A.muciniphila丰度明显降低。许多证据表明A.muciniphila与肥胖、糖尿病、心血管疾病和低度炎症呈负相关。A.muciniphila不仅可以保护肠道上皮细胞及黏液层的完整性发挥代谢保护作用，在炎症反应过程中A.muciniphila也能通过调节性T细胞、内源性大麻素系统以及非经典Toll样受体发挥抗炎作用。本文就A.muciniphila与肥胖的相关性及分子机制、临床应用等作一综述。     

中药连翘化学成分及药理活性研究进展

连翘为中国传统中药,具有清热解毒、消肿散结、疏散风热等功效,临床上主要用于痈疽、乳痈、瘰疬、风热感冒、丹毒、温热入营、温病初起、高热烦渴、热淋尿闭、神昏发斑等症的治疗.连翘化学成分众多,目前分离鉴定的成分主要包括苯乙醇苷类、木脂素类、酚酸类、黄酮类、萜类及挥发油、C6-C2天然醇及其苷类等.现代药理研究表明,连翘具有抗...     

《黄帝内经》中“开鬼门、洁净府”理论的现代临床应用

“开鬼门、洁净府”理论最早记载于《素问·汤液醪醴论》,通过查阅文献并整理,明确其具体含义指宣肺发汗、通腑排浊与清利小便之法。文章拟对现代医家运用“开鬼门、洁净府”理论指导临床治疗心、肺、肾系疾病、肢节类疾病、皮肤类疾病的应用进行梳理,体现经典理论对于现代临床疾病的指导意义与价值。“开鬼门、洁净府”是中医治疗疾病的经典理论法则,合理应用将取得良好疗效,对中医经典理论传承具有重要意义,值得中医学者进一步研究及探讨。     

嗜肺军团菌mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体的构建及表达

目的 选取嗜肺军团菌mip/flaA优势抗原表位基因,构建mip/flaA二联优势抗原表位基因融合表达载体,并在原核系统中表达,为后续制备嗜肺军团菌蛋白疫苗提供初步的实验基础。方法 运用生物信息学方法对Mip和FlaA蛋白的二级结构和表面特性如理化性质、亲水性、可塑性、抗原指数以及胞外区等方面进行分析,选择其活性表位可能存在的区域为优势抗原表位区。通过PCR扩增和T4连接酶构建pET-mip、pET-flaA和pET-mip/flaA优势抗原表位基因融合表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。结果 Mip和FlaA都存在多个潜在的抗原表位位点,选取其优势抗原表位区域进行克隆和表达获得成功,并成功表达了mip/flaA二联优势抗原表位融合蛋白。结论 DNA Star软件和Expasy在线蛋白分析系统能够成功预测嗜肺军团菌Mip和FlaA 抗原的表位;选取其优势抗原表位成功构建了pET-mip/flaA二联原核表达载体,并高效表达。     

《脾胃论》之五运六气理论浅析

《脾胃论》是李东垣的代表作之一,其内容除了体现脾胃中心理论外,还蕴含了丰富的运气理论,目前尚未被完全解读。文章从李东垣的时代背景、甲己化土理论、擅用升阳风药、因时用药等方面具体阐述五运六气理论在《脾胃论》中的体现与临床应用。     

基于营卫和气血关系论治痰

营气与卫气由中焦脾胃化生,具有调节人体睡眠、调节体温、调节汗液排泄等作用。营卫和气血关系密切,其来源与气血一致,功能与气血相关。营卫调和则机体气血调畅,各方面机能正常,阴平阳秘,人体达到一个平衡状态。营卫失和则气血失和,引发机体产生各种疾病。而营卫气血失和引起的各种疾病与水液代谢也有密切关系,营卫气血失和,水液代谢异常,或弥漫周身,或停聚一处化生为痰。基于营卫气血之间的密切关系,从营卫气血失和角度探讨痰的产生机制,从补益营卫气血、调和营卫气血运行方面论治痰引发的各种疾病,配伍相关药物,以期为临床从营卫气血角度治疗与痰相关疾病提供参考。     

阿维链霉菌中一个双组分调控系统SAV931/932功能初探

双组分调控系统是链霉菌次级代谢产物生物合成调控中的一种重要调控机制。基于生物信息学分析,位于阿维菌素生物合成基因簇上游的双组分系统SAV931/932可能对阿维菌素合成起调控作用。敲除SAV931/932导致阿维菌素的产量提高25%以上,且菌体在发酵前期生长加快。RT-PCR显示阿维菌素合成结构基因aveA1和aveA3及调控基因aveR的转录水平均上调,说明此双组分系统在一定程度上抑制了阿维菌素的生物合成。研究表明,双组分调控系统SAV931/932可能对阿维菌素合成起负调控作用,这为研究阿维链霉菌次级代谢调控以及改善阿维菌素生物合成提供了借鉴。