高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中端粒酶逆转录酶的表达变化

目的 研究高氧诱导视网膜新生血管模型中小鼠端粒酶逆转录酶(TERT)基因表达水平是否有变化,为进一步研究视网膜新生血管疾病的预防和治疗提供新的靶点.方法 实验研究.选取7 d龄C57BL/6J新生小鼠32只,分高氧组和对照组,每组16只.高氧组小鼠以密闭氧箱内以75%±2%氧浓度饲养5 d后置于正常氧浓度环境中,正常对照组小鼠于正常氧环境中饲养.于小鼠生后12、14及19 d时分别取高氧组和对照组小鼠各2只(4只眼),经尾静脉行2%伊文思蓝溶液灌注并做视网膜铺片,荧光显微镜下观察视网膜新生血管的形成情况.高氧模型组和正常对照组生后19 d幼鼠3只,行HE染色,光学显微镜下观察视网膜血管形态,观察突破内界膜的内皮细胞核数.取生后19 d高氧组和对照组小鼠,分别取其视网膜组织并提取总RNA,反转录成cDNA后行反转录PCR,2%琼脂糖凝胶电泳并照相.提取视网膜总RNA,反转录成cDNA后(同RT-PCR),配制荧光定量实时PCR反应体系(总计20μl),在60℃检测荧光信号,分析图像.分别取高氧模型组和正常对照组P19小鼠行眼球切片,常规处理后TERT抗体孵育37℃ 60 min,HRP酶标二抗孵育30 min,DAB显色,中性胶封片,镜下观察并照相.结果高氧诱导模型小鼠牛后12 d眼底后极部出现大片无灌注区,生后14 d眼底后极部出现新牛血管迂曲、渗漏等视网膜血管病变.生后17～19 d视网膜新生血管形成达到高峰.正常小鼠视网膜组织切片HE染色基本看不剑突出内界膜的血管芽及血管管腔,内界膜下视网膜内的血管内皮细胞核散在分布、数量较少;高氧组见大量突出内界膜伸向玻璃体腔的血管管腔及血管芽,内界膜下视网膜内也有大量血管内皮细胞增生.19 d高氧模型组小鼠视网膜TERT及bFGF mRNA表达较同日龄正常对照组小鼠明显提高,二者差异有统计学意义(F=8.575,5.667;P＜0.05).生后19 d实时PCR检测高氧模型组小鼠视网膜TERT mRNA表达较同日龄正常对照组小鼠明显上调,差异有统计学意义(F=173.104,P＜0.05).生后19 d高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中视网膜新生血管TERT表达阳性,同日龄对照组新生小鼠视网膜血管TERT表达阴性.结论高氧诱导视网膜新生血管小鼠模型中端粒酶逆转录酶和新生血管形成相关因子表达水平明显上调,可能会成为视网膜新生血管疾病预防和治疗的新靶点.(中华眼科杂志,2009,45:199-205)     

氧诱导视网膜新生血管模型小鼠中ephrin A家族基因的表达

目的 观察ephrin A家族的基因是否参与氧诱导的小鼠视网膜新生血管(RNV)形成.方法 利用氧诱导新生小鼠C57BL/6J制备氧诱RNV模型,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)检测ephrin A1～A5在模型组小鼠视网膜和同龄正常小鼠(对照组)视网膜中的表达.结果 ephrin A1～A5mRNA均在正常视网膜发育的某一阶段或者发育的全程表达.在模型组小鼠视网膜中,ephrin A1 mRNA的表达量相对于对照组小鼠明显上调(t=3.19,P=0.019);ephrin A2 mRNA的表达量在15日龄的模型组小鼠中相对于对照组小鼠显著上调(t=3.71,P=0.033);ephrin A3～A5 mRNA在12、13日龄的模型组小鼠视网膜中相对于对照组小鼠表达下调或者缺失,而在15日龄的模型组小鼠视网膜相对于对照组小鼠视网膜显著上调(t=3.785,P=0.002).结论 ephrin A家族的基因参与视网膜的发育和视网膜病理性血管生成等重要的生理和病理过程.     

氧诱导视网膜新生血管模型小鼠中ephrin A家族基因的表达

目的 观察ephrin A家族的基因是否参与氧诱导的小鼠视网膜新生血管(RNV)形成.方法 利用氧诱导新生小鼠C57BL/6J制备氧诱RNV模型,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)检测ephrin A1～A5在模型组小鼠视网膜和同龄正常小鼠(对照组)视网膜中的表达.结果 ephrin A1～A5mRNA均在正常视网膜发育的某一阶段或者发育的全程表达.在模型组小鼠视网膜中,ephrin A1 mRNA的表达量相对于对照组小鼠明显上调(t=3.19,P=0.019);ephrin A2 mRNA的表达量在15日龄的模型组小鼠中相对于对照组小鼠显著上调(t=3.71,P=0.033);ephrin A3～A5 mRNA在12、13日龄的模型组小鼠视网膜中相对于对照组小鼠表达下调或者缺失,而在15日龄的模型组小鼠视网膜相对于对照组小鼠视网膜显著上调(t=3.785,P=0.002).结论 ephrin A家族的基因参与视网膜的发育和视网膜病理性血管生成等重要的生理和病理过程.     

氧诱导视网膜新生血管模型小鼠中ephrin A家族基因的表达

目的 观察ephrin A家族的基因是否参与氧诱导的小鼠视网膜新生血管(RNV)形成.方法 利用氧诱导新生小鼠C57BL/6J制备氧诱RNV模型,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCT)检测ephrin A1～A5在模型组小鼠视网膜和同龄正常小鼠(对照组)视网膜中的表达.结果 ephrin A1～A5mRNA均在正常视网膜发育的某一阶段或者发育的全程表达.在模型组小鼠视网膜中,ephrin A1 mRNA的表达量相对于对照组小鼠明显上调(t=3.19,P=0.019);ephrin A2 mRNA的表达量在15日龄的模型组小鼠中相对于对照组小鼠显著上调(t=3.71,P=0.033);ephrin A3～A5 mRNA在12、13日龄的模型组小鼠视网膜中相对于对照组小鼠表达下调或者缺失,而在15日龄的模型组小鼠视网膜相对于对照组小鼠视网膜显著上调(t=3.785,P=0.002).结论 ephrin A家族的基因参与视网膜的发育和视网膜病理性血管生成等重要的生理和病理过程.     

TERT基因siRNA抑制鼠视网膜新生血管形成的研究

目的 探讨小鼠端粒酶逆转录酶(TERT)小分子干扰RNA(siRNA)对小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用,及其用于视网膜新生血管疾病治疗的可行性.方法构建TERT siRNA重组质粒pSIREN-mTERT-1和阴性对照质粒pStREN-mTERT-N.选择7 d龄C57BL/6J小鼠80只随机分为基因治疗组、阴性质粒组、高氧对照组及正常对照组,每组20只.前3组置于75%±2%高氧环境中生活5 d,然后回到正常氧环境中.于第12天出氧舱时,分别向基因治疗组、阴性质粒组两组小鼠玻璃体腔内注射上述两种质粒.正常对照组小鼠正常氧环境中饲养.高氧对照组和正常对照组不予玻璃体腔注射.第19天用2%Evens蓝灌注进行视网膜铺片,观察各组小鼠视网膜血管形态变化;反转录-PCR及Real-time PCR检测各组间TERT mRNA和新生血管相关基因的表达变化;组织切片观察并计数突破内界膜的血管内皮细胞数量.对数据采用单因素方差分析进行统计学比较.结果 荧光造影视网膜铺片显示,基因治疗组整个视网膜血管分布网基本正常,走形较自然,基本接近正常对照组,未见明显的新生血管丛及大片荧光渗漏,只在视网膜中周部及周边部见少许荧光渗漏,但较阴性质粒组及高氧对照组明显减少.阴性质粒组及高氧对照组视网膜血管紊乱,中周部血管迂曲,伴大片荧光渗漏.RT-PCR及实时PCR显示基因治疗组小鼠视网膜TERT mRNA表达为0.56±0.32,明显少于阴性质粒组及高氧对照组(P＜0.05).组织切片HE染色观察,基因治疗组仅见1处新生血管芽,偶见突出内界膜的细胞核;阴性质粒组及高氧对照组见散在突出内界膜伸向玻璃体腔的血管芽,内界膜下出现明显的血管内皮细胞增生;光镜下观察突破内界膜新牛血管内皮细胞计数,基因治疗组(14.62±1.70)较阴性质粒组(32.38±7.50)及高氧对照组明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TERT特异的siRNA能有效地抑视网膜新生血管动物模鼎视网膜中视网膜新生血管的形成,可能会成为一种治疗视网膜新生血管疾病的新方法.     

血管能抑素基因转移抑制视网膜新生血管的实验研究

目的 观察血管能抑素真核表达质粒(pCMV-HA)对小鼠视网膜新生血管RNV形成的抑制作用.方法 将鼠龄为7 d的56只C57BL/6J新生小鼠随机分为正常对照组、氧诱导视网膜病变(OIR)模型组、治疗组和空载体组,每组14只.后3组小鼠置于(75±2)%浓度的氧环境中饲养5 d后,回到正常空气环境中建立氧诱导的RNV动物模型.治疗组小鼠在出生后第12天出氧箱时行玻璃体腔注射血管能抑素pCMV-HA,空载体组注射等量空质粒.出生后第17天行伊凡思蓝(Evans blue)灌注血管造影视网膜铺片观察血管变化.石蜡切片行苏木精-伊红染色,光学显微镜下观察并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数.结果 视网膜铺片结果显示,治疗组较OIR模型组和空载体组视网膜血管分布均匀,新生血管和无灌注区显著减少.治疗组突破内界膜的内皮细胞核数与OIR模型组及空载体组比较,差异有统计学意义(F=39.006,P<0.001).结论 血管能抑素pCMV-HA对氧诱导的RNV有显著的抑制作用.     

鼠视网膜新生血管发生过程中Twist基因的表达

目的 探讨视网膜新生血管发生过程中Twist基因的表达情况.方法 对照实验研究.将40只新生C57/BL小鼠分为两组:(1)对照组,正常空气环境中饲养;(2)高氧组,在高氧环境中制作小鼠缺氧性视网膜新生血管动物模型.将出生第7天的小鼠放人氧箱,在75%浓度的高氧环境中饲养5 d后,取出氧箱.待出氧箱第12天和第17天(视网膜新生血管发生高峰时间)分别处死小鼠,制作视网膜铺片和切片,观察小鼠视网膜新生血管发生情况.应用免疫组织化学染色检测小鼠视网膜血管内皮细胞(VE)-钙黏蛋白、波形蛋白及Twist基因表达变化情况;提取全视网膜RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测VE-钙黏蛋白、波形蛋白及Twist基因表达变化情况.应用SPSS 11.5统计学软件进行数据处理,对高氧组与对照组小鼠出生后不同时间的VE-钙黏蛋白、波形蛋白、Twist基因表达的灰度值比较,采用两因素析因设计的方差分析,以P<0.05作为差异有统计学意义.结果 免疫组织化学检测结果显示,出生后第17天的小鼠,高氧组VE-钙黏蛋白表达的灰度值(65.19±8.39)与对照组(75.36±7.04)相比明显减少(F=8.616,P=0.009),波形蛋白表达的灰度值(95.09±14.13)与对照组(82.14±6.32)相比明显升高(F=6.999,P=0.016),Twist基因表达的灰度值(119.48±7.90)与对照组(93.30±6.37)相比亦明显升高(F=66.557,P=0.000).RT-PCR检测结果显示,不同处理组间波形蛋白、Twist基因表达的灰度值与检查时间存在交互作用(F=5.508,P=0.032;F=17.760,P=0.001).结论 在小鼠视网膜新生血管形成过程中,细胞转型调控的Twist基因发挥着重要作用,其作用机制可能是通过下调血管内皮细胞间的紧密连接蛋白,促进内皮细胞转型实现.     

Ras相关的C3肉毒毒素底物1的小发夹RNA干扰活性氧-核因子κB通路抑制小鼠视网膜新生血管生成

目的 观察Ras相关的C3肉毒毒素底物1的小发夹RNA(Racl-shRNA)在小鼠氧致视网膜病变中对视网膜新生血管(RNV)生成的抑制作用及对活性氧(ROS)-核因子κB(NF-κB)通路的影响.方法 将108只7日龄C57BL/6J小鼠随机平均分为3组.其中2组Smith法建立氧致视网膜病变模型;11日龄时玻璃体腔注射Racl-shRNA表达质粒或无意义质粒,分别作为基因干预组和空白对照组.第3组于正常氧环境中饲养,11日龄时玻璃体腔注射Racl-shRNA表达质粒作为空白干预组.15、17日龄时行荧光视网膜铺片,观察视网膜血管发育及新生血管情况.17日龄时计数眼球切片中突破内界膜的血管内皮细胞核数.17日龄时进行原位杂交法和荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应法检测小鼠视网膜Racl和NF-κB p65亚单位的mRNA含量;免疫组织化学和蛋白质免疫印记检测Racl和NF-κB p65的蛋白表达.结果 基因干预组视网膜Racl的mRNA水平较空白对照组明显下调(t=4.500,P=0.001).与空白对照组比较,基因干预组视网膜铺片中无灌注区、荧光渗漏和新生血管丛明显减轻,突破内界膜的血管内皮细胞核显著减少(t=6.521,P<0.001);视网膜NF-κB p65的核易位水平明显下降(t=16.008,P<0.001),同时mRNA表达亦明显下调(t=3.354,P=0.006),与Racl mRNA表达呈正相关(r=0.580,P=0.012).结论 小鼠玻璃体腔注射脂质体包裹的Racl-shRNA表达质粒可有效沉默视网膜Racl基因表达,阻断ROSNF-κB通路而参与抑制相对缺氧状态下RNV生成.     

氧诱导小鼠视网膜新生血管发生中乙酰肝素酶及串珠素的表达

目的研究小鼠视网膜新生血管发生过程中乙酰肝素酶（HPA）及其作用底物串珠素在视网膜中的表达。方法将65只新生幼鼠于生后7d在体积分数（75±2）％高氧环境中饲养5d后,再置于相对低氧环境中诱导产生视网膜新生血管为高氧诱导组。另外65只新生幼鼠在正常环境中饲养作为正常对照组。分别在小鼠生后第12、13、17、21、30天通过荧光素眼底血管造影（FFA）和视网膜病理切片观察视网膜新生血管的形态变化。通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）分别检测不同时间点视网膜组织中HPA和串珠素在mRNA水平的变化,Westernblot检测不同时间点视网膜组织中HPA在蛋白水平的表达变化。结果高氧诱导组与正常对照组的HPAmRNA表达水平差异有统计学意义（Fgroup=16．303,P=0．000）,各时间点的HPAmRNA表达水平差异有统计学意义（Ftime=18．614,P=0．000）,生后第12、13、17、21天相应时间点2组小鼠视网膜HPAmRNA的表达水平差异均有统计学意义（P=0．001,P=0．000,P：0．000,P=0．001）。高氧诱导组与正常对照组HPA蛋白表达水平差异有统计学意义（Fgroup=458．134,P=0．000）,各时间点的HPA蛋白表达水平差异有统计学意义（F time=78．466,P=0．000）。高氧诱导组与正常对照组的串珠素mRNA表达水平差异有统计学意义（Fgroup=7．351,P=0．013）,各时间点的串珠素mRNA表达水平差异有统计学意义（Ftime=9．098,P=0．000）。生后第13、17、21天的高氧诱导组小鼠视网膜串珠素mRNA的表达水平与正常对照组相应时间点,差异均有统计学意义（P=0．048,P=0．000,P=0．003）。伴随着视网膜新生血管的增多和消退,HPA在基因和蛋白水平及串珠素在基因水平的表达均呈先升高后降低的趋势。结论HPA及其作用底物可能是促进视网膜新生血管生长的重要因素。     

小鼠氧诱导视网膜新生血管形成中促红细胞生成素的变化

目的:观察C57BL/6小鼠氧诱导视网膜新生血管病变模型(oxygen-induced retinopathy,OIR)眼内促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)含量的变化。方法:新生C57BL/6小鼠20只,随机分为实验组(n=10)和对照组(n=10)。实验组小鼠于出生后7d(P7)与母鼠共置于密闭的氧箱,含氧75±5mL/L,共培养5d(P5)后回到正常氧环境,含氧20±1mL/L,建立OIR模型。对照组小鼠不进入氧箱,与母鼠一同饲养于正常氧环境。于P17处死各组小鼠,摘取右眼眼球制作组织切片,HE染色后行病理组织学检查,计数突破内界膜视网膜新生血管(retinal neovascularization,RNV)内皮细胞核数。采用放射免疫法测定实验组和对照组小鼠左眼视网膜组织EPO含量。结果:实验组小鼠视网膜突破内界膜RNV内皮细胞核计数为80.0±6.2个,而对照组仅为1.0±0.9个,两者差异有统计学意义(P<0.01)。实验组视网膜EPO含量为80.8±20.7U/L,对照组为14.4±6.8U/L,两者差异有统计学意义(P<0.01),且视网膜组织EPO表达与RNV增生程度呈明显正相关(r=0.58,P<0.01)。结论:小鼠视网膜新生血管形成与眼球局部EPO上调有关。     

Treatment of retinal detachment of the course of retinopathy of prematurity

Cryo- and laser therapy of stage 3 have reduced, but not eliminated the occurrence of retinal detachment in stages 4a, 4b and 5 of ROP. In this disease the treatment of these stages is still the greatest challenge to the ophthalmologist. Therefore, the aim of this paper is to present our up-to-date possibilities of treatment of different kinds of retinal detachments in ROP, including segmental scleral buckling, encircling scleral buckling, scleral resection, vitrectomy and its modifications in ROP. Guidelines of surgery of retinal detachment in active stage 4 and 5 of retinopathy of prematurity have been described.     

Analysis of some of the possible neonatal risk factors of development of retinopathy of prematurity

PURPOSE: The aim of the study was to evaluate some of the possible risk factors for retinopathy of prematurity (ROP) treated with laser photocoagulation or cryocoagulation. MATERIAL AND METHODS: The study comprised 71 preterm infants with ROP needing treatment and 118 prematures without ROP or with ROP requiring no treatment, as a control group. All infants were born with gestational age < or = 32 weeks and birth weight < or = 1500g. The perinatal variables, including some of clinical data, the length of mechanical ventilation as well as continous positive airway pressure (CPAP), duration of total parenteral nutrition and some of laboratory data were analyzed, to evaluate their correlation with the development of ROP. RESULTS: Gestational age before 28 weeks (OR = 5.11), episodes of convulsiones (OR = 2.15), mechanical ventilation for more than 20 days (OR = 5.86) and > 30 days (OR = 7.47), CPAP for more than 5 days (OR = 4.15) and > 10 days (OR = 2.84), total parenteral nutrition for more than 10 days (OR = 7.84) and > 20 days (OR = 9.02) and elevated peak of alanine aminotransferase (AIAT) levels (OR = 3.17) were significant risk factors for ROP requiring treatment. CONCLUSIONS: The opthalmic examination for retinopathy of prematurity requiring laser photocoagulation or cryocoagulation should be obligatory for prematures born < or = 32 weeks of gestational age, with birth weight < or = 1500 g.The frequency of the consecutive ophthalmic examinations depends on the severity of prematurity and on the presence and intensification of the risk factors for ROP.     

角膜曲率的分析

目的：探讨我国人角膜曲率半径的正常值及不同性别、不同年龄的角膜曲率半径差异。方法：对10998只眼的角膜曲率进行检测，并按男、女10岁一组进行统计分析。结果：（1）K1为7.65mm,K2为7.71mm，平均K值为7.67mm。较眼科学正常值K:7.77mm短0.1mm。（2）K的平均值男性较女性的长0.1155mm。且女性各年龄段角膜曲率半径均男性的有不同程度的减短。（3）男女均随年龄的增长，角膜曲率半径大致呈递减趋势，即：角膜曲率半径与年龄成反比关系。（４）男女K1,K2之比，均随年龄增长而增长，即K1逐渐增长而增长，即　K1值逐渐增长，K2逐渐减短。结论：本文测定的角膜曲率较眼科文献中的提供的正常值短0.1mm，并且存在着年龄、性别上的差异。     

亟待新型早产儿视网膜病变动物模型的问世

早产儿视网膜病变（ROP）病因和发病机制尚不完全清楚,制约了其有效防治和相关研究的深入开展。尽管氧诱导视网膜病变动物模型为探索ROP复杂的病因和发病机制发挥了重要作用,但特异性较差,与人类ROP临床本质存在一定差异。因此,有必要对现有动物模型进行改良或建立新动物模型。通过更新观念、在多学科交叉中寻求突破,融合更多ROP危险因素,并结合新兴的转基因技术以及完善模型评价系统,建立科学的实验研究平台,为更好地开展ROP防治研究奠定基础。