筛选瘢痕疙瘩差异表达基因表达谱芯片的构建

我们通过构建以8400条人类基因的多聚酶链反应(PCR)产物为靶基因的基因微阵列芯片，筛选瘢痕疙瘩和正常皮肤中差异表达的基因，探讨这些基因与瘢痕疙瘩生物学特性的内在联系。     

应用抑制性消减杂交方法构建斑秃毛乳头差异表达基因文库

目的：构建斑秃区与正常毛囊毛乳头细胞（DPC）差异表达的cDNA正向和反向消减杂交文库，为从中克隆鉴定出斑秃特异性表达和生长期DPC特异性表达的基因奠定基础。方法：应用抑制性消减杂交技术，分别从斑秃区DPC及正常头皮DPC提取总mRNA；依次合成单链及双链cDNA，分别与2种不同的接头连接，再进行正向和反向的2次消减杂交及2次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接构建cDNA消减文库。结论：构建成功具有高消减效率的斑秃区及正常头皮DPC cDNA消减文库，文库扩增后得到120个阳性克隆，其中90个克隆含有100－500bp插入片段，结论：应用抑制性消减杂交技术所构建的斑秃区及正常头皮DPC cDNA消减文库，为进一步批量筛选，克隆斑秃区及正常头皮DPC特异性表达的基因奠定了基础。     

比较基因组杂交研究瘢痕疙瘩遗传变异

目的 了解瘢痕疙瘩遗传学改变的特征。方法 应用比较基因组杂交技术研究6例瘢痕疙瘩基因组的不平衡即遗传物质的丢失或扩增情况。结果 瘢痕疙瘩出现高频率的DNA拷贝数缺失的染色体是1p(66．7％)、16号染色体(83．3％)、20号染色体(83．3％)、22号染色体(83．3％)，其最小重叠区分别为1pter-32．2、16p13．2-p11．1、20q11．1-q13．2、16p13．2-p11．1，未发现特异区域的DNA拷贝数的高频率扩增。结论 1p、16号染色体、20号染色体、22号染色体极可能存在相关的瘢痕疙瘩抑制基因，这些基因的丢失可能参与了瘢痕疙瘩的发生、发展。     

应用抑制消减杂交和cDNA表达谱芯片筛选肝星形细胞持续活化的相关基因

目的：利用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）和cDNA表达谱芯片筛选早期活化的肝星状细胞与大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化组织、重度肝纤维化组织中差异表达的基因.方法：从SSH构建的大鼠轻度和重度肝纤维化中两个差异cDNA文库中挑选1 000条上调显著的基因,与正常大鼠4 136条基因克隆制作成一张芯片,筛选持续期活化的肝星状细胞相关基因.结果：获得与HSC持续活化相关的上调基因633条,下调基因715条,其中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶（SGK）在正常大鼠基因克隆和2、8周SSH上调差异基因中均呈上调信号.结论：联合应用SSH和cDNA表达谱芯片是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速、经济和有效方法;SGK可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点,参与了肝星状细胞的早期活化和信号传导.     

抑制性消减杂交技术克隆肾癌差异表达基因

目的 应用抑制性消减杂交技术构建人吕组织与正常肾组织差异表达的ｃＤＮＡ消减文库，并从中克隆鉴定出蛑癌特异性表达的新基因。方法 分别从肾癌及正常肾组织中提取ｍＲＮＡ并合成ｃＤＮＡ，经酶切后将肾癌ｃＤＮＡ分为两组，分别与两种不贩接头衔接，再与正常肾组织（ｃＤＡＮ）进行两次的消减杂交及两次抑制性ＰＣＲ产物与Ｔ／Ａ载体连接构建成功ｃＤＮＡ消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑取克隆进行酶切、测序分析     

瘢痕疙瘩的遗传学研究进展

瘢痕疙瘩是整形外科基础研究的重要课题 ,其形成机制迄今尚未完全查明 ,本文就其在遗传方面的研究进展作一综述     

瘢痕疙瘩成纤维细胞差异蛋白的初步分析

目的:筛选瘢痕疙瘩差异表达蛋白,为临床诊断提供实验依据。方法:以瘢痕疙瘩为实验组,正常皮肤组织为对照组,同时提取两组蛋白质,经初步消化、过柱、洗脱、收集后,加样到WCX2蛋白质芯片上,蛋白质芯片采用蛋白质芯片阅读机(PBSII-C型)读取数据。结果:实验结果表明瘢痕疙瘩组织相比较正常皮肤组织,蛋白芯片捕获262个蛋白峰。其中有33个蛋白质在瘢痕疙瘩成纤维细胞中出现明显的变化,有11个标志蛋白在瘢痕疙瘩成纤维细胞中高表达,22个标志蛋白相对正常皮肤是低表达。结论:运用SELDI分析了瘢痕疙瘩差异蛋白质,这些差异蛋白可为将来确定瘢痕疙瘩诊断标志物提供依据。     

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩P53基因多态性的分析

目的 探讨p53基因codon-72部位的多态性分布是否与增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的易发性有关。方法 以日本医科大学整形外科行手术治疗患者的切除瘢痕标本为材料，利用限制性片段长度多态性分析法(RFLP)及DNA序列分析法(DNA-sequence)，对54例瘢痕疙瘩标本和30例增生性瘢痕标本的p53基因codon-72部位编码精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro)的等位基因CGC(Arg)和CCC(Pro)进行了分析。结果 与正常日本人群外周血p53基因codon-72部位的多态性频度分布相比，瘢痕疙瘩差异无显著性，而增生性瘢痕则差异有显著性。此外，由穿耳孔所致的耳部瘢痕疙瘩CGC(Arg)基因型显著增高。结论 推测p53codon 72部位具有CGC／CGC(Arg／Arg)纯合型者耳部瘢痕疙瘩的发生率明显增高，具有CCC／CCC(pro／pro)纯合型者增生性瘢痕发生率增高。     

抑制差减杂交筛选严重烫伤大鼠免疫细胞差异基因

目的 探索严重烧伤早期免疫细胞基因表达变化与烧伤后免疫功能紊乱的关系。方法 分离严重烫伤F344雌性大鼠的外周血免疫细胞并提取mRNA，以烫伤前为对照进行抑制差减杂交筛选差异表达基因，将差异基因克隆后测序，与Genbank进行同源性比较。结果 分离的免疫细胞经检测基本为单核细胞及淋巴细胞，抑制差减杂交得到多个位于200－400bp的条带，将它们克隆到pGEM-T质粒载体，构建了差异表达基因库。随机测序20个克隆，得到的基因与烧伤后机体改变相符，部分新基因序列在Genbank登录。结论 严重烧伤早期外周血免疫细胞的基因表达就有改变。构建了F344雌性大鼠的差异表达基因库，从中检出的部分基因可能对严重烧伤后的免疫功能紊乱有诱发作用。     

瘢痕疙瘩与增生性瘢痕基因的异同

瘢痕疙瘩（Keloid,K）与增生性瘢痕（Hyperpladtic Scar,HS）是病理性瘢痕（hbnormal Scar,AS）的两种表现形式,其产生机制尚不明确。本文从K和HS所涉及的基因出发,探讨其基因表达的异同。     

瘢痕疙瘩TNF受体Ⅱ基因1573位点突变的研究

目的 探讨瘢痕疙瘩患者TNF受体Ⅱ(TNF receptor Ⅱ,TNFR-Ⅱ)基因1573位点突变的情况. 方法收集22例自愿捐献的经临床及病理确诊的瘢痕疙瘩标本,其中男6例,女16例;年龄18～53岁.设患者自身外周静脉血标本为正常对照.提取基因组DNA,PCR扩增TNFR-Ⅱ基因1573位点片段,DNA测序,将测序结果 与GeneBank比较.结果 实验提取DNA浓度均＞0.5 μg/μL,纯度(A260/A280)均＞1.5,经琼脂糖凝胶电泳检测,与所设计DNA片段大小相近,符合实验要求.13例瘢痕疙瘩标本检测示不同程度突变,突变率为59.1%;9例1663编码子发生点突变,,占总数的40.9%.与外周静脉血比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).突变类型主要为点突变、插入、缺失,为多位点、多类型,呈多态性. 结论 TNFR-Ⅱ基因1573位点突变与瘢痕疙瘩的发生有关.     

瘢痕疙瘩中皮肤附件结构破坏与瘢痕增生的关系

目的　探讨瘢痕疙瘩 (keloid K)形成过程中皮肤附件 (skin appendages,SAs)结构破坏与瘢痕增生的关系。　方法　将来自 17例 K患者的活检标本按浸润生长 (K- I,n=9)、瘢痕增生 (K- P,n=17)、瘢痕萎缩 (K- A,n=10 )和边缘正常皮肤 (K- N,n=6 )进行分组 ,另以非 K患者胸部正常皮肤 (NS,n=6 )为对照 ,采用免疫组织化学方法观察SAs密度与广谱细胞角蛋白 (pan- fytokeratin,CKp)、CK19、腺上皮分泌成分 (secretory component,SC)和增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuclearantigen,PCNA) ,以及凋亡相关蛋白 Bcl- 2和 Bax之间的变化规律 ,同时用组织学、解剖显微镜及扫描电镜观察 K胶原纤维和 SAs结构的组织形态学改变。　结果　与 K- N和 NS组相比 ,K组织中 CKp和 SC阳性的 SAs密度迅速减少 ,可见 SAs结构消失后残留 CKp阳性蛋白痕迹 ;多数 SAs上皮细胞 Bax表达增强 ,但 Bcl- 2、PC-NA和 CK19阳性的 SAs则呈现复层 (鳞状 )上皮化和形态结构异常。 K组织形态学大致经历浸润、增殖和成熟的过程 ,SAs也相应地发生增生 ,细胞迁移、炎性反应和血管闭塞等引起的形态结构破坏和几乎被纤维结缔组织完全取代的变化过程。直线相关分析显示 ,K的瘢痕厚度与 SAs密度之间呈显著的负相关 (r=- 0 .341,P<0 .0 1)。　结论     

瘢痕疙瘩临床表型与p53基因72位编码子基因多态性的相关性分析

目的观察并探讨p53基因表达及其72位编码子基因多态性对瘢痕疙瘩临床表型的影响。方法取35例自愿捐献瘢痕疙瘩组织,男19例,女16例;病程4个月～8年。同时收集自身外周血作基因型分析。根据观察范围不同,实验共分为两组(n=35)。中央组:各瘢痕疙瘩中央部(中央2/3半径范围内);周边组:各瘢痕疙瘩周边部(周边1/3半径范围内)。两组再根据瘢痕疙瘩最大横径大小分3个亚组:<1cm为小体积组(n=5),1～3cm为中体积组(n=21),>3cm为大体积组(n=9)。采用PCR法扩增p53基因外显子4,并进行基因测序;免疫组织化学方法检测P53蛋白表达变化;TUNEL法检测瘢痕疙瘩组织中成纤维细胞凋亡,并进行统计学分析。结果瘢痕疙瘩p53遗传基因型为Arg/Arg者7例,Pro/Arg者21例,Pro/Pro者7例,与临床表型分布有相关性(P<0.05);中、小体积周边组及中央组P53蛋白染色阳性,大体积周边组偶见细胞染色阳性。基因型为Arg/Arg、Arg/Pro及Pro/Pro的标本吸光度值分别为3439.3598±538.5275、3273.1862±375.2139及1691.3729±98.9893,各基因型间比较,差异有统计学意义(P<0.05);TUNEL法检测成纤维细胞凋亡,镜下可见凋亡细胞呈均匀分布,大、中、小体积周边组凋亡细胞指数分别为31.0000±3.2660、42.3000±4.3548、44.6000±5.2536,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论瘢痕疙瘩临床表型与P53蛋白表达密切相关,组织中p53基因72位编码子基因多态性的变异有利于瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡。