Caspase-3在间质干细胞分化过程中的基因芯片分析及体外作用

目的 观察Caspase-3在小鼠胚胎肢芽间质干细胞分化过程中的作用,并将其运用于体外间质干细胞模型中进行验证.方法 用基因芯片技术检测Caspase-3在小鼠胚胎肢芽间质干细胞分化过程中的基因表达,分析其表达规律和可能作用;Yg用Caspase-3活性检测试剂盒,荧光比色法和Western blot法检测体外培养的骨髓间质干细胞诱导失巢凋亡中Caspme-3活性的改变;借助流式细胞仪分析骨髓间质干细胞凋亡的变化.结果 Caspase-3在小鼠胚胎肢芽间质干细胞向软骨分化的关键期(E12)出现显著的表达下调;Caspase-3的活性以及蛋白表达水平随诱导凋亡时间的延长而明显升高,且与细胞凋亡率相关.结论 Caspase-3蛋白在体内和体外诱导间质干细胞凋亡的过程中均发挥着重要作用;胚胎发育过程中,通过下调Caspase-3的表达以促进软骨形成,而抑制Caspase-3的活性可以有效降低细胞凋亡率.     

5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞分化作用的实验研究

[目的]探究5-氮杂胞苷和地塞米松对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化能力的影响。[方法]SD大鼠骨髓间充质干细胞体外扩增和传代培养,流式细胞术鉴定细胞表面标志,取3代细胞随机分为空白组、激素组、激素+5-氮杂胞苷组,相应药物干预3 d后成骨诱导分化14 d,RT-PCR和Western blot检测Runx2和PPARγ的表达。[结果]所取得骨髓间充质干细胞纯度和均一性好,细胞表面标记CD90高表达,CD34、CD45低表达。第3代细胞经药物干预和成骨诱导后,与空白组相比,激素组Runx2基因表达降低,PPARγ基因升高,5-氮杂胞苷+激素组结果与激素组相反(P<0.05)。[结论]激素能抑制骨髓间充质干细胞成骨分化,促进成脂分化,5-氮杂胞苷能干预激素的这种作用,提高骨髓间充质干细胞分化潜能。     

体外培养对骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的 :研究成人骨髓间充质干细胞在体外培养条件下 ,传代次数与细胞凋亡的关系。方法 :采用An nexinV/PI双染色法 ,在流式细胞仪上检测不同传代数的成人骨髓间充质干细胞的凋亡情况。结果 :传代次数越多 ,骨髓间充质干细胞的凋亡率及死亡率越高 ,存活的正常细胞越少。结论 :第 4代以内的细胞增殖能力强 ,凋亡率低 ,适宜于组织工程研究     

前列腺素E1抗大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的最佳浓度探讨

目的探讨在体外条件下前列腺素E1抗大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡的最佳浓度。方法提取SD大鼠骨髓间充质干细胞,取P3-P5代的大鼠骨髓间充质干细胞在体外缺血清缺氧条件下进行培养,将前列腺素E1分别以0μg/L(对照组)、1μg/L、10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、100μg/L的浓度作用于大鼠骨髓间充质干细胞,并设置48 h,72 h二个时间点,用流式细胞检测的方法测定每个时间点及每个浓度组的大鼠骨髓间充质干细胞凋亡率,最后对数据进行统计分析。结果在各个时间点中,质量浓度为1μg/L、10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、100μg/L的前列腺素E1均可减少大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡,其中20μg/L浓度组的大鼠骨髓间充质干细胞凋亡率最低;前列腺素E1在作用48 h后,大鼠骨髓间充质干细胞凋亡率最低。结论体外缺血清缺氧条件下,前列腺素E1抗大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的最佳浓度是20μg/L,且其抗凋亡作用在48 h时达到高峰。     

骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞的分化潜能

目的：观察骨髓间充质干细胞在体外分化成淋巴管内皮细胞的可能性。方法：采用密度梯度离心法分离成人骨髓间充质干细胞,体外扩增,流式细胞术检测细胞表面标志。用内皮细胞培养基EGM-2培养,加入VEGF-C（156s）诱导后,相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞术检测淋巴管内皮细胞特异性标志物Podoplanin和VEGFR-3,RT-PCR检测相应基因的表达。成管实验检测分化的淋巴管内皮细胞的功能。结果：分离培养的骨髓间充质细胞形态上为纤维样,经流式细胞术测定表达CD90、CD105,其阳性表达率分别为90.03%、97.86%,而CD14、CD34、HLA-DR的阳性阳性率分别为2.00%、2.18%、1.56%。经诱导刺激后,间充质干细胞呈鹅卵石样外观,Podoplanin和VEGFR-3的表达率分别为26.25%和12.70%。RT-PCR结果显示特异性的条带,成管实验显示诱导后的淋巴管内皮细胞具有成管的功能。结论：从骨髓中可以提取到骨髓间充质干细胞,在内皮细胞培养基和VEGF-C（156s）的诱导下骨髓间充质干细胞可以分化为淋巴管内皮细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨HGF和EGF对骨髓间充质干细胞向肝细胞方向的诱导分化作用，探索出合适的诱导条件，为肝细胞移植、生物人工肝、组织工程构建等提供基础。方法：骨髓来自杂种犬的髂骨，采用全血贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞CD标记；用含HGF和EGF的α—MEM培养液进行诱导培养，并于诱导后7、14、21d留取细胞；用免疫组化检测AFP、CK18，免疫荧光检测ALB，PAS反应检测糖原；流式细胞仪检测细胞分化率。结果：分离的骨髓间充质干细胞表面CD13、CD34和CD45皆为阴性，CD29为阳性。诱导至7d出现AFP表达．14d表达增高，21d时表达下降。CK18、ALB和糖原14d时出现表达，并随时间延长表达逐渐增加：21d时ALB表达阳性率可达50％以上。结论：HGF和EGF有诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的作用。     

Wnt3a对骨髓间充质干细胞成软骨分化的影响

[目的]探讨Wnt3a基因对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨分化的影响。[方法]分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),携带Wnt3a及阴性对照基因(Mock)的慢病毒感染骨髓间充质干细胞,构建过表达Wnt3a骨髓间充质干细胞;采用甲苯胺蓝染色及QPCR观察Wnt3a对骨髓间充质干细胞成软骨分化能力的影响;使用MTT法观察Wnt3a对骨髓间充质干细胞增殖能力的影响。[结果]在0~72 h内,实验组MTT法检测吸光值明显大于对照组(P0.05);BMSCs体外成软骨诱导后,实验组细胞团明显小于对照组,且甲苯胺蓝染色较浅;实验组与对照组比较,成软骨指标Col2A1、Aggrecan和SOX9的m RNA表达降低(P0.05)。[结论]Wnt3a可促进骨髓间充质干细胞增殖,但抑制了骨髓间充质干细胞的成软骨分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中降钙素基因相关肽受体的表达

[目的]探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)受体的表达变化。[方法]采用全骨髓法体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,分为诱导成骨组与未诱导组,在传代培养的不同时期(1、2、3周),采用免疫细胞化学、Western Blot对骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化进行鉴定,采用RT-PCR、Western Blot检测各组细胞CGRP受体mRNA、蛋白的表达情况。[结果]RT-PCR结果显示同一时间点诱导组CGRP受体mRNA表达量高于未诱导组,诱导组CGRP受体mRNA表达以时间依赖性的方式不断增高;Western Blot结果显示同一时间点诱导组CGRP受体的蛋白水平高于未诱导组,诱导组CGRP受体蛋白水平以时间依赖性的方式增高。[结论]本实验从mRNA、蛋白水平证实大鼠骨髓间充质干细胞表达CGRP受体,随着成骨诱导的不断进行,CGRP的表达量随之上升。     

羧甲基壳聚糖抗氧化损伤诱导雪旺细胞凋亡的作用及机制研究

[目的]探讨羧甲基壳聚糖(carboxymethylated chitosan,CMCS)对氧化应激诱导雪旺细胞(schwann cells,SCs)凋亡的保护作用及作用机制。[方法]体外培养SCs,S-100免疫荧光染色鉴定。将SCs分为空白对照组、H2O2诱导组、H2O2加CMCS处理组。通过CCK-8检测不同组SCs增殖情况,流式细胞仪计数检测SCs早期凋亡率,检测各组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的含量,Real-time PCR技术检测Bcl-2及Bax mRNA表达水平,Western blot法检测Bcl-2,Bax,Caspase-3、-9的表达水平。[结果]H2O2诱导SCs后其细胞增殖活性明显降低,加入不同浓度CMCS后增殖活性增加。流式细胞技术检测结果表明,经H2O2诱导SCs早期凋亡率增加,加入50²00μg/ml CMCS后凋亡率逐渐降低。经H2O2诱导组SCs与空白对照组比较SOD含量明显减少,MDA含量明显增加(P<0.05);加入CMCS后SOD含量增加,MDA含量减少(P<0.05)。Real-time PCR及Western blot检测结果表明经H2O2诱导SCs内Bcl-2表达降低,Bax,Caspase-3、-9表达增高,加入CMCS后Bcl-2表达恢复,Bax,Caspase-3、9表达抑制。[结论]CMCS对H2O2诱导SCs凋亡具有保护作用。     

腰退行性病变与TRALL基因之间关系的研究

[目的]探讨腰椎间盘退行性病变与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)基因之间的相关性及临床意义。[方法]取60例腰椎间盘突出症患者(退变组)和同期60例因创伤手术患者(未退变组)髓核组织。行组织化学染色。体外实验方面,分离细胞培养后,分为4组,分别为空白对照、TRAIL siRNA转染、TNF-α处理和TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组。采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测髓核细胞Caspase-3的活性和表达。[结果]Tunel染色显示凋亡阳性细胞率退变组为48.92%,未退变组为5.23%;TRAIL蛋白表达阳性率退变组为49.11%,未退变组为12.25%,两组间的差异均有统计学意义(P0.05)。体外试验方面,相较于空白对照细胞,TNF-α处理细胞的增殖显著下降(P0.05),而凋亡率显著升高(P0.05),Caspase-3的表达显著升高(P0.05)。TRAIL siRNA转染对细胞增殖、凋亡、Caspase-3的表达无明显影响(P0.05),TNF-α处理后再用TRAIL-siRNA转染可显著逆转TNF-α对细胞增殖、凋亡和Caspase-3表现的影响(P0.05)。[结论]髓核TRAIL阳性表达细胞率与凋亡细胞率呈正相关,TRAIL沉默能显著逆转TNF-α诱导的髓核细胞增殖抑制、细胞凋亡及Caspase-3的表达。     

人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用

[目的]探讨人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡诱导作用及其具体作用机制。[方法]MG-63细胞分为空白对照组和CK药物处理组。采用MTT法检测细胞活性及增殖能力,倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验检测药物CK对细胞的诱导凋亡作用;Western blotting检测凋亡相关蛋白Caspase-9、Bcl-2及BAX的表达,研究其具体凋亡机制。[结果]CK能够显著降低MG-63的体外活性及生存率(P<0.05);细胞凋亡形态检测、Hoechst细胞核染色及Annexin V/PI细胞凋亡实验证明CK可诱导MG-63凋亡(P<0.05);CK处理后MG-63细胞表达的Caspase-9及BAX表达上调,相反Bcl-2表达下调(P<0.05)。[结论]人参皂苷CK对人骨肉瘤细胞MG-63具有凋亡诱导作用,而以Caspase-9为关键因素的线粒体凋亡途径在此凋亡中起着决定性作用。     

SET8介导AKT信号通路在调控高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的 探讨赖氨酸甲基转移酶SET8介导AKT信号通路在调控高磷诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)钙化中的作用及机制。方法 (1)选取雄性SD大鼠进行体内实验并随机分为假手术组和慢性肾衰竭血管钙化组。取胸主动脉,采用von Kossa染色检测钙化情况;免疫组化法检测SET8和Caspase-3表达情况。(2)体外实验进行原代VSMCs培养,将细胞随机分为正常组和高磷组(10 mmol/L β-甘油磷酸)。采用邻甲酚酞络合酮比色法及茜素红染色检测细胞钙化情况;流式细胞法检测细胞凋亡情况;RT-PCR和Western印迹法检测SET8、AKT和Caspase-3的表达。(3)为进一步验证SET8在VSMCs凋亡中的作用,采用脂质体转染法,分3组:SET8-短发夹RNA(shRNA)组、空质粒组和正常对照组。采用邻甲酚酞络合酮比色法及茜素红染色检测细胞钙化情况;流式细胞法检测细胞凋亡情况;RT-PCR和Western印迹法检测SET8、AKT、Caspase-3的表达。结果 (1)体内实验中,慢性肾衰竭血管钙化组的血管钙盐沉积量明显高于假手术组(P<0.05);免疫组化结果提示,与假手术组相比,血管钙化组SET8表达明显降低,Caspase-3表达明显升高(均P<0.05);相关分析显示,血管组织SET8表达水平与钙含量、Caspase-3表达呈负相关(r=-0.948,P<0.01;r=-0.961,P<0.01)。(2)体外实验中,高磷组钙盐沉积明显高于正常组(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,高磷组VSMCs的凋亡率明显高于正常组(P<0.05);RT-PCR和Western印迹显示,与正常组相比,高磷组SET8和AKT的mRNA和蛋白表达下降,Caspase-3的mRNA和蛋白表达升高(均P<0.05)。(3)干扰SET8基因表达后,VSMCs钙化及凋亡率明显增加,AKT的mRNA和蛋白表达下降,Caspase-3的mRNA和蛋白表达升高(均P<0.05)。结论 SET8可以抑制血管钙化,其机制之一可能为通过促进AKT活化,抑制Caspase-3的表达,从而抑制VSMCs凋亡,进而参与调控高磷诱导的血管平滑肌细胞钙化。     

鹿茸多肽对软骨表型化骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的 通过观察鹿茸多肽对白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）诱导软骨表型化骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）凋亡的影响，以优化软骨组织工程的种子细胞。方法新西兰大白兔2只，抽取其骨髓；经密度梯度离心得到单核细胞，经体外分离、培养获得兔MSCs。用转化生长因子β1（transforming growth factorp β1，TGF-β1）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）将其诱导分化软骨表型。将软骨表型化MSCs随机分成A组（空白对照组）：5％胎牛血清的α-MEM培养液；B组（IL-1β组）：5％胎牛血清的α-MEM培养液加入100ngIL-1β；C组（鹿茸多肽组）：5％胎牛血清的α-MEM培养液加入10μg／ml鹿茸多肽作用3d后再加入100ng IL-1β；D组（TGF-β1组）：5％胎牛血清的α-MEM培养液加入10ng／ml TGF-β1作用3d后再加入100ng IL-1β。分别于培养24、48和72h后取样，采用透射电镜观察细胞形态，Annexin V法检测细胞凋亡率，RT-PCR技术分析Caspase-3 mRNA表达水平，ELISA法检测Caspase-3蛋白酶活性。结果透射电镜观察：B组24h后细胞核内染色质开始呈块状凝集，分布于核膜下，核膜不规则；48h后细胞核内染色质凝集加剧；72h后部分细胞内的核碎片凝集成凋亡小体。各时间点C、D组细胞结构改变相对滞后，且数量较少；A组细胞结构几乎无明显改变。各时间点B组MSCs凋亡率、Caspase-3 mRNA表达及蛋白酶活性逐渐增高，与A组比较差异有统计学意义（P〈0．01）；C、D组与B组比较则逐渐下降，且差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 Caspase-3参与MSCs凋亡，鹿茸多肽通过减少Caspase-3 mRNA表达，并抑制其蛋白酶活性，阻止或逆转软骨表型化MSCs凋亡。     

MG-132对肝癌细胞BEL7402凋亡及超微结构影响的实验研究

目的:探讨泛素-蛋白酶体通路阻断剂MG-132对肝癌细胞BEL7402细胞凋亡和超微结构的影响。方法:以5和10μmol／L MG-132分别处理人肝癌BEL7402细胞24和48h,用流式细胞术检测细胞凋亡;DNA片段分析进一步证实凋亡存在,Western印迹检测Bax蛋白表达,比色法测Caspase-3活性变化,用透射电镜观察细胞超微结构的变化。结果:随着MG-132浓度的增加和处理时间延长,细胞凋亡率增加;细胞DNA抽提电泳发现特征性凋亡梯状条带;Bax蛋白表达增加;Caspase-3活化;电镜观察到典型凋亡细胞,线粒体等细胞器的形态变化与MG-132浓度和作用时间有关。结论:蛋白酶体抑制剂MG-132可诱导肝癌细胞BEL7402凋亡;线粒体损伤、Bax蛋白上调、Caspase-3激活可能在MG-132 诱导BEL7402细胞凋亡起重要作用。     

Effects of hyperparathyroidism patients’ serum and klotho protein on the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells

Objective To investigate the effects and underlying mechanism of secondary hyperparathyroidism (SHPT) patients’serum and klotho protein on the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods Three types of mixed serum from 15 patients with SHPT (serum S), 10 CKD stage 5 patients without SHPT (serum C) and 15 healthy volunteers (serum H) were collected. HUVECs were incubated with 10% serum H,10% serum C, 10% serum S and 10% serum S plus klotho respectively. The apoptosis rate of endothelial cells was evaluated by flow cytometry. The activity of Caspase-3 was measured by spectrophotometry. The levels of AKT and phosphorylated forms of AKT (p- AKT) were detected by Western blotting (with or without PI3K/AKT inhibitor LY294002). Results The apoptosis of HUVECs was both induced by the serum S and serum C. The apoptosis rate was greater in serum S group than that in serum C group (P＜0.05). The apoptosis was partly inhibited when klotho protein (50-100 μg/L) was added (P＜0.05), accompanying the up-regulation of p-AKT. The above effects could be blocked by LY294002. The activity of Caspase-3 was up-regulated in SHPT group compared to healthy control group (P＜0.05) and the up-regulation could also be inhibited by klotho protein (P＜0.05). Conclusions The apoptosis of HUVECs is induced by the serum from CKD stage 5 patients without SHPT and SHPT patients. Klotho protein can protect the HUVECs from apoptosis by up-regulating p-AKT and inhibiting Caspase-3.     

白花蛇舌草对人胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响及其机制

目的 观察白花蛇舌草在体外对胶质瘤U87细胞株增殖和凋亡的影响并探讨其机制.方法 用不同浓度的白花蛇舌草含药培养基(0、5、10、15、20ml/L)处理U87细胞不同时间(24、72 h)后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测其对U87细胞增殖能力的影响,流式细胞仪检测对照组与实验组细胞的凋亡差异,免疫印迹法检测U87细胞中半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)表达水平的改变.结果 经白花蛇舌草5、10、15、20ml/L处理后,U87细胞增殖受到明显抑制,呈显著的剂量依赖性;经白花蛇舌草(5、10 ml/L)处理后U87细胞的凋亡率分别增加到(5.22±0.29)%、(8.38±0.65)%,明显高于对照组的(3.09±0.05)%(P＜0.01);白花蛇舌草可明显上调U87细胞中Caspase-3的蛋白表达,且呈浓度依赖性.讨论白花蛇舌草对胶质瘤U87细胞生长的抑制作用可能通过上调Caspase-3基因的表达从而诱导细胞凋亡实现.     

Expression of secreted frizzled related protein 4 and effect of induced-apoptosis in autosomal dominant polycystic kidney disease

Objective To evaluate the expression of secreted frizzled related protein 4 (sFRP4) in autosomal dominant polycystic kidney disease(ADPKD) and the effect of sFRP4 induced apoptosis in ADPKD. Methods (1)Serological method: serum samples of 12 healthy people and 20 ADPKD patients were collected and the levels of sFRP4 in serum were detected by ELSIA assay. (2)Tissue experiments: normal renal tissue was collected from radical nephrectomy for renal carcinoma; polycystic renal tissues were taken from ADPKD patients. The expression of sFRP4 in renal tissues was observed by immunohistochemistry; Real-time PCR was used to explore the mRNA level of sFRP4 and caspase-3; TUNEL method was applied to observe the apoptosis cells existing in ADPKD. (3)studies in vitro: HEK-293T cells were transfected with PcDNA6 and Flag. sFRP4.PcDNA6 respectively, after which Western blotting was performed to detect the expression of caspase-3 protein and flow cytometry was performed to estimate cell apoptosis rate. Results (1)ELISA results showed serum concentrations of sFRP4 in ADPKD were markedly higher than normal control (P＜0.05). (2)Compared with normal renal tissues, the sFRP4 expression was dramatically increased in ADPKD and mainly distributed in the cytoplasm of renal tubular epithelial cells. (3)Real-time PCR showed the expression of sFRP4 and Caspase-3 mRNA in ADPKD were up-regulated comparing with those in normal control (P＜0.05). (4)TUNEL assays revealed that elevated apoptosis appeared in tubular epithelial cells of ADPKD. (5)The level of caspase-3 protein and apoptosis rate were significantly increased after over-expressed sFRP4 in HEK-293T cells (all P＜0.05). Conclusions The expression of sFRP4 is strikingly up-regulated in ADPKD. In addition, abnormal apoptosis of tubular epithelial cells exists in ADPKD and over-expressed sFRP4 can induce apoptosis of HEK-293T cells. This phenomenon may be attributed to the elevated sFRP4.     

吗啡对胃癌细胞Survivin和Caspase-9表达的影响

目的 观察吗啡对人胃癌MGC-803细胞Survivin和Caspase-9基因表达的影响.方法 胃癌MGC-803细胞分为两组:对照组和吗啡组.对照组不加任何药物,吗啡组将吗啡加入细胞培养液中使吗啡终质量浓度为0.1 μmol/L.孵育24h后应用流式细胞仪检测细胞凋亡,并应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测胃癌MGC-803细胞中Survivin和Caspase-9基因mRNA和蛋白的表达.结果 吗啡组胃癌细胞凋亡率为(17.20±2.95)％,明显高于对照组的凋亡率(11.40±2.86)％(P＜0.05);RT-PCR和Western blot结果显示,吗啡组胃癌细胞中Survivin mRNA和蛋白表达降低,而Caspase-9 mRNA和蛋白表达增高(P＜0.05).结论 0.1μmol/L吗啡通过抑制Survivin的表达、增强Caspase-9的活性而促进胃癌细胞的凋亡.